专利名称：一种萝卜种质抗黑斑病的快速鉴定方法
技术领域：
本发明为园艺作物抗病育种领域，具体涉及一种萝卜种质抗黑斑病的快速鉴定方法。
背景技术：
萝卜黑斑病(Garden radish Alternaria leaf spot)是萝卜种植过程中容易出现的病害，它是由萝卜链格孢(Alternaria Groves et Skoloko)引起的，芸薹链格？包(Alternaria brassicae (Berkveley) Saccvardo)禾口甘蓝链格抱(Alternaria brassicivcola(Schweinitz)ffiltshire)也能引起该病害的发生，是危害十字花科蔬菜生产的世界性真菌病害。黑斑病通过种子传带形成异地扩散和蔓延，危害叶片和整株植物，全生育过程发病严重影响产量和品质，成为我国甚至世界蔬菜生产的主要病害之一。萝卜黑斑病在许多国家都有发生，尤其是在美国、加拿大、芬兰和中国发生较重。20世纪40年代， 它在中国大陆已分布较普遍，对萝卜的生产影响不大，但随后该病的发生日益严重。发病植株的叶片、茎等染病部位呈现褪绿和黑色坏死斑，被侵染的种子发芽率降低，产量和质量下降。从上世纪80年代到现在，黑斑病的流行给我国萝卜中植生产造成了巨大损失，所以近年来控制萝卜黑斑病甚至十字花科黑斑病仍然是生产的重要问题。目前，对于黑斑病的研究同黑腐病类似，也是主要从微生物学角度来进行的。国内外研究者们先后通过形态学、酯同工酶分析和分子生物学研究为基础进行分类和鉴定。传统的分类主要是依据链格孢的分生孢子和喙的形态。自1962年科研人员将可溶性蛋白凝胶电泳分析引入脉孢菌的研究以来，真菌菌体的可溶性蛋白图谱和酯酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、乳酸脱氢酶等多种酶系及其同工酶电泳图谱分析作为化学分类的重要手段之一， 广泛应用于真菌的分类研究，在病原真菌种级分类上已广泛接受，它在黑斑病的研究上也取得了极大的进展。随着分子生物学方法的应用和对萝卜病菌的DNA序列的研究，PCR、 RFLP和RAPD等技术已开始在萝卜种子传带黑斑病菌检测中应用，并逐步实现种子健康检测的规范性、科学性和高通量的统一。从抗病育种工作的角度出发，如果能够从萝卜主产区分离出病原菌，建立鉴别寄主并鉴别优势生理小种，筛选抗病品种是有效而又迫切的防控蔬菜病害的主要方法之一， 将大大提高我国萝卜产区种植的经济效益。在抗病育种过程中，苗期在室内进行则环境条件较易控制，鉴定周期短、速度快，建立萝卜苗期室内抗黑斑病抗病性鉴定方法有利于抗病育种工作的开展，填补国内萝卜黑斑病抗病育种研究空白。
发明内容
本发明提供一种萝卜种质抗黑斑病的快速鉴定方法，与大田成株期接种相比，避免了气候条件不适宜、环境中病虫害等因素的影响，苗期在室内进行抗病性筛选则条件较易控制，鉴定周期短、速度快，能节省大量人力物力；确定了适宜的黑斑病悬浮液浓度、萝卜抗病性筛选苗龄。
本发明采用的技术方案是—种萝卜种质抗黑斑病的快速鉴定方法，其特征在于按以下步骤依次组成(1)供试材料准备供试的黑斑病菌种为萝卜链格孢(Alternaria Groves et Skoloko)，菌种接种前用PDA培养基进行产孢培养备用；供试的萝卜品种为春白萝卜、秋白萝卜、耐热红皮和耐热白皮萝卜四种类型萝卜品种；将供试的种子播种在装有灭菌基质的花盆(8cm*8cm)内，出苗后每盆留1-3株。(2)接种直接采用孢子悬浮液喷雾接种，接种后将供试植株放入塑料盒内，用保鲜膜保湿 48h。每供试材料设置3次重复，每次重复30株苗，以清水为对照，设置1.0X ΙΟ3、1.0X 104、 1.0X105、l. OX Kfpfu/mL四种接种浓度的孢子悬浮液和3-4、5_6、7_8叶期三种苗龄，在 20-25°C条件下诱导发病，置于光照培养室中，接种后第7d、第IOd与第14d调查病情指数；(3)病情指数分级病情指数分级以叶片为单位，按0-9级标准进行发病程度调查。病情分级标准0 级无症；1级接种叶生褐色小点，无退绿斑；3级接种叶生3mm以下的退绿斑，无霉层；5 级接种叶生3mm以上的退绿斑，有极少霉层，病斑不连成片；7级接种叶生5mm以上的退绿斑，有较多的霉层，病斑连成片以下；9级接种叶病斑连成片，大面积枯死，霉层明显。所述的光照培养室内温度优化为20_25°C ；所述的黑斑病孢子悬浮液浓度优选为 1.0X105pfu/mL ；所述的黑斑病孢子悬浮液喷雾接种植株为5 6叶期幼苗，10天后调查病情。本发明取得的有益效果1、按步骤进行鉴定的方法与大田成株期接种相比，避免了气候条件不适宜、环境中病虫害等因素的影响，苗期在室内进行抗病性筛选则条件较易控制，鉴定周期短、速度快，能节省大量人力物力。2、确定了适宜的黑斑病悬浮液浓度，该方法确定1. OX 105pfu/mL的黑斑病孢子悬浮液最为适宜。3、确定了适宜的萝卜抗病性筛选苗龄，该方法确定5 6叶期进行抗病性筛选最为适宜。4、萝卜抗黑斑病室内抗病性鉴定方法病级划分没有可以参考的标准，首次制定了萝卜抗黑斑病苗期室内喷雾法接种病情指数分级标准。
图1黑斑病的发病程度与接种物浓度关系示意2不同接种苗龄对抗病性的影响示意3不同接种菌株对抗病性的影响示意图下面对本发明作一详细说明
具体实施例方式下面对本发明作一详细说明
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实施例1材料与方法1. 1供试材料供试的黑斑病菌种黑斑病菌种为萝卜链格孢(Alternaria Groves et Skoloko) (本领域技术人员可以通过常规分离、选筛得到)，菌种接种前用PDA培养基进行产孢培养供试的萝卜品种为为春白萝卜、秋白萝卜、耐热红皮和耐热白皮萝卜四种类型萝卜品种(均为市售产品，公众可轻易获得)。将供试的种子播种在装有灭菌基质的花盆(8cm*8cm)内，出苗后每盆留1_3株。1.2接种方法接种方法采用点滴孢子悬浮液法有以下缺点一株株手工点滴接种，费工、效率低；由于是根据单斑进行鉴定，因而鉴定结果不够准确；水珠容易滚落，不能保证较高的发病率。采用喷雾接种法接种的优点是由于成片喷雾接种，因而快速、省工、简便易行；根据多斑进行鉴定，提高了鉴定结果的可靠性；喷雾均勻，可达到很高的发病率。本研究未进行接种方法鉴定，直接采用孢子悬浮液喷雾接种，接种后将供试植株放入塑料盒内，用保鲜膜保湿48h。每供试材料设置3次重复，每次重复30株苗，以清水为对照，设置1. 0 X 103、 1. 0X104、1. 0X105、1. 0XlOfiPfuAiL四种接种浓度的孢子悬浮液和3-4、5-6、7-8叶期三种苗龄，在25-30°C条件下诱导发病，置于光照培养室中，接种后第7d、第IOd与第14d调查病情指数。1. 3病情指数分级病情指数分级以叶片为单位，按0-9级标准进行发病程度调查。病情分级标准0 级无症1级接种叶生褐色小点，无退绿斑；3级接种叶生3mm以下的退绿斑，无霉层；5 级接种叶生3mm以上的退绿斑，有极少霉层，病斑不连成片；7级接种叶生5mm以上的退绿斑，有较多的霉层，病斑连成片以下；9级接种叶病斑连成片，大面积枯死，霉层明显。1. 4数据处理所有数据均采用SPSSl 1. 5 (LSD，ρ < 0. 05)进行统计分析处理，采用Microsoft Office Excel 2003 进行制图。2结果与分析2. 1不同接种浓度对抗病性的影响从图1可以看出，黑斑病的发病程度与接种物浓度呈正相关。从第10天表现典型症状的病情指数调查结果来看，以1.0Xl(fpfu/mL、l.OXloVfu/mL接种发病慢，发病程度也较低，四种材料间发病差异不显著；以1. OX 105pfu/mL、l. OX Kfpfu/mL两个浓度接种时，四种材料间发病差异一致，浓度大、发病快。2. 2不同接种苗龄对抗病性的影响如图2所示，3 4叶期苗龄时，四种材料发病程度都比较重，病情指数值高，随着苗龄的增加，发病程度呈现减轻趋势，说明随着苗龄的增加其抗病力也增强。5 6叶期、 7 8叶期苗龄四种材料间发病差异一致，但从发病情况来看，苗龄大接种后发病较慢。2. 3不同接种菌株对抗病性的影响如图3所示，三个不同采样地点的黑斑病菌株接种后，四种材料对不同菌株的抗
5性均不一致，秋白萝卜对HBl、WHHBl、JZHBl的抗性差异显著。3、结论研究结果表明，在光照培养室内05 30°C )，选择浓度为1. OX l(^pfu/mL的黑斑病孢子悬浮液喷雾接种于萝卜5 6叶期幼苗，保湿48h，10天后调查病情，可准确评价萝卜品种对黑斑病的抗性。研究当中采用三个不同地点得到的萝卜黑斑病菌株对4种材料的抗病鉴定结果也表明，针对不同的菌株材料的抗性差异大。该结论为萝卜抗黑斑病抗病育种工作打下了基础。
权利要求
1.一种萝卜种质抗黑斑病的快速鉴定方法，其特征在于按以下步骤依次组成(1)供试材料准备供试的黑斑病菌种为萝卜链格孢(Alternaria Groves et Skoloko)，菌种接种前用 PDA培养基进行产孢培养备用；供试的萝卜品种为春白萝卜、秋白萝卜、耐热红皮和耐热白皮萝卜四种类型萝卜品种；将供试的种子播种在装有灭菌基质的花盆(8cm*8cm)内，出苗后每盆留1-3株。(2)接种直接采用孢子悬浮液喷雾接种，接种后将供试植株放入塑料盒内，用保鲜膜保湿48h。 每供试材料设置3次重复，每次重复30株苗，以清水为对照，设置1. OX 103、1. OX 104、 1.0X105U.0X106pfu/mL四种接种浓度的孢子悬浮液和3-4、5_6、7_8叶期三种苗龄，在约 20-25°C条件下诱导发病，置于光照培养室中，接种后第7d、第IOd与第14d调查病情指数；(3)病情指数分级病情指数分级以叶片为单位，按0-9级标准进行发病程度调查。病情分级标准0级无症；1级接种叶生褐色小点，无退绿斑；3级接种叶生3mm以下的退绿斑，无霉层；5级接种叶生3mm以上的退绿斑，有极少霉层，病斑不连成片；7级接种叶生5mm以上的退绿斑， 有较多的霉层，病斑连成片以下；9级接种叶病斑连成片，大面积枯死，霉层明显。
2.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于所述的光照培养室内温度优化为大约 20- °C。
3.如权利要求1或2所述的鉴定方法，其特征在于所述的黑斑病孢子悬浮液浓度优选为 1. 0X105pfu/mL。
4.如权利要求1或2所述的鉴定方法，其特征在于所述的黑斑病孢子悬浮液喷雾接种植株为大约5 6叶期幼苗，大概10天后调查病情。
全文摘要
本发明提供一种萝卜种质抗黑斑病的快速鉴定方法，其特征在于按以下步骤依次组成(1)供试材料准备、(2)接种和(3)病情指数分级，确定了适宜的黑斑病悬浮液浓度、萝卜抗病性筛选苗龄，与大田成株期接种相比，避免了气候条件不适宜、环境中病虫害等因素的影响，苗期在室内进行抗病性筛选则条件较易控制，鉴定周期短、速度快，能节省大量人力物力。
文档编号A01G7/00GK102293107SQ20111006543
公开日2011年12月28日 申请日期2011年3月18日 优先权日2011年3月18日
发明者丁自立, 何云启, 崔磊, 张兴中, 梅时勇, 梅雪飞, 王晴芳, 甘彩霞, 高翔, 黄来春 申请人:湖北省农业科学院经济作物研究所