专利名称：一种牡丹分生结节的诱导方法
技术领域：
本发明涉及牡丹组织培养方法，特别是涉及一种牡丹分生结节的诱导方法。
背景技术：
牡丹国色天香，是深受人们喜爱的传统名花，也是园林绿化和盆花、切花等的理想材料，在园林花卉中具有独特的优势和巨大的市场需求。牡丹繁殖困难，长期以嫁接繁殖为主，至今难以实现优质种苗的规模化生产；牡丹育种周期长，从播种到开花稳定通常需要 10年以上(Cheng，2007)。组织培养作为现代生物技术领域发展最为迅速与成熟的技术之一，大大提高种苗繁殖系数和质量，并为转基因定向育种提供平台，是解决牡丹繁殖和育种难题的有效途径，但是经过几十年的大量研究，至今仍然没有建立成熟的技术体系。牡丹组织培养研究最多的是芽培养(shoot culture)，即通过将牡丹的芽接入培养基，诱导腋芽原基萌发的方式实现芽的增殖，然后将得到的芽进行生根培养，最终得到完整的植株。对牡丹这种难以生根的植物来说，这一繁殖方式的关键是生根(李萍和成仿云， 2007 ；Buchheim and Meyer，199 。目前，牡丹芽的离体增殖和生根研究已经取得一些进展，并得到了开花的植株(Beruto and Curir,2007)o芽培养的繁殖方式能较好地保持新植株与母体植株的一致性，是很多植物中广泛采用的繁殖方法(George et al. 2008)。但这种方法的整个过程通常在固体培养基上进行，每次增殖和继代培养都需要繁重的手工劳动，限制了繁殖的规模和效率；同时腋芽增殖的次数很有限，多次增殖后会出现生活力下降的现象。因此，芽培养的方式虽然理论上比嫁接和分株效率高很多，但由于存在上述的种种局限，仍然不是一种理想的繁殖方式。此外，牡丹植株再生体系的研究已经有一些报道，主要是以种胚、花粉、花药为外植体的直接体细胞胚发生(Buchheim和Meyer, 1992 ；何桂梅，2006 ；周秀梅等，2008)和以叶片、叶柄、茎段、根、花瓣为外植体的间接器官发生(李玉龙等，1984;BUChheim and Meyer, 1992 ；Beruto et al.，2004)两类。这两类研究目前都取得了不同程度的进展，但普遍存在胚或芽的诱导率和生活力低，畸形率高的问题，再加上再生途径本身的问题，难以达到实际应用的程度。目前的牡丹植株再生体系主要存在以下问题(1)再生体系选择的外植体不合适用于牡丹品种繁殖。种胚是有性生殖的产物，由于牡丹品种在基因型上多是高度杂合的，有性繁殖不能保持子代的一致性和稳定性。所以，作为外植体的种胚与母体植株在遗传上存在一定差异。而基因型往往是决定诱导条件的关键因素之一，所以，以种胚作为外植体一方面为诱导条件的选择设置了障碍，难以获得高的诱导率；另一方面即使能够建立起稳定的再生体系，获得的再生植株与母体在基因型上也不一致，因此在良种繁殖和遗传改良中的应用前景也很有限。(2)间接的器官发生需要经过愈伤组织的阶段，增殖系数提高通常是通过愈伤组织的增殖来实现的。由于愈伤组织经过长期无序增殖容易发生变异，再生植株常常会与母体植株的表现不一致；同时愈伤组织的分化能力也往往不能长期保持，所以，间接的器官发生在作为一种克隆繁殖方法时存在致命的问题。分生结节(meristematic nodules)是一种致密的球形细胞团，具有稳定的内部组织结构，至少包含三种类型的细胞(分生细胞、富含质体的薄壁细胞和维管分子)和两层组织(外部的表皮和内部的皮层、维管组织)(McCown et al.，1988)。分生结节既不同于一般的不规则的愈伤组织，又不同于任何一种植物器官，它具有一定的外部特征和内部的组织结构，处于从完全未分化到开始分化之间的一种过渡状态，是一种组织化的愈伤组织(organized callus) (George et al. 2008)。分生结节的生长发育经历发生、生长、增殖和分化四种状态。作为一种具有分化潜力的结构，分生结节再生植株通常是经过器官发生的途径，即结节先分化出芽，又在芽上生出根进而发育成完整的植株。除了直接再生植物器官外，分生结节还可以直接再生体细胞胚(Ziv et al. ,1994 ；Lilien-Kipnis et al. , 1994)；或在培养过程中发生脱分化，产生胚性愈伤组织进而间接再生体细胞胚 (Chaudhuri et al. ,2004 ；Sane et al. ,2006 ；Cameron 2010)；或者在器官发生的同时伴随着体细胞胚发生的现象(McCown et al.，1988 ；Trindade and Pais，2003)。据不完全统计，目前已有 Linum(Salaj et al. 2005),Populus (McCown et al. 1988),Humulus (Batista et al. 2000), Vriesea(Alves et al. 2006), Eucalyptus(Warrag et al. 1991, Trindade and Pais 2003)， Acacia(Xie and Hong 2001)， Sclerocarya(Moyo et al.2009), Ananas(Teng 1997), Charybdis(Kongbangkerd 2005), Garcinia(Te-chato andLim 2000), Cichorium(Pieron et al. 1993), Pinus(Aitken-Christie and Singh 1988), Lilium(Godo et al. 1998)等十几个属的植物通过分生结节培养实现了植株再生。可见，分生结节是植物中普遍存在的一种介于直接发生与间接发生之间的离体植株再生途径。但目前，还没有关于牡丹分生结节的相关报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种牡丹分生结节的诱导方法。为了实现本发明的目的，本发明提供一种牡丹分生结节的诱导方法，包括如下步骤1)将表面灭菌的叶柄薄层接种于前诱导培养基上进行前诱导；2)将步骤1)诱导的愈伤组织转移到诱导培养基中诱导分生结节，其中，所述的前诱导培养基为以SH为基本培养基Gchenk和Hildebrandt，1972)， 添加0. 1 2mg/L的2，4-D和30g/L的蔗糖；所述的诱导培养基为以SH为基本培养基，添加 0. 5mg/L 的 2，4-D、4mg/L 的 6-BA 和 30g/L 的蔗糖。在本发明的一个实施方案中，所述的牡丹分生结节的诱导方法，还包括将步骤2) 获得的分生结节接种到所述的诱导培养基中进行继代增殖。其中，所述的继代增殖为在固体培养基中培养或在液体培养基中进行振荡培养。本发明中，可选用本领域公知的方法对叶柄进行表面灭菌，优选的，包括如下步骤用洗洁精将外植体表面洗净，自来水冲洗1 2小时，用70%乙醇溶液浸洗30s lmin，再用1/5-1/10体积的84消毒液浸洗12-15min，最后用无菌水至少清洗3次。本发明的一个实施方案中，所述的叶柄为0. 4 0. 6mm的叶柄薄层，优选为0. 5mm 的叶柄薄层。在本发明的一个优选的实施方案中，所述的叶柄优选为萌芽后生长30 55d的复叶的总叶柄，最优选为生长^d的总叶柄。在本发明中，所述的步骤1)中的前诱导时间优选为30 60d，最优选为45d。本发明的一个实施方案中，所述的前诱导培养基优选为以SH为基本培养基，添加 0. lmg/L 的 2,4-D 和 30g/L 的蔗糖。本发明旨在通过采自牡丹成年植株营养体的外植体，诱导牡丹分生结节发生并实现其增殖培养，建立牡丹营养体离体培养和增殖的新体系——牡丹分生结节培养。本发明采用来自牡丹成年植株营养体的外植体——叶柄，能够真实继承母体植株的遗传特性。本发明采用SH为基本培养基和叶柄薄层培养的方法，愈伤组织诱导率高达 100%，并且首次诱导出牡丹分生结节，诱导率最高达到85. 7%。在固体和液体培养基上分别实现了牡丹分生结节的增殖，提供了一种牡丹组织离体增殖的新体系。分生结节特有的较强的分化能力和次生代谢活动，将为牡丹植株再生和药用有效成分生产提供一种潜在的有效手段。
图1所示为前诱导的2，4_D浓度对分生结节诱导率的影响。图2所示为前诱导时间对分生结节诱导率的影响。图3所示为外植体取材时间对分生结节诱导率的影响。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若无特别说明，涉及的培养基还包括30g/L的蔗糖，若为固体培养基，则还包括6. Og/L的琼脂，培养基的pH值为 5. 8 6. 0。本发明中涉及的任何药品，均可以市售获得。实施例1紫斑牡丹‘高原圣火’分生结节的诱导萌芽后30、40、55天，分别取大田栽培的紫斑牡丹‘高原圣火’的叶柄，用洗洁精将叶柄外植体表面洗净，自来水冲洗约1小时，转入超净工作台中操作。先用70%乙醇溶液浸洗1分钟，接着用1/5(体积比)的84消毒液浸洗15分钟，最后用无菌水清洗5次。将经过表面灭菌的叶柄切成0. 5mm的薄层，平贴至含有2，4_D0. l-2mg · L—1的SH 固体培养基上进行前诱导，培养基配方如表1所示。外植体培养30、45、60天后分别将愈伤组织切下转移到含有2，4-D 0. 5mg · Γ1和 BA 4mg · L—1的SH固体培养基上，每个处理接种21块愈伤组织，重复3次。继续培养60天后统计产生分生结节的愈伤组织数量。通过对外植体取材时间(3水平)、前诱导的2，4_D浓度(12水平)、前诱导培养时间(3水平)等3个因素进行全部实施的交叉实验，以确定各个因素对分生结节产生的影响。结果如表1所示。结果如表1所示，结果表明前诱导2，4_D浓度为0. lmg/L，满足了这个条件后，在取材时间为萌芽后30d、40d、55d，前诱导时间30d、45d、60d，这些处理上差不多都可以诱导出分生结节。当叶柄取材时间为萌芽后55d，前诱导时间为45d时，前诱导2，4-D浓度为 0. 2-2mg/L时，也能高效诱导出分生结节。表1不同处理对牡丹分生结节诱导的影响
权利要求
1.一种牡丹分生结节的诱导方法，包括如下步骤1)将表面灭菌的叶柄薄层接种于前诱导培养基上进行前诱导；2)将步骤1)诱导的愈伤组织转移到诱导培养基中诱导分生结节，其中，所述的前诱导培养基为以SH为基本培养基，添加0. 1 2mg/L的2，4-D和20 40g/L的蔗糖；所述的诱导培养基为以SH为基本培养基，添加0. 5mg/L的2，4_D、^ig/L的 6-BA和20 40g/L的蔗糖。
2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，还包括将步骤幻获得的分生结节接种到所述的诱导培养基中进行继代增殖。
3.根据权利要求2所述的诱导方法，其特征在于，所述的继代增殖为在固体培养基中培养或在液体培养基中进行振荡培养。
4.根据权利要求1 3任一项所述的诱导方法，其特征在于，所述的叶柄的表面灭菌方法包括如下步骤用洗洁精将外植体表面洗净，自来水冲洗1 2小时，用70%乙醇溶液浸洗30s lmin，再用1/5-1/10体积的84消毒液浸洗12-15min，最后用无菌水至少清洗3次。
5.根据权利要求1 3任一项所述的诱导方法，其特征在于，所述的叶柄薄层厚度为 0. 4 ~ 0. 6mm。
6.根据权利要求5所述的诱导方法，其特征在于，所述的叶柄薄层取自萌芽后生长 30 55d的复叶的总叶柄。
7.根据权利要求6所述的诱导方法，其特征在于，所述的叶柄薄层取自萌芽后生长55d 的复叶的总叶柄。
8.根据权利要求1 3任一项所述的诱导方法，其特征在于，所述的步骤1)的前诱导时间为30 60d。
9.根据权利要求8所述的诱导方法，其特征在于，所述的前诱导时间为45d。
10.根据权利要求1 3任一项所述的诱导方法，其特征在于，所述的前诱导培养基为以SH为基本培养基，添加0. lmg/L的2,4-D和30g/L的蔗糖。
全文摘要
本发明公开了一种牡丹分生结节的诱导方法，包括如下步骤1)将表面灭菌的叶柄接种于前诱导培养基上进行前诱导；2)将步骤1)诱导的愈伤组织转移到诱导培养基中诱导分生结节。本发明采用SH为基本培养基和叶柄薄层培养的方法，愈伤组织诱导率高达100％，并且首次诱导出牡丹分生结节，诱导率最高达到85.7％。在固体和液体培养基上分别实现了牡丹分生结节的增殖，提供了一种牡丹组织离体增殖的新体系。
文档编号A01H4/00GK102257956SQ20111012555
公开日2011年11月30日 申请日期2011年5月16日 优先权日2011年5月16日
发明者成仿云, 秦磊, 钟原 申请人:北京林业大学