专利名称：一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法
技术领域：
本发明涉及一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，适用于所有结种子的单子叶植物。
背景技术：
在诸多植物转基因方法中，农杆菌介导法最被普遍认可。它具有获得的转基因植株育性较高、外源基因多以单拷贝或低拷贝在受体中整合、可转移大片段DNA等优点。但是，目前所有以农杆菌介导为基础的转基因技术，大都离不开组织培养，故存在着受基因型限制、操作复杂、需借助抗性标记筛选、周期长、转化效率低、转化结果不稳定等突出问题。尤其以小麦、水稻、玉米等为代表的单子叶植物的转基因，受基因型限制问题十分突出，严重影响了技术的发展与应用。植物种子芽生长点是形成生殖器官和地上大部分营养体的原始细胞群。萌发后的单子叶植物种子芽生长点，具有很强的再生能力和发育补偿能力，去掉芽鞘和已分化的微型幼叶后，乃至受到较强的创伤后，仍能发育成正常植株，是实施转基因的理想受体。有报道和专利虽也注意到了用种子芽生长点做受体的优势，但对生长点的特点研究不够，未形成稳定、简易、高效的技术方案和技术体系，存在较多问题，如实施转化处理的时间较晚，导致对生长点的转化覆盖度低；对生长点不做任何创伤处理，或创伤方法不佳，造成的生物伤害过重，而转化所需要的创伤却不够，导致转化效果较差；抗性筛选策略使用不当，容易淘汰“被有效转化” 了的嵌合体；当代鉴定不合理，假阳性率高，等等。中国专利《一种改良的农杆菌介导小麦苗端转化方法》(专利号200410075773. 2)，所述主要步骤包括1)种子萌发后再4°C春化20_30d ；2)含有目的基因农杆菌的活化与重悬；3)对适宜大小的幼苗进行切割，暴露或损伤生长点部位；4)将含有目的基因的农杆菌菌液滴至幼苗切口处；5)幼苗恢复生长以及移至土中培养和抗生素筛选获得转基因植株及子代；6)转基因植株及子代的鉴定。所述适宜大小的幼苗是指2-4cm长的幼苗。上述专利的主要问题如下
(I)春化后进行转化，转化时机过晚，减少了转化的有效覆盖度，在创伤方面为农杆菌介导转化提供的条件不充分，且生物伤害重。(2)操作难度大、分寸不易把握、工作效率不高。有些报道，用各种针刺伤转化对象生长点，但所用针的直径普遍较粗AfricanJournal for Biotechnology, 2011，10 (5) : 740-750，有的甚至达 710 μ mJournal ofbioscience and bioengineering, 2005,100(4) : 391-397 ;2006，102 (3) : 162-170，对生长点造成的生物伤害重，而对转化所需的创伤则造成得不够。有些报道，则是用手术刀片划几下，造成的转化所需的创伤不充分，转化效果不佳；还有不少报道不做任何创伤处理，就用农杆菌进行转化，转化效果难以保障。总之，很多以生长点为转化对象的专利或报道，仍然未离开“离体培养”环节，而且使用的抗性筛选的策略不够科学。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种不依赖组织培养、不受基因型限制、不必须抗性筛选、转化效率高、转化效果稳定、操作简易方便、实用性强、易于规模化、耗费成本低的充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法。本发明采用如下技术方案
一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于
(1)受体及侵染液的准备
挑选拟转化植物品种的饱满、无破损、无霉变的种子，去掉残留物，有壳的去掉壳 ，水洗，25°C下浸泡7 10h，常规消毒，用无菌水洗净，摆放于灭过菌的含2层滤纸、直径为90mm的玻璃培养皿中，加无菌水，无菌水的加入量以保持滤纸湿润为宜，28°C暗培养发芽I 2d ;所述受体为经上述处理过的种子的芽生长点；
划板挑取带有外源基因的农杆菌单菌落，接入含50mg/L卡那霉素、40mg/L利福平的LB液体培养基，28。(^、220 rpm暗培养至菌液me。。=0. 5 O. 6,4000rpm>5min离心收集菌体，弃上清液加入1/5 1/2所述LB液体培养基的侵染基液，摇匀制备成所述侵染液，即农杆菌介导转化液；所述侵染基液含100 μ mol/L ASU00mg/L F68、400mg/L MESU/10 MS的盐、lOg/L葡萄糖、40g/L麦芽糖，pH 5. 6 ；
(2)芽生长点暴露与微创转化
①时机把握对于籽粒较小的植物芽伸长到0.2 2cm时，对于籽粒较大的植物芽伸长到0. 3 Icm时,实施转化处理；
所述籽粒较小的植物包括小麦、水稻、谷子、黍子和高粱，所述籽粒较大的植物包括玉
米；
②暴露生长点的方法
对于地中茎不伸长的植物，直接用摄子掰去胚芽鞘和已分化出的幼叶即可；对于地中茎伸长的植物，找出地中茎与生长点结合区形成的折光带，在靠近折光带的上方用刀片切去芽鞘和已分化出的幼叶；
③用微创转基因刷转化
用微创转基因刷蘸所述农杆菌介导转化液后，对准拟转化种子的芽生长点刺刷2 3次，然后按种子芽生长点向上的方向摆放于铺有2层滤纸、灭过菌的培养皿中，所述滤纸用无菌水润湿，每个培养皿中放置10 40粒种子；
(3)共培养
往放有转化处理过的芽生长点种子的培养皿中滴加无菌水使培养皿中的滤纸保持湿润，无菌水的滴加量为0. 5 3ml，盖上皿盖，置于25°C暗培养3d ；
(4)苗培养
将完成共培养的材料，用蛭石覆盖根系，或转至含蛭石的钵器，25°C、光照12h/d培养直至成苗；对于不需做春化处理的作物，培养7d就移栽于温室,或完成共培养后就直接移播于温室，罩上塑料薄膜，7 IOd后揭膜；
对于需春化处理的冬小麦，则先25°C、光照12 h/d培养7d，然后转到8°C的春化箱内春化处理20 30d，具体天数因品种而定；
(5)幼苗移栽
苗长成后，移栽于按要求隔离防护的温室或农田；
(6)苗及植株管理
采取水肥措施促进苗健壮发育，促进多结粒；对于雌雄异花的玉米及时做好雌雄穗的套袋防护和人工授粉工作；
(7)分子检测与鉴定
在Ttl代不进行检测，以免结果不真实；将Ttl代植株所结的种子，按单株收获；将所收种子逐株萌发成苗进行检测，即在T1代开始检测、鉴定；对于外源基因有抗性功能的，先进行抗性筛选，然后对选出的抗性苗或植株进行PCR检测；对于不具有抗性功能的，直接逐株进 行PCR检测；对经PCR鉴定为阳性的材料,进行Southern blot检测予以确证。所述微创转基因刷，其刷毛由微米级的不锈钢纤维或碳硅纤维或玻璃纤维制成，刷毛单根直径为4 20 μ m，每刷的刷毛根数为100 5000根，刷毛露出长度为O. 5 3mm。所述微创转基因刷的刷毛单根直径为8 18 μ m，每刷的刷毛根数为大于100根、小于等于2000根，刷毛露出长度为I 2mm。所述“刺刷”为即刺又刷；所述“刺”为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，瞄准芽生长点顶部直刺，送入带有外源目的基因的农杆菌；所述“刷”为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，对整个芽生长点像梳头一样刷划，送入带有外源目的基因的农杆菌。所述地中茎不伸长的植物包括小麦和水稻；所述地中茎伸长的植物包括玉米、谷子、黍子和闻粱。本发明的技术原理如下
申请人:研究发现(1)萌发后的小麦、玉米、水稻种子去掉芽鞘后即可实施遗传转化处理，对于谷子、黍子、高粱等也如此。据此申请人确定了转化种子芽生长点的最早适宜时期。
(2)水稻种子芽生长点细胞的直径约25 μ m、小麦种子芽生长点细胞的直径约60 μ m、玉米种子芽生长点细胞的直径约50 μ m。要获得好的转化效果，必须对生长点进行充分的微创伤。为此，申请人发明了由若干根(100 5000根)微米级刚性纤维(即不锈钢纤维或碳硅纤维或玻璃纤维，单根直径4 20 μ m)组成的可对生长点细胞实施较充分微创伤的转基因工具——微创转基因刷，简称“微创刷”或“转基因刷”。用这种微创刷蘸农杆菌介导转化液对生长点细胞实施较充分的微创转化，可获得很好的转化效果。(3)适当控制转化处理后种子芽生长点的水势，可保护受微创的细胞不胀破、促进农杆菌与受创细胞的结合，进而提升转基因的效果。(4)微创转化处理后的种子芽生长点，可以基本不受影响地发育成正常植株并开花结实，比一般的转化技术耗时少。(5)将转化处理后长成的植株(Ttl)所结的种子分株收获，再将种子萌发成苗(T1)进行鉴定，不必抗性筛选，结果具体而准确。在此基础上，申请人还建立了评价这种转基因技术的专门指标
损伤率与成苗率用“微创刷”刺刷生长点时，有些种子的芽生长点难免会因受伤过重而不能成苗。这类种子所占的百分率，即为“损伤率”；与之对应的便是“成苗率”。
权利要求
1. 一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于 (1)受体及侵染液的准备 挑选拟转化植物品种的饱满、无破损、无霉变的种子，去掉残留物，有壳的去掉壳，水洗，25°C下浸泡7 10h，常规消毒，用无菌水洗净，摆放于灭过菌的含2层滤纸、直径为90mm的玻璃培养皿中，加无菌水，无菌水的加入量以保持滤纸湿润为宜，28°C暗培养发芽I 2d ;所述受体为经上述处理过的种子的芽生长点； 划板挑取带有外源基因的农杆菌单菌落，接入含50mg/L卡那霉素、40mg/L利福平的LB液体培养基，280C >220 rpm暗培养至菌液OD6tltl=O. 5 O. 6，4000rpm、5min离心收集菌体，弃上清液加入1/5 1/2所述LB液体培养基体积的侵染基液，摇匀制备成所述侵染液，即农杆菌介导转化液；所述侵染基液含ΙΟΟμπιοΙ/L ASU00mg/L F68、400mg/L MESU/10 MS的盐、10g/L葡萄糖、40g/L麦芽糖，pH 5. 6 ； (2)芽生长点暴露与微创转化 ①时机把握对于籽粒较小的植物芽伸长到O.2 2cm时，对于籽粒较大的植物芽伸长到O. 3 Icm时,实施转化处理； 所述籽粒较小的植物包括小麦、水稻、谷子、黍子和高粱，所述籽粒较大的植物包括玉米； ②暴露生长点的方法 对于地中茎不伸长的植物，直接用摄子掰去胚芽鞘和已分化出的幼叶即可；对于地中茎伸长的植物，找出地中茎与生长点结合区形成的折光带，在靠近折光带的上方用刀片切去芽鞘和已分化出的幼叶； ③用微创转基因刷转化 用微创转基因刷蘸所述农杆菌介导转化液后，对准拟转化种子的芽生长点刺刷2 3次，然后按种子芽生长点向上的方向摆放于铺有2层滤纸、灭过菌的培养皿中，所述滤纸用无菌水润湿，每个培养皿中放置10 40粒种子； (3)共培养 往放有转化处理过的芽生长点种子的培养皿中滴加无菌水使培养皿中的滤纸保持湿润，无菌水的滴加量为O. 5 3ml，盖上皿盖，置于25°C暗培养3d ； (4)苗培养 将完成共培养的材料，用蛭石覆盖根系，或转至含蛭石的钵器，25°C、光照12h/d培养直至成苗；对于不需做春化处理的作物，培养7d就移栽于温室,或完成共培养后就直接移播于温室，覆罩上塑料薄膜，7 IOd后揭膜； 对于需春花处理的冬小麦，则先25°C、光照12 h/d培养7d,然后转到8°C的春化箱内春化处理20 30d，具体天数因品种而定； (5)幼苗移栽 苗长成后，移栽于按要求隔离防护的温室或农田； (6)苗及植株管理 采取水肥措施促进苗健壮发育，促进多结粒；对于雌雄异花的玉米及时做好雌雄穗的套袋防护和人工授粉工作； (7)分子检测与鉴定在Ttl代不进行检测，以免结果不真实；将Ttl植株所结的种子，按单株收获；将所收种子逐株萌发成苗进行检测，即在T1代开始检测、鉴定；对于外源基因有抗性功能的，先进行抗性筛选，然后对选出的抗性苗或植株进行PCR检测；对于不具有抗性功能的，直接逐株进行PCR检测；对经PCR鉴定为阳性的材料,进行Southern blot检测予以确证。
2.根据权利要求I所述的一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于所述微创转基因刷，其刷毛由微米级的不锈钢纤维或碳硅纤维或玻璃纤维制成，刷毛单根直径为4 20 μ m，每刷的刷毛根数为100 5000根，刷毛露出长度为O. 5 3mm。
3.根据权利要求2所述的一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于所述微创转基因刷的刷毛单根直径为8 18 μ m，每刷的刷毛根数为大于100根、小于等于2000根，刷毛露出长度为I 2mm。
4.根据权利要求I或2或3所述的一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于所述“刺刷”为即刺又刷；所述“刺”为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，瞄准芽生长点顶部直刺，送入带有外源目的基因的农杆菌；所述“刷”为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，对整个芽生长点像梳头一样刷划，送入带有外源目的基因的农杆菌。
5.根据权利要求4所述的一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于所述地中茎不伸长的植物包括小麦和水稻；所述地中茎伸长的植物包括玉米、谷子、泰子和闻梁。
全文摘要
本发明涉及一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法。其技术要点是将种子萌发1～2d，芽伸长至0.2～2cm时，去除胚芽鞘暴露生长点；用刷毛单根直径4～20μm、露出长度0.5～3mm、根数100～5000根的微创刷蘸农杆菌介导转化液，对生长点实施刺刷，进行较充分的微创转化；完成共培养后进一步发育成苗，促进穗、粒发育，分株收获；T1代进行鉴定。本发明的优点是不需要组织培养、不受基因型限制、不必须抗性筛选、操作简便、易规模化，适用于所有结种子的单子叶植物。利用本发明涉及的方法，在小麦、水稻、玉米的遗传转化上，分别获得了转化率为49%、66.3%、100%的转化效果。
文档编号A01H5/00GK102876712SQ20121030032
公开日2013年1月16日 申请日期2012年8月22日 优先权日2012年8月22日
发明者王海波, 董福双, 吕孟雨, 张艳敏, 任志恒, 杨帆, 梁新潮, 左文博, 石学萍, 张欢欢, 高义平, 赵和, 徐显, 孙果忠, 柴建芳, 刘永伟, 朱金永, 韩秋芬, 张强, 马辉杰, 王占武, 关军锋 申请人:河北省农林科学院遗传生理研究所