专利名称：鲤鲫杂交鱼的选育方法及其远缘杂交品系的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类的远缘杂交方法，尤其涉及一种以鲤鱼为母本、鲫鱼为父本的远缘杂交方法。
背景技术：
杂交技术是改良鱼类性状常用的方法，亲缘关系在种间或种间以上的杂交一般称为远缘杂交。远缘杂交作为一种重要的鱼类遗传育种和性状改良方法，它可以整合整套外源基因，从而改变杂交后代基因的表达调控，使得杂交后代可能在生长速度、抗逆性、抗病性以及肉质等方面表现出杂种优势。如红鲫与湘江野鲤的属间远缘杂交形成的杂交后代具有生长速度快、肉质鲜嫩、抗病力强、存活率高等优点。现今一般的观点认为鲫鱼和鲤鱼间杂交一代是完全不育的，如何利用和改进现有的生物学技术和方法来对现有的自然鱼种进行遗传改良以获得性状更为优良、品种更加丰富和对遗传研究更有意义的新型多倍体鱼，就成为本领域技术人员长期面临和需要解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种所获杂交鱼品种优良的鲤鲫杂交鱼的选育方法，还提供一种所获杂交鱼品种优良的鲤鲫杂交鱼远缘杂交品系建立的方法。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种鲤鲫杂交鱼的选育方法，包括以下步骤首先，以锦鲤为母本亲鱼，以红鲫为父本亲鱼，对所述父、母本亲鱼先进行人工催产，再进行人工干法授精，将受精卵置于培养皿中进行流水孵化，再对孵化出的鱼苗进行饲养、检测，进而选育出雌性或雄性可育的鲤鲫杂交F1代个体。上述鲤鲫杂交鱼的选育方法中，所述母本亲鱼选取两龄以上、无病态、发育良好、性成熟特征明显的锦鲤，所述父本亲鱼选取两龄以上、无病态、发育良好、性成熟特征明显的红鲫；所述父、母本亲鱼在进行人工催产前，先放入亲鱼池内人工精养3 4个月。上述鲤鲫杂交鱼的选育方法中，所述人工催产的具体操作步骤优选包括在4月初至5月下旬，水温维持在20°C 26°C，对母本亲鱼先注射绒毛膜促性腺激素(HCG)与黄体素释放激素类似物(LRH-A)的混合液催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为600IU/kg 800IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为10ug/kg 20ug/kg ;再对父本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合液，相比母本亲鱼，其注射剂量减半；然后按I (5 10)的数量比将注射后的母本亲鱼、父本亲鱼放入同一产卵池(水面面积为80 m2左右)中，然后向产卵池中冲水(视水情及时向池中冲水，尤其在产卵前3h 4h)，注入一定水量后停止冲水并让父、母本亲鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精。上述的鲤鲫杂交鱼的选育方法中，所述检测过程包括利用流式细胞测定DNA含量以及利用肾细胞染色体制备工艺检测饲养后鲤鲫杂交鱼的染色体倍性。上述本发明的技术方案中，锦鲤与红鲫的属间远缘杂交形成的杂交后代F1除具有生长速度快、肉质鲜嫩、抗病力强、存活率高等优点外，体背还明显增高，头部颜色金灰相间，鳞片外缘呈金黄色，背部呈整齐的金黄色，是一种外形优美、体色独特、具有良好观赏价值及应用前景的杂交鱼。更重要的是，传统观点认为鲫鱼和鲤鱼间杂交一代是完全不育的，但通过采用本发明的上述选育方法，我们在杂交F1代的雌性和雄性群体中稳定地获得了可育的个体，并且通过后续的研究发现，前述杂交F1代的可育个体经过自交可稳定制备鲤鲫杂交二倍体F2代，这为后续异源四倍体鱼的培育奠定了坚实的基础。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种鲤鲫杂交鱼远缘杂交品系的建立方法，将上述选育方法获得的鲤鲫杂交F1代中的雄性杂交鱼和雌性杂交鱼进行自交，培育得到鲤鲫杂交F2代。通过鲤鲫杂交F1自交可以稳定获得鲤鲫杂交F2代，经过我们的检测研究发现，鲤鲫杂交F2代同样两性可育。通过对F2进行自交，有望在其后代F3中发现两性可育并可稳定遗传的四倍体，利用异源四倍体鲫鲤与二倍体杂交，则有望制备具有生长速度快、抗逆性强、不育的三倍体鲫(鲤)鱼，可见，鲤鲫杂交鱼远缘杂交品系的建立将具有明显的经济效益和社会效益。上述的鲤鲫杂交鱼远缘杂交品系的建立方法，所述自交的具体方法为将两龄以上的所述雄性杂交鱼和雌性杂交鱼放入亲鱼池内，先进行人工催产，再进行人工干法授精和流水孵化，最后进行饲养，直至鱼苗长成后经检测获得鲤鲫杂交F2代二倍体鱼。上述的鲤鲫杂交鱼远缘杂交品系的建立方法中，所述杂交鱼的人工催产过程优选包括当繁殖季节水温稳定在20°c 26°C时，选择腹部膨大、轻压腹部能挤出墨绿色卵子的雌性杂交鱼个体作为母本亲鱼，选择挤出水样精液的雄性杂交鱼个体，利用普通光学显微镜对精液进行镜检，选择精液中有活精子的雄性杂交鱼个体作为父本亲鱼，然后先对母本注射黄体素释放激素类似物(LRH-A)、绒毛膜促性腺激素(HCG)及地欧酮(DOM)的混合催产剂进行催产，所述黄体素释放激素类似物的用量为10ug/kg 15ug/kg，所述绒毛膜促性腺激素的用量为500IU/kg 1000IU/kg，所述地欧酮的用量为lmg/kg ;母本亲鱼注射完成后4h 5h再注射父本亲鱼，父本亲鱼的黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素的注射剂量相比母本亲鱼减半，且父本亲鱼不注射地欧酮；注射完毕后按I : (5 10)的数量比将母、父本亲鱼放入同一(水面面积为80 m2左右，水深为Im左右)产卵池中，然后在产卵前3h 4h (据水情及时)向池中冲水，此后停止注水，让鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精。上述的鲤鲫杂交鱼远缘杂交品系的建立方法，在所述自交的人工干法授精过程中，选取不带粘稠物质、游离自如的卵子进行干法人工授精。将获得的受精卵进行孵化，待鱼苗全部孵出后，继续在玻璃培养皿中培育2天，再将鱼苗放入网箱中继续饲养，其中清水的高度从30cm高逐渐提升,在一周内升高到O. 8m I. 2m,当鱼苗长到3cm 4cm长时,转入池塘中饲养；I 2天后泼洒豆浆，2 3次/天，力求细、匀，直至鱼苗长成后经检测获得鲤鲫杂交F2代二倍体鱼。所述自交的检测过程优选包括利用流式细胞测定DNA含量以及利用肾细胞染色体制备工艺检测饲养后鲤鲫杂交鱼的染色体倍性。本发明的上述技术方案中，锦鲤iColorcarp)在生物学上属于鲤形目、鲤科、鲤属
、鲤iCyprinus carpio Zizwaew1S),是人们对自然鱼种进行杂交选育而形成的一种典型的观赏性鱼，锦鲤具有体格健美、色彩艳丽、花纹美丽、泳姿优美等优点，有“水中活宝石”和“会游泳的艺术品”之称。红鲫同样隶属于鲤科(Cyprinit/ae )、鲫属(Carassius )、鲫种(Ckra1S1Siw1S auratus)中的二倍体鱼(2n=100),其体形优美,抗逆性强，肉质细嫩。本发明通过属间的远源杂交，整合了父母本花纹美丽、体型健美、抗逆性强等优点；其次，本发明也克服了远源杂交不能成活或者成活率低的问题；在同等养殖条件下，本发明方法培育的鲤鲫F1具有高受精率和高孵化率，鲤鲫体色独特，鲤鲫的头部颜色金灰相间，鳞片外缘呈金黄色，背部呈整齐的金黄色，具有良好的观赏价值及应用前景。已有的研究表明，利用红鲫(2n=100)为母本及湘江野鲤(2n = 100)为父本产生的远缘杂交后代中，F1 - F2为二倍体(2n=100)，而在二倍体F2个体中，存在能分别产生二倍体卵子和二倍体精子的雌、雄个体，二倍体卵子和二倍体精子结合，形成了两性可育的四倍体鱼(F3)。目前四倍体鲫鲤已连续繁殖了 20代(F3 - F22),形成了一个遗传性状稳定的四倍体鱼群体(4n = 200)。而本发明中利用锦鲤和红鲫进行属间远缘杂交，获得的鲤鲫F1两性可育，通过进一步的自交，已成功选育出鲤鲫F2群体，形成了鲤鲫杂交鱼品系，这为选育异源四倍体鱼品系奠定了坚实的基础。通过继续在锦鲤(2n=100)和红鲫(2n=100)的杂交后代中进行多代选育，也有望获得两种新型四倍体资源一四倍体鲤鲫。因此，二倍体鲤鲫的培育，不仅为优良品种的选育奠定了良好基础，而且为后续的新型多倍体鱼的选育提供了宝贵的资源，对今后的遗传育种及生物进化学的研究具有重要意义。
图I为本发明中锦鲤(早)X图2为本发明中锦鲤(早)X图3为本发明中锦鲤(早)X图4为本发明中锦鲤(早)X图5为本发明中锦鲤(早)X图6为本发明中锦鲤(早)X图7为本发明中锦鲤(早)X图8为本发明中锦鲤(早)X
红鲫(S)F1后代的外形照片。
红鲫U ) F1的DNA含量图。
红鲫U ) F1后代的染色体(2n=100) t红鲫U ) F1的精巢性腺切片。
红鲫U ) F1的卵巢性腺切片。
红鲫U ) F2后代的外形照片。
红鲫U ) F2的DNA含量图。
红鲫U )F2后代的染色体(2n=100)t
具体实施例方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。实施例
一种鲤鲫杂交鱼远缘杂交品系的建立方法，包括首先，以锦鲤为母本亲鱼，以红鲫为父本亲鱼，对父、母本亲鱼先进行人工催产，再进行人工干法授精，将受精卵置于培养皿中进行流水孵化，再对孵化出的鱼苗进行饲养、检测，进而选育出鲤鲫杂交F1代；将选育获得的鲤鲫杂交F1代中的雄性杂交鱼和雌性杂交鱼进行自交，培育得到鲤鲫杂交F2代。本实施例的上述鲤鲫杂交鱼远缘杂交品系的建立方法具体包括以下两大步骤
I.鲤鲫F1代的获得。I. I父母亲本的选择和培养选取两龄以上、无病态、发育良好、性成熟特征明显的雌性锦鲤作为母本亲鱼，再选择两龄以上、无病态、发育良好、性成熟特征明显的雄性红鲫作为父本亲鱼，将父、母本亲鱼放入亲鱼池内，人工精养3 4个月。
I. 2人工催产在4月初至5月下旬，水温维持在20°C 26°C时，将亲鱼池内两龄以上的雌性亲鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)与黄体素释放激素类似物(LRH-A)的混合液催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为600IU/kg 800IU/kg、黄体素释放激素类似物的用量为10ug/kg 20ug/kg。再选择雄性亲鱼，对其注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合液，相比雌性亲鱼，其注射剂量减半。注射完毕后按I : (3 5)的数量比将母、父本亲鱼放入水面面积为90m2左右的同一产卵池中，然后视水情及时向产卵池中冲水，尤其在产卵前3h 4h，注入一定水量后，停止注水，让父、母本亲鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精。I. 3人工授精与孵化当人工催产8h 12h后，选取产卵顺利的母本与产精顺利的父本进行人工干法授精，将受精卵均匀铺于玻璃培养皿中，20°C左右的流水孵化。I. 4鲤鲫F1的饲养待鱼苗全部孵出后，继续在玻璃培养皿中培育2天，再将鱼苗放入网箱中继续饲养，其中清水的高度从30cm高逐渐提升,在一周内升高到O. 8m I. 2m,当鱼苗长到3cm 4cm长时，转入池塘中饲养；1 2天后泼洒豆浆，2 3次/天，力求细、匀。鱼苗长成后经检测获得鲤鲫F1杂交二倍体鱼(外形照片参见图I)。待鲤鲫F1杂交二倍体鱼苗培育九个月左右后，随机抽样，人工测量并分析其生物学性状相关数据，如侧线鳞数、背鳍条数、体长/体高值等，并分别与其父、母本成体的各项已知数据进行比较，比较结果如下表I、表2所示。表I :锦鲤(早)X红鲫U ) F1及其父母本可量性状比值统计
权利要求
1.一种鲤鲫杂交鱼的选育方法，包括以下步骤首先，以锦鲤为母本亲鱼，以红鲫为父本亲鱼，对所述父、母本亲鱼先进行人工催产，再进行人工干法授精，将受精卵置于培养皿中进行流水孵化，再对孵化出的鱼苗进行饲养、检测，进而选育出雌性或雄性可育的鲤鲫杂交？1代个体。
2.根据权利要求I所述的鲤鲫杂交鱼的选育方法，其特征在于所述母本亲鱼选取两龄以上、无病态、发育良好、性成熟特征明显的锦鲤，所述父本亲鱼选取两龄以上、无病态、发育良好、性成熟特征明显的红鲫；所述父、母本亲鱼在进行人工催产前，先放入亲鱼池内人工精养3 4个月。
3.根据权利要求2所述的鲤鲫杂交鱼的选育方法，其特征在于，所述人工催产的具体操作步骤包括在4月初至5月下旬，水温维持在20 V 26°C，对母本亲鱼先注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合液催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为600IU/kg 800IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为10ug/kg 20ug/kg ;再对父本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合液，相比母本亲鱼，其注射剂量减半；然后按I : (5 10)的数量比将注射后的母本亲鱼、父本亲鱼放入同一产卵池中，然后向产卵池中冲水，之后停止冲水并让父、母本亲鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精。
4.根据权利要求3所述的鲤鲫杂交鱼的选育方法，其特征在于，所述检测过程包括利用流式细胞测定DNA含量以及利用肾细胞染色体制备工艺检测饲养后鲤鲫杂交鱼的染色体倍性。
5.一种鲤鲫杂交鱼远缘杂交品系的建立方法，其特征在于，将权利要求I 4中任一项所述选育方法获得的鲤鲫杂交F1代中的雄性杂交鱼和雌性杂交鱼进行自交，培育得到鲤鲫杂交F2代。
6.根据权利要求5所述的鲤鲫杂交鱼远缘杂交品系的建立方法，其特征在于，所述自交的具体方法为将两龄以上的所述雄性杂交鱼和雌性杂交鱼放入亲鱼池内，先进行人工催产，再进行人工干法授精和流水孵化，最后进行饲养，直至鱼苗长成后经检测获得鲤鲫杂交F2代二倍体鱼。
7.根据权利要求6所述的鲤鲫杂交鱼远缘杂交品系的建立方法，其特征在于，所述杂交鱼的人工催产过程包括当繁殖季节水温稳定在20°C 26°C时，选择腹部膨大、轻压腹部能挤出墨绿色卵子的雌性杂交鱼个体作为母本亲鱼，选择挤出水样精液的雄性杂交鱼个体，利用普通光学显微镜对精液进行镜检，选择精液中有活精子的雄性杂交鱼个体作为父本亲鱼，然后先对母本注射黄体素释放激素类似物、绒毛膜促性腺激素及地欧酮的混合催产剂进行催产，所述黄体素释放激素类似物的用量为10ug/kg 15ug/kg，所述绒毛膜促性腺激素的用量为500IU/kg 1000IU/kg，所述地欧酮的用量为lmg/kg ;母本亲鱼注射完成后4h 5h再注射父本亲鱼，父本亲鱼的黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素的注射剂量相比母本亲鱼减半，且父本亲鱼不注射地欧酮；注射完毕后按I : (5 10)的数量比将母、父本亲鱼放入同一产卵池中，然后在产卵前3h 4h向池中冲水，此后停止注水，让鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精。
8.根据权利要求6或7所述的鲤鲫杂交鱼远缘杂交品系的建立方法，其特征在于，在所述自交的人工干法授精过程中，选取不带粘稠物质、游离自如的卵子进行干法人工授精。
9.根据权利要求6或7所述的鲤鲫杂交鱼远缘杂交品系的建立方法，其特征在于，所述自交的检测过程包括利用流式细胞测定DNA含量以及利用肾 细胞染色体制备工艺检测饲养后鲤鲫杂交鱼的染色体倍性。
全文摘要
本发明公开了一种鲤鲫杂交鱼的选育方法，包括以下步骤首先，以锦鲤为母本亲鱼，以红鲫为父本亲鱼，对父、母本亲鱼先进行人工催产，再进行人工干法授精，将受精卵置于培养皿中进行流水孵化，再对孵化出的鱼苗进行饲养、检测，进而选育出雌性或雄性可育的鲤鲫杂交F1代个体。本发明还公开了一种鲤鲫杂交鱼远缘杂交品系的建立方法，将前述选育方法获得的鲤鲫杂交F1代中的雄性杂交鱼和雌性杂交鱼进行自交，培育得到鲤鲫杂交F2代。本发明不仅为优良品种的选育奠定了良好基础，而且为后续的新型多倍体鱼的选育提供了宝贵的资源，对今后的遗传育种及生物进化学的研究具有重要意义。
文档编号A01K61/00GK102919174SQ20121044958
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者刘少军, 肖军, 谢翔, 陶敏, 张纯, 罗凯坤, 刘筠 申请人:湖南师范大学