专利名称：一种山楂海棠嫩茎段试管内一步快速成苗方法
技术领域：
本发明涉及一种植物繁殖，即一种山楂海棠嫩茎段试管内一步快速成苗方法。
背景技术：
在现有技术中，山楂海棠komarovii (Sarg. )Rehd.别名薄叶山楂、山苹果， 是蔷薇科苹果亚属苹果属落叶小乔木，果实含蛋白质、脂肪、糖、灰分％、维生素C、苹果酸、 核黄素、胡萝卜素及钙、磷、铁等。果实可生食，还可酿酒和制果汁及果酱。树体矮小，抗寒力强，是苹果、梨、楸子等最好的矮化砧木。花美丽，气味清香，果实艳丽、挂果期长，可用做园景树。
山楂海棠在长白山区数量非常稀少，分布区域十分狭窄，仅在长白县的马鹿沟镇二十三道沟至龙泉镇一带有较大的种群面积，其他区域仅有零星分布。被《中国珍稀濒危保护植物名录(第一册)》定为渐危种，国家二级重点保护植物。被《中国物种红色名录》定为易危种(VU)。在《吉林省野生动植物保护管理暂行条例》一文中被定为省级一类重点保护植物。
现实中，山楂海棠野生资源少，扦插、种子等常规方法繁殖消耗野生资源大，生根和发芽困难，移栽成活率低，导致野生资源严重受砍伐、采挖等，需要合理方法进行人工繁殖。发明内容
本发明的目的是针对上述不足而提供一种技术可行，繁殖速度快、茎段生根率高、 茎段腋芽萌发生长快的山楂海棠嫩茎段试管内一步快速成苗方法。
本发明的技术解决方案是一种山楂海棠嫩茎段试管内一步快速成苗方法，其步骤如下(O以山楂海棠枝条水培休眠芽嫩茎段作为外植体备用；(2)山楂海棠生根同时茎段腋芽萌发生长的培养基为培养基+6-BA(0. 07 O. 09 mg · L O + IBA (O. 02 O. 04 mg · L O + GA3 (O. 09 O. 13 mg · L O ；培养基中附加琼脂粉8. 5 8*171，添加蔗糖5.0 g ，调节pH值至5. 5，嫩茎段在光照周期8 h · Cf1、光照强度800 Ix和温度22±2°C条件下培养；(3)将种苗扩繁后的小植株从培养瓶中取出，栽植到经消毒过的草炭土、腐烂松针和河砂比=2: 2: I的基质中，控制温度为20±2 °C，保持12 h · Cf1的自然光照。
外植体是将山楂海棠枝条剪成段后，用塑料袋包好后放入冰柜内低温休眠，温度控制在_5 O °C，45 d后取出进行水培促其休眠芽萌发；待休眠芽萌发长至3. 00 cm时， 将休眠芽剪下，去除嫩叶和叶柄，用体积分数70%乙醇涮洗30 S，移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡10 min，无菌水冲洗7次，无菌滤纸吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸钠毒伤的组织后切割成I叶I段即得。山楂海棠嫩茎段平均生根率达98. 0%以上。
本发明的优点是1、本发明培养基和方法步骤有利于山楂海棠嫩茎段试管内生根同时腋芽萌发生长，生根率高，腋芽萌发生长速度快，可操作性强，从茎段接种到出苗仅用I 种低成本培养基，属一步成苗方法，可以满足工厂化育苗的需要。2、按每瓶接种8个茎段， 30天为I个周期，每个茎段在I个培养周期内平均可切割成5段计算，每年有η个周期(山楂海棠每年11个周期)进行扩繁，年生产山楂海棠种苗数为Σ年产试管苗=8 X 5η株，可见其繁殖数量，山楂海棠嫩茎段平均生根率达98. 0%以上。该方法对利用少量的野生资源材料年繁殖出上百万株的珍稀濒危植物种苗具有重要社会、经济和生态意义，解决了种子繁殖发芽率低，常规扦插等繁殖方法利用大量野生资源，造成野生资源砍伐和灭绝等问题。
下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。
具体实施方式
I材料与方法1.1材料及处理10月下旬，采集山楂海棠枝条，并将枝条剪成段(长度为30 cm)后，用塑料袋包好后放入冰柜内低温休眠，温度控制在-5 O °C，45 d后取出进行水培促其休眠芽萌发。待休眠芽萌发长至3. 00 cm时，将休眠芽剪下，去除嫩叶和叶柄，用70%乙醇(体积分数)涮洗30 s，移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡10 min，无菌水冲洗7次，无菌滤纸吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸钠毒伤的组织后切割成I叶I段作为外植体备用。
1.2山楂海棠茎段生根同时腋芽萌发生长、植株快速再生体系建立和炼苗培养基成分和含量:100 mg ^r1KNO3, 225 mg · L-1CaCl2 · 2H20，37. 4 mg · L-1MgSO4 · 7H20， 34. 0 mg · T1KH2PO4,180 mg · L-1KCl，31. 25 mg · T1Ca3(PO4)2 ；4. 64 mg · T1FeSO4 · 7H20, 6. 22 mg · T1Na2 · EDTA · 2H20 ；3. 72 mg · IZ1MnSO4 · 4H20,1. 44 mg · T1ZnSO4 · 7H20,1. 04 mg · L^1H3BO3jO. 042 mg · L-1Na2MO4 · 2H20 ；0. 25 mg · L-1 盐酸硫胺素(VB1) ,0. 125 mg · L-1 烟酸,0. 125 mg · L—1盐酸卩比卩多醇(VB6) ,10 mg · L—1肌醇,0. 50 mg · L—1甘氨酸。培养基中附加 6-苄氨基嘌呤 6-BA (O. 01 O. 05 mg .171)、吲哚丁酸 IBA (O. 05 O. 14 mg .171)和赤霉素 GA3 (I. 60 2. 50 mg ·Ι^)，琼脂粉8. 5 g · L—1，添加蔗糖5. O g · L_\调节pH值至5. 5，嫩茎段在光照周期8 h^cf1、光照强度800 Ix和温度(22±2) °C条件下培养。为提高山楂海棠嫩茎段生根的速度及生根率和腋芽萌发生长速度，通过均匀设计法设计实验，选用Uici(IOs) 均匀表，每个处理接种10个嫩茎段，重复3次，筛选山楂海棠茎段生根和腋芽萌发生长的 6_苄氨基嘌呤、IBA和赤霉素最佳浓度配比。茎段培养30 d统计生根率和长度。生根率 =(生根的茎段数/接种的茎段总数)X100%,茎段腋芽长度为I个培养周期过程中，茎段腋芽萌发生长后的长度(不包括原茎段长度)。
待茎段生根和腋芽萌发生长至2. 50 cm，腋芽发出5 6个叶时，在超净工作台上打开培养瓶，将腋芽留I叶剪下苗干，并将苗干切割成I叶I段，长度大约为O. 5 Cm的小茎段后，再次将小茎段转接到茎段生根和腋芽萌发生长培养基中，计算出每个茎段生根和腋芽萌发生长及每瓶的增殖倍数和周期。
当种苗扩繁到一定数量后，且小植株长至I. 50 2. 00 cm时，将小植株从培养瓶中取出，放在高锰酸钾溶液(浓度为3 mg · L-1)中洗净根上的琼脂，将小植株栽植到经杀毒矾(200倍液)消毒过的草炭土、腐烂松针和河砂(2: 2: I)的基质中，覆盖塑料薄膜(透性好)进行保湿保温，控制温度为(20±2) °C，保持相对湿度在70%，12 h ^cT1的自然光照，中午温度升高时经薄膜打开小口进行换气通风，每天早上喷洒I次清水。
2结果与分析2. I 6-苄氨基嘌呤、吲哚丁酸和赤霉素对山楂海棠茎段生根的影响数据(表I)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为7=84. 2 + 338^ 一 160為，显著性水平a = O. 05，复相关系数TP= O. 9373，剩余标准差S= 3. 2900，检验值6 = 25. 33 >临界值Aon7) = 4. 737，回归方程具有显著性，6-苄氨基嘌呤和吲哚丁酸对茎段的生根影响具有显著性，赤霉素对茎段的生根影响不显著。通过计算6-苄氨基嘌呤和吲哚丁酸对生根的贡献值和贡献率可知，U1 = 215，UJU= 39. 2% 'U2 = 199，UjU= 36. 2%，但从贡献率数值来看，6-苄氨基嘌呤和吲哚丁酸差距不大，说明6-苄氨基嘌呤和吲哚丁酸均在山楂海棠茎段生根起同等不可缺少的重要作用。因6-苄氨基嘌呤与生根率呈正相关，而吲哚丁酸与生根率呈负相关。由此推测，质量浓度高于O. 05 mg .171的6-苄氨基嘌呤，以及吲哚丁酸质量浓度低于O. 05 mg吨―1可能有更高的生根率。为验证此可能性，又以6-苄氨基嘌呤为 O. 10,0. 09,0. 08,0. 07,0. 06 和 O. 05 mg · Γ1，吲哚丁酸质量浓度为 O. 05,0. 04,0. 03、O.02,0.01和O. 00 mg · Γ1开展6个补充试验，重复3次。具体操作按I. I和I. 2方法，结果发现，6-苄氨基嘌呤质量浓度为(O. 05 O. 09 mg -Γ1)和吲哚丁酸质量浓度为(O. 02 O.04 mg · Γ1)时，山楂海棠嫩茎段生根率最高，平均生根率达98.0%以上。均高于表I所列10个处理的生根率。
表I山楂海棠嫩茎段生根和腋芽生长激素筛选的Uici(IOs)试验设计与结果 Tablel U10(103)test design and result of hormone for rooting and axillary bud growing of stems ofMalus komarovii
权利要求
1.一种山楂海棠嫩茎段试管内一步快速成苗方法，其特征在于步骤如下 (1)以山楂海棠枝条水培休眠芽嫩茎段作为外植体备用； (2)山楂海棠生根同时茎段腋芽萌发生长的培养基为培养基+6-BA(0. 07 0. 09mg L 0 + IBA (0. 02 0. 04 mg L :) + GA3 (0. 09 0. 13 mg L :)； 培养基中附加琼脂粉8. 5 g L'添加蔗糖5.0 g^L—1，调节pH值至5. 5，嫩茎段在光照周期8 h Cf1、光照强度800 Ix和温度22±2°C条件下培养； (3)将种苗扩繁后的小植株从培养瓶中取出，栽植到经消毒过的草炭土、腐烂松针和河砂比=2: 2: I的基质中，控制温度为20±2 °C，保持12 h Cf1的自然光照。
2.按照权利要求I所述的山楂海棠嫩茎段试管内一步快速成苗方法，其特征在于外植体是将山楂海棠枝条剪成段后，用塑料袋包好后放入冰柜内低温休眠，温度控制在_5 0°C,45 d后取出进行水培促其休眠芽萌发；待休眠芽萌发长至3. 00 cm时，将休眠芽剪下，去除嫩叶和叶柄，用体积分数70%乙醇涮洗30 s,移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡10 min,无菌水冲洗7次，无菌滤纸吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸钠毒伤的组织后切割成I叶I段即得。
3.按照权利要求I或2所述的山楂海棠嫩茎段试管内一步快速成苗方法，其特征在于山楂海棠嫩茎段平均生根率达98. 0%以上。
4.按照权利要求I或2所述的山楂海棠嫩茎段试管内一步快速成苗方法，其特征在于小植株成活率92. 8%以上。
全文摘要
本发明涉及一种植物繁殖，即一种山楂海棠嫩茎段试管内一步快速成苗方法。其步骤如下(1)10月下旬，采集山楂海棠枝条，低温休眠，水培促其休眠芽萌发；处理后切割成1叶1段作为外植体备用；(2)山楂海棠生根同时茎段腋芽萌发生长的培养基为培养基＋6-BA(0.07～0.09mg·L-1)＋IBA(0.02～0.04mg·L-1)＋GA3(0.09～0.13mg·L-1)；本发明有利于山楂海棠嫩茎段试管内生根同时腋芽萌发生长，生根率高，腋芽萌发生长速度快，可操作性强，从茎段接种到出苗仅用1种低成本培养基，属一步成苗方法，可以满足工厂化育苗的需要。
文档编号A01H4/00GK102972292SQ20121050277
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者顾地周, 朱俊义, 姜云天, 郭志欣, 杨丽娟, 梁宇, 陆爽, 潘雨, 张学士 申请人:通化师范学院