一种铁线莲栽培品种多变海神的组织培养方法
【专利摘要】本发明是一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，包括如下步骤：1）外植体消毒处理；2）芽诱导和芽增殖，包括：①取铁线莲“多变海神”当年生的幼嫩茎节和顶芽；②依次用自来水冲洗1h，无菌水冲洗4次；③用灭菌滤纸吸干外植体表面水分，切除叶柄和两端受伤部位。优点：应用组织培养方法，能较好地保持母本的观赏价值，有效地提高铁线莲“多变海神”的繁殖系数；与扦插繁殖相比，生长周期大幅缩短，组织培养法的繁殖系数为扦插繁殖的50~60倍；品种优质、产量可观和便于实地推广。
【专利说明】一种铁线莲栽培品种多变海神的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法(“多变海神”英文商品名为:Clematis ‘Proteus’),属于植物组织培养【技术领域】。
【背景技术】
[0002]铁线莲属(Clematis L.)隶属于毛茛科(Ranunculaceae)毛茛亚科(Subfam.Ranunculoideae)银莲花族(Trib.Anemoneae)铁线莲亚族(Subtrib.Clematidinae),常为多年生木质藤本。世界约有355种，我国有147种，其中93种为我国特有种，特有率为63.3%。
[0003]其萼片花瓣状，色彩丰富，形态多变，茎蔓生，利用叶柄攀援，生长适应性强，园艺用途广泛，观赏价值高，在垂直绿化中具有重要地位，享有“攀援植物皇后”之美称。在日本和西方园林中，铁线莲已占有十分重要的地位，大部分植物园、公园和家庭花园都能见到它们绚丽多彩的身影。此外，该属植物中的许多种如女萎{Clematis)、威灵仙(Cchinensis)等作为药用植物使用已久。
[0004]其种子较难发芽，多用扦插繁殖。采取组织培养法进行铁线莲“多变海神”(英文商品名为:Clematis ‘Proteus’)的快速繁殖,建立丛生芽生根的无性繁殖体系，有利于增大繁殖系数，对于铁线莲“多变海神”走向园艺应用具有较强的生产应用价值。
【发明内容】
[0005]本发明提出的是一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，其目的是克服铁线莲“多变海神”现有繁殖技 术所存在的缺陷，提高其繁殖系数以适应其引种推广及园林应用的需求。
[0006]本发明的技术解决方案:一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，包括如下步骤:
1)外植体消毒处理；
2)芽诱导和芽增殖。
[0007]所述的步骤I)外植体消毒处理，具体包括:
①取铁线莲“多变海神”当年生的幼嫩茎节和顶芽；
②依次用自来水冲洗Ih，毛笔来回刷洗20次，于超净工作台上用质量浓度为75%乙醇灭菌20 s,无菌水冲洗2次,之后用质量浓度为0.1%氯化萊灭菌7 min,立即用无菌水冲洗4次；
③用灭菌滤纸吸干外植体表面水分，切除叶柄和两端受伤部位；实验统计的污染率分别为54%、36%，褐化率为44%、35%。
[0008]所述的步骤2)芽诱导和芽增殖，具体包括:
①诱导培养
冲洗后将外植体置于培养皿中，用剪刀、镊子切除叶柄、两端受伤部位后，将芽接种于已灭菌的诱导培养基1/2 MS+生长调节物质NAA 0.5mg/L+生长调节物质TDZ 1.0 mg/L +质量浓度为3%的蔗糖2(T30 g/L +质量浓度为0.7%的琼脂7g/L，pH值为5.8，培养4周，培养温度25°C，光照16 h/d，照度2400 Ix ；
②不定芽增殖培养
将诱导的丛生芽分成单芽，继而将单芽接入1/2 MS +生长调节物质6-BA 1.0 mg/L +生长调节物质KT 0.5mg/L +生长调节物质NAA 0.5 mg/L +质量浓度为3%的蔗糖20~30g/L +质量浓度为0.7%的琼脂7g/L，的培养基，pH值为5.8，培养4周，温度、光照条件同①丛生芽诱导；
③壮苗培养
将增殖培养基中叶色浓绿、长度为广2 cm的不定芽逐个切下，接入MS基本培养基中培养4星期，光照条件同①丛生芽诱导；
④生根培养
将壮苗培养后长势旺盛的芽接入生根培养基1/2 MS+生长调节物质IBA 0.3 mg/L中，培养40天。温度、光照条件同①丛生芽诱导；
⑤炼苗和移栽
将生根的铁线莲“多变海神”植株的培养瓶瓶盖打开，室温下炼苗6 d后`，取出试管苗，洗净，移栽到准备好的珍珠岩、蛭石、泥炭珍珠岩，其重量比为珍珠岩:蛭石:泥炭=1:1:1的营养钵中，保持湿度85%~95%，温度、光照条件同②丛生芽诱导，成活率达95%。
[0009]本发明的优点:应用组织培`养方法，能较好地保持母本的观赏价值，有效地提高铁线莲“多变海神”的繁殖系数。与`扦插繁殖相比，生长周期大幅缩短，组织培养法的繁殖系数为扦插繁殖的50-60倍。品种优质、产量可观和便于实地推广。
【具体实施方式】实施例
[0010]一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，其培养步骤如下:
步骤一、外植体消毒处理
选取当年生幼嫩茎节和顶芽，依次冲洗1.5 h，于超净工作台上用质量浓度为75%乙醇灭菌20 S，用无菌水冲洗2次，之后用质量浓度为0.1%升汞灭菌7 min，立即用无菌水冲洗
3-4 次。
[0011]步骤二、芽诱导和芽增殖
①诱导培养
冲洗后将外植体置于培养皿中，用剪刀、镊子切除叶柄、两端受伤部位后，将芽接种于已灭菌的诱导培养基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+TDZ 1.0 mg/L上5周，质量浓度为3%的蔗糖2(T30 g/L +质量浓度为0.7%的琼脂7g/L，的培养基，pH 5.7，培养温度25°C ;光照条件:光照/黑暗，其中光照16 h/d，光照度为2400 Ix0
[0012]②不定芽增殖培养
将诱导培养基中诱导出的丛生芽分成单芽，接入1/2 MS+生长调节物质6-BA 1.0 mg/L+生长调节物质KT 0.5 mg/L+生长调节物质NAA 0.5 mg/L增殖培养基中培养4周光照条件同①诱导培养。
[0013]③壮苗培养
将增殖培养基中叶色浓绿、长度为2 cm左右的不定芽逐个切下，接入MS基本培养基中培养25天，光照条件同①诱导培养。
[0014]④生根培养
将壮苗培养后长势旺盛的芽切去茎基部褐色物质后接入生根培养基1/2 MS+生长调节物质IBA 0.3 mg/L,培养6周后生根,光照条件同①诱导培养。
[0015]⑤炼苗和移栽
将生根植株的培养瓶瓶盖打开，室温下炼苗6 d后，取出试管苗，洗净，移栽到准备好的珍珠岩:蛭石:泥炭(1:1:1)苗床上，保持温度2(T25°C，湿度85%~95%，适当遮荫，成活率达 90%。
[0016]所述的MS基本培养基是由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分所组成。
[0017]所述的大量元素为:硝酸钾KNO3,1900 mg.?Λ硝酸铵NH4NO3,1650 mg--1,磷酸二氢钾 KH2PO4,170 mg.-1，硫酸镁 MgSO4.7 H2O, 370 mg.-1，氯化钙 CaCl2.4 H20,440mg.L 1 ο
[0018]所述的微量元素为:碘化钾KI, 0.83 mg.L-1,硼酸 H3BO3 , 6.2 mg七1,或硫酸猛MnS04.4 H2O, 22.3 mg.-1 或硫酸锌 ZnSO4.7 H20,8.6 mg.-1 或钥酸钠 Na2MoO4.2 H2O,
0.25 mg.L' 硫酸铜 CuSO4.5 H2O, 0.025 mg.L' 氯化钴 CoCl2.6 H2O, 0.025 mg.L'
[0019]所述的铁盐为:乙二胺二乙酸二钠Na2.EDTA，37.3 mg.L—1，硫酸亚铁FeSO4.7H2O, 27.8 mg.L 1O
[0020]所述的有机成分为:肌醇C6H12O6.2H20,100 mg.L-1，甘氨酸 NH2CH2COOH, 2mg.L—1，盐酸硫胺素 C12H17C1qS.2Η(:1，0.1 mg.L—1，盐酸吡哆醇 C8H11O3N.HCl ,0.5 mg.L—1，烟酸 NC5H4COOH, 0.5 mg.L'
[0021]所述的1/2 MS基本培养基的成分为:大量元素是MS基本培养基的一半，其余成分微量兀素、铁盐，有机成分与MS基本培养基有机成分相同。
[0022]所述的生长调节物质6-BA为6-苄基腺嘌呤；NAA为萘乙酸；KT为激动素；ΙΒΑ为吲哚丁酸，TDZ为噻二唑苯基脲。
【权利要求】
1.一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，其特征是该方法包括如下步骤: 1)外植体消毒处理； 2)芽诱导和芽增殖。
2.根据权利要求1所述的一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，其特征是所述的步骤I)外植体消毒处理，具体包括: ①取铁线莲“多变海神”当年生的幼嫩茎节和顶芽； ②依次用自来水冲洗Ih，毛笔来回刷洗20次，于超净工作台上用质量浓度为75%乙醇灭菌20 s,无菌水冲洗2次,之后用质量浓度为0.1%氯化萊灭菌7 min,立即用无菌水冲洗4次； ③用灭菌滤纸吸干外植体表面水分，切除叶柄和两端受伤部位；实验统计的污染率分别为54%、36%，褐化率为44%、35%。
3.根据权利要求1所述的铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，其特征是所述的步骤2)芽诱导和芽增殖，具体包括: ①诱导培养 冲洗后将外植体置于培养皿中，用剪刀、镊子切除叶柄、两端受伤部位后，将芽接种于已灭菌的诱导培养基1/2 MS+生长调节物质NAA 0.5mg/L+生长调节物质TDZ 1.0 mg/L +质量浓度为3%的蔗糖2(T30 g/L +质量浓度为0.7%的琼脂7 g/L，pH值为5.8，培养4周，培养温度25°C，光照16 h/d，照度2400 Ix ； ②不定芽增殖培养 将诱导的丛生芽分成单芽，继而将单芽接入1/2 MS +生长调节物质6-BA 1.0 mg/L +生长调节物质KT 0.5mg/L +生长调节物质NAA 0.5 mg/L +质量浓度为3%的蔗糖20~30g/L +质量浓度为0.7%的琼脂7 g/L的培养基，pH值为5.8，培养4周，温度、光照条件同①丛生芽诱导； ③壮苗培养 将增殖培养基中叶色浓绿、长度为广2 cm的不定芽逐个切下，接入MS基本培养基中培养4星期，光照条件同①丛生芽诱导； ④生根培养 将壮苗培养后长势旺盛的芽接入生根培养基1/2 MS+生长调节物质IBA 0.3 mg/L中，培养40天；温度、光照条件同①丛生芽诱导； ⑤炼苗和移栽 将生根的铁线莲“多变海神”植株的培养瓶瓶盖打开，室温下炼苗6 d后，取出试管苗，洗净，移栽到准备好的由珍珠岩、蛭石、泥炭组成的营养钵中，珍珠岩、蛭石和泥炭间的重量比为1:1:1，保持湿度85%~95%，温度、光照条件同(2)丛生芽诱导，成活率达95%。
4.根据权利要求3所述的一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，其特征是所述的MS基本培养基是由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分所组成。
5.根据权利要求4所述的一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，其特征是所述的大量元素为:硝酸钾KNO3,1900 mg.L_\硝酸铵NH4NO3,1650 mg.L—1，磷酸二氢钾KH2PO4,170 mg.I71，硫酸镁 MgSO4.7 H2O, 370 mg.I71，氯化钙 CaCl2.4 H20,440 mg.L-1 ； 所述的微量元素为:碘化钾ΚΙ，0.83 mg.L-1,硼酸H3BO3，6.2 mg.L—1，或硫酸锰MnS04.4 H2O, 22.3 mg.L- 或硫酸锌 ZnSO4.7 H20,8.6 mg.L-1 或钥酸钠 Na2MoO4.2 H2O,0.25 mg.L-1 硫酸铜 CuSO4.5 H2O, 0.025 mg.L-1 氯化钴 CoCl2.6 H2O, 0.025 mg.L-1 ； 所述的铁盐为:乙二胺二乙酸二钠Na2.EDTA, 37.3 mg.L—1，硫酸亚铁FeSO4.7 H2O,27.8 mg.L -1 ; 所述的有机成分为:肌醇 C6H12O6.2H20,100 mg.L-1，甘氨酸 NH2CH2COOH, 2 mg.L-1，盐酸硫胺素 C12H17C10S.2HC1，0.1 mg.L-1，盐酸吡哆醇 C8H11O3N.HCl，0.5 mg.L-1，烟酸NC5H4COOH, 0.5 mg.L-1
6.根据权利要求3所述的一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，其特征是所述的1/2 MS基本培养基的成分为:大量元素是MS基本培养基的一半，其余成分微量元素、铁盐，有机成分与MS基本培养基有机成分相同。
7.根据权利要求3所述的一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，其特征是所述的生长调节物质6-BA为6-苄基腺嘌呤；NAA为萘乙酸；KT为激动素；ΙΒΑ为吲哚丁酸，TDZ为噻二唑苯基脲。
【文档编号】A01H4/00GK103461130SQ201310428129
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】王磊, 程莹, 方炎明 申请人:江苏农林职业技术学院