来自海岛棉海1与棉花纤维强度有关的分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分子育种【技术领域】，具体涉及来自海岛棉海1与棉花纤维强度有关的分子标记及其应用。所述分子标记为HAU1980240、NAU3177160、CGR5149280、NAU3405220和NAU1325210。本发明有助于克服现有育种技术对纤维品质鉴定存在的不足，能提高纤维强度的选择效率，加快优质纤维新品种的培育进程。
【专利说明】来自海岛棉海1与棉花纤维强度有关的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及棉花分子育种【技术领域】，具体涉及到来自海岛棉海I与棉花纤维强度有关的分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002]棉花是世界上重要的经济作物，棉纤维是重要的纺织工业原料，棉花在我国国民经济中占具重要地位。随着纺织工业的快速发展和人民生活水平的不断提高，对棉花纤维品质的要求也越来越高。我国大面积种植的是陆地棉品种，棉花育种工作者在上世纪80年代前主要集中在产量的提高上，纤维品质的提高没有得到足够的重视，使得我国的棉花品种大多表现为产量高，品质差。进入90年代中后期，纤维品质的育种已成为棉花分子育种的一个重要目标。纤维强度概念纤维强度是指纤维拉断时所能承受的最大负荷。纤维强度是纤维品质性状的一项重要指标。
[0003]海岛棉具有优异的纤维品质，纤维长、强、细，但产量低，而陆地棉产量高，适应性广，但品质差(Percy et al.，2006)。在陆地棉和海岛棉中，陆地棉因产量高，适应性广，被大面积种植，而海岛棉虽然纤维品质好，但产量低而不被广泛种植。因此挖掘海岛棉的优异纤维品质基因，把海岛棉优异纤维品质基因转移到陆地棉背景中，对我国陆地棉纤维品质的提闻有着重要的意义。
[0004]采用传统的育种方法提高陆地棉的纤维比强度，首先要通过陆地棉和海岛棉或亚洲棉等杂交，通过多代的回交，获得具有高强纤维基因渐渗的种质材料，与现有的陆地棉栽培品种杂交，通过多代的回交及自交选择，以打破纤维品质性状与产量性状间的负相关。每个世代需要足够大的选择群体，都要对纤维品质进行测定，而每一世代的选择都需等到棉花吐絮后收取棉花进行纤维品质检测后才能决定，这就导致了育种的群体要大，选择工作量大，成本较高且周期长。而且纤维 品质性状受环境影响较大，使得育种进展缓慢。
[0005]由于传统育种的整个过程中的选择主要是表型选择，这对质量性状而言一般是有效的，但对纤维品质等这样的数量性状来说，则存在准确性差、效率低等许多缺点。要提高选择的效率，理想的方法应该是能够直接对基因型进行选择。
[0006]分子标记辅助选择是借助分子标记对目标性状的基因型直接进行选择，而不必考虑作物生长时期和发育条件，可在早期进行选择，又能减少来自同一位点不同等位基因或不同位点的非等位基因间的相互干扰，有利于快速垒集目标基因，加速回交育种进程，克服不利性状连锁，极大地缩短了育种时间，减少了群体种植规模。分子标记辅助选择对同步改良纤维品质和产量、多性状基因聚合、快速培育棉花新品种等具有无比优越性。现有技术对分子标记筛选做了大量的工作，利用不同的群体进行连锁图谱的构建和重要纤维品质性状的QTL(Quantitative trait loci,简写QTL)筛选,得到了大量的与纤维品质相关的QTL。在海岛棉纤维品质性状的基因挖掘方面，利用不同的陆海杂种群体进行连锁图谱的构建和重要纤维品质性状的QTL筛选，取得了很大研究进展。
[0007]这些研究结果为纤维品质性状的分子标记辅助选择打下了良好的基础，有些QTLs或与之连锁的分子标记已应用于分子标记辅助选择育种中。
[0008]但是，前人的研究中多数是利用分离群体，或只在单个环境下检测得到的结果，因此缺乏可靠性和稳定性，且有些研究最初的目的只是为了进行目标基因的定位，在实验材料的选择上没有考虑和育种材料相结合，还很难应用到育种中。
【发明内容】
[0009]为了克服传统育种中表型选择准确性差、效率低、周期长、成本高等许多缺点，解决纤维品质育种进展缓慢的问题。本发明以生产上大面积种植的陆地棉品种中棉所45和中36为轮回亲本，海岛棉品系海1为供体亲本，构建了两套陆海杂交回交高代棉花染色体片段代换系，并进行了多环境产量和品质性状的评价，为挖掘海岛棉纤维品质性状的QTL、直接培育用于育种的新品系奠定了基础。
[0010]本发明的目的是提供来自海岛棉海I与棉花纤维强度有关的分子标记。
[0011]本发明的再一目的是提供一种陆地棉纤维强度辅助育种方法。
[0012]本发明的再一目的是提供上述来自海岛棉海I与棉花纤维强度有关的分子标记的应用。
[0013]根据本发明的来自海岛棉海1与棉花纤维强度有关的分子标记，所述分子标记为HAU198024(1、NAU3177.、CGR514928(1、NAU3405220 和 NAU1325210，
[0014]其中，各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下:
[0015]①HAU1980240
[0016]正向引物序列为AGTGCAACGGCTTAGGATAC，
[0017]反向引物序列为 GTGGATGAATGAGGCATCTG，可扩增长度为240bp的海I的DNA片段；
[0018]②NAU3177160
[0019]正向引物序列为AGCAAATTGAAAAGCACCTC,
[0020]反向引物序列为 GTCACCCTTTTGCTGTTTTT，可扩增长度为160bp的海I的DNA片段；
[0021]③CGR5149.[0022]正向引物序列为CTACCAAACGCTCCCTTACG，
[0023]反向引物序列为 CGGAATCTTTCAAGGATGGA，可扩增长度为280bp的海I的DNA片段；
[0024]④NAU3405220
[0025]正向引物序列为AATAGCAAAGCCTTCAGTGC，
[0026]反向引物序列为 GAAGTGCAAAAACCGTACCT，可扩增长度为220bp的海I的DNA片段；
[0027]⑤NAU1325210
[0028]正向引物序列为GCTCACACAGATGGAGTTTG,
[0029]反向引物序列为 CCATGGGTATGGATTTCTTC，可扩增长度为210bp的海I的DNA片段。
[0030]根据本发明的与陆地棉纤维强度辅助育种方法，使用SSR标记HAU198024Q、NAU317716(1、CGR514928(1、NAU3405220和NAU132521(I在与海岛棉海I等有关的育种群体中对纤维强度性状进行分子标记选择，可提高陆地棉的纤维强度。该方法所用的分子标记HAU1980240, NAU317716(1、CGR514928(1、NAU3405220 和 NAU132521(I 分别与棉花纤维强度性状的5 个 QTLs:qFS-2_l、qFS-15-l、qFS-16-l、qFS-19-l 和 qFS-22-1 (FS 是纤维强度的英文单词fiber strength的缩写。QTL的命名:q+性状名称英文缩写+染色体序号+同一染色体上控制该性状QTL的顺序编号。如:qFS-2_l表示在第2条染色体上控制纤维强度的第I个QTL。)紧密连锁。这5个纤维强度性状的QTLs:qFS-2_l、qFS-15-l、qFS-16-l、qFS-19-l 和 qFS-22-l，分别位于染色体 Chr2、Chrl5、Chrl6、Chr19 和 Chr22 上，都来源于海岛棉海1，对棉花纤维强度的贡献率分别为4.40-5.70%,6.17-6.41%,6.21-13.60%、5.91-7.89% 和 3.14-6.88%，加性效应分别为 0.87-0.96、1.50-1.50、1.02-1.08、1.59-1.89和 1.04-1.58cN/tex。
[0031]本发明不仅有助于筛选高强纤维材料，为今后海岛棉海I杂交、回交后代及其衍生品系的纤维强度性状育种利用提供了极大的便利，同时也为主效QTL的精细定位及基因
克隆奠定基础。
[0032]使用本发明可以在苗期预测纤维强度的高低并进行淘汰，进而可以快速筛选高强纤维的株系用于棉花纤维品质育种，辅助育种选择目标明确，节约成本。通过与高强纤维性状的QTLs紧密连锁的分子标记在与海岛棉海I等有关的育种群体中的分子标记选择，快速地提高现有陆地棉品种的纤维品质，以克服现有技术存在的上述不足。
[0033]为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现:
[0034]根据本发明的与海岛棉海I相关的陆地棉纤维强度性状提高的分子标记选择方法，使用与海岛棉海I纤维强度性状紧密连锁的SSR标记HAU198024(1、NAU3177.、CGR5149280,NAU3405220和NAU132521(I在与海岛棉海I有关的育种群体中进行分子标记选择，可提高陆地棉棉纤维强度 0.87-0.96 、1.50-1.50、1.02-1.08、1.59-1.89 和 1.04-1.58cN/tex。该方法包括以下步骤:苗期单株提取DNA ;使用分子标记HAU198024(1、NAU317716(|、CGR514928(1、NAU340522(^PNAU132521(i对群体单株的基因型进行分子检测；对检测结果进行分析；选择带有海岛棉海I特征条带的植株，这些中选单株的纤维强度得到不同程度的提高。
[0035]通过这些分子标记选择可获得纤维强度得到提高的陆地棉品种，加速棉花纤维品质的育种进程。
[0036]上述一种提高陆地棉纤维强度性状的分子标记选择方法，所涉及的分子标记是通过以下方法按照下列步骤获得的:
[0037](I)以海岛棉海I为供体亲本、分别以中棉所45和中棉所36为轮回亲本，通过杂交高代回交，连续自交，构建了两套陆海杂交高代回交自交的染色体片段代换系群体:中棉所 45 X 海 IBC4F3:4 和中棉所 36 X 海 1BC5F3:4 ；
[0038](2)以中棉所36X海IBC1F1为作图群体(135个单株)，利用不同来源的23569对SSR引物(引物序列在网站http://www.cottonmarker.0rg免费下载或有关文献中公布)对中棉所36和海I及其F1进行多态性检测，筛选含有海i显性带的引物，多态性引物进一步筛选BC1F1单株群体，获得多态性位点结果，构建覆盖整个基因组的SSR分子连锁图谱；
[0039](3)对332个染色体片段代换系(中棉所45X海IBC4F3:4)，设置2年3个环境(2010安阳、2011年新疆和安阳)的 试验，进行田间农艺性状的调查和纤维品质测定，并提取每个代换系DNA (2011年安阳)，以上述(2)构建的分子连锁图谱为基础，在每条染色体上每5-lOcM选择一个标记，共选择459个标记引物，对染色体片段代换系DNA进行基因型检测；
[0040](4)利用2年3个环境(2010安阳、2011年库尔勒和安阳)的纤维强度性状的表型数据和基因型数据，采用QTL IciMapping V3.2软件(王健康，2009)，进行纤维强度性状的多环境QTL定位分析，获得的2个环境稳定的纤维强度性状的6个QTLs，其中5个QTLs:qFS-2-l、qFS-15-l、qFS-16-l、qFS-19-l 和 qFS-22-l (附表 4)，分别位于染色体 Chr2、Chrl5、Chrl6、Chrl9和Chr22上，增效基因都来源于海岛棉海I，对棉花纤维强度的贡献率分别为 4.40-5.70%,6.17-6.41%,6.21-13.60%,5.91-7.89% 和 3.14-6.88%,加性效应分别为 0.87-0.96、1.50-1.50、1.02-1.08、1.59-1.89 和 1.04-1.58cN/tex ;与这 5 个纤维强度性状的 QTLs 紧密连锁的 SSR 分子标记分别为 HAU198024(1、NAU317716Q、CGR514928(1、NAU340522(i和 NAU132521。。
[0041]各分子标记的引物序列和扩增的目的片段长度如下:
[0042]①HAU1980240
[0043]正向引物序列为AGTGCAACGGCTTAGGATAC，
[0044]反向引物序列为 GTGGATGAATGAGGCATCTG，可扩增长度为240bp的海I的DNA片段。
[0045]②NAU3177160
[0046]正向引物序列为AGCAAATTGAAAAGCACCTC,
[0047]反向引物序列为 GTCACCCTTTTGCTGTTTTT，可扩增长度为160bp的海I的DNA片段。
[0048]③CGR5149.[0049]正向引物序列为CTACCAAACGCTCCCTTACG，
[0050]反向引物序列为 CGGAATCTTTCAAGGATGGA，可扩增长度为280bp的海I的DNA片段。
[0051]④NAU3405220
[0052]正向引物序列为AATAGCAAAGCCTTCAGTGC，
[0053]反向引物序列为 GAAGTGCAAAAACCGTACCT，可扩增长度为220bp的海I的DNA片段。
[0054]⑤NAU1325210
[0055]正向引物序列为GCTCACACAGATGGAGTTTG,
[0056]反向引物序列为 CCATGGGTATGGATTTCTTC，可扩增长度为210bp的海I的DNA片段。
[0057]本发明的有益效果如下:
[0058]本发明提供了一种提高陆地棉纤维强度性状的分子标记选择方法，使用分子标记HAU198024Q、NAU317716(1、CGR514928(1、NAU3405220 和 NAU132521(I 在与海岛棉海 I 有关的育种群体中进行分子标记选择，可提高纤维强度0.87-0.96、1.50-1.50、1.02-1.08、1.59-1.89和
1.04-1.58cN/tex。
[0059]使用这些分子标记可以在棉花苗期进行选择，提高纤维强度性状的选择效率。本发明不但有助于解决我国棉花纤维品质育种进展缓慢的问题，而且有助于克服现有育种技术对纤维品质鉴定存在的成本高、时间长、稳定性低、准确性差、效率低等不足，快速地提高现有陆地棉品种的纤维品质，大大加快我国高优质纤维新品种的培育与种子产业化进程。
【专利附图】
【附图说明】
[0060]图1为来源于海岛棉海I纤维强度性状的5个QTLs在连锁图上的位置。qFS_2_l、qFS-15-U qFS-16-U qFS-19-l 和 qFS-22-l 分别位于染色体 Chr2、Chrl5、Chrl6、Chrl9 和Chr22 上，分别与 SSR 分子标记 HAU198024(1、NAU317716(1、CGR514928(1、
[0061]NAU3405220 和 NAUl32521c1 紧密连锁。[0062]FS是纤维强度的英文单词fiber strength的缩写。
[0063]QTL的命名:q+性状名称英文缩写+染色体序号+同一染色体上控制该性状QTL的顺序编号。如:qFS-2_l表示在第2条染色体上控制纤维强度的第I个QTL。
【具体实施方式】
[0064]下面通过具体实施例方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
[0065]实施例1筛选分子标记
[0066](I)染色体片段代换系的构建及表型数据的获得
[0067]以海岛棉海I为供体亲本、以中棉所45和中棉所36为轮回亲本，构建了两套陆海杂交高代回交的染色体片段代换系群体。轮回亲本中棉所36 (CCRI36)是中国农业科学院棉花研究所培育的早熟的优异的陆地棉推广品种(国审棉990007)，中棉所45 (国审棉2003002)是中国农业科学院棉花研究所培育的具有高产抗倒伏、耐黄萎病特性中熟品种，而供体亲本海I (Hail)是带有显性无腺体基因的高抗黄萎病的海岛棉栽培种。
[0068]2003年夏在河南安阳分别以陆地棉中棉所45和中棉所36为受体亲本，海岛棉海I为供体亲本杂交产生F1,同年冬季在海南三亚分别以中棉所45和中棉所36为母本回交得BC1F1 ；2004年夏在河南安阳种植BC1F1，利用这些单株为父本，轮回亲本中棉所45和中棉所36为母本杂交，按照父本单株号混收杂交铃，获得116个中棉所45 X海IBC2F1株系和133个中棉所36 X海IBC2F1株系杂交种子。
[0069]2005年夏在河南安阳种植中棉所45X海I的116个BC2F1株系和133个中棉所36 X海IBC2F1株系，每个株系种植I行，行长5m，行宽80cm，株距25cm，苗期拔除有腺体植株，每行保证20株苗，同时每10个系种植轮回亲本I行，以轮回亲本为父本，继续回交，按家系混收种子。
[0070]2006年夏在河南安阳种植中棉所45X海I的116个BC3F1家系及中棉所45，种植及杂交方式与2005年相同；2007年在河南安阳种植116个BC4F1家系，每个家系种I行，每20个株系种植I行中棉所45作为对照，行长5m，株距25cm，按家系收取自然铃获得BC4F2 ；2008年在安阳种植116个BC4F2家系，种植方式与2007年相同，按家系收取自然铃获得BC4F3。2009年种植116个BC4F3家系(每个家系I行约20株，共2328株)，按单株收取自然铃，测定纤维品质，纤维样送中国农业部纤维品质检验监督检测中心以HVI1000测定纤维的上半部平均长度、整齐度、马克隆值、伸长率和断裂比强度(简称强度)。获得2328个BC4F3单株纤维品质数据。按照每个家系选择2-4株的原则，共选择332个BC4F3单株，2010年在河南安阳种成BC4F3:4株行，行长5m，行宽80cm，株距25cm，对株行进行常规田间调查和纤维品质测定。对获得的332个株系于2011年设置2环境(河南安阳、新疆库尔勒)试验，田间种植采用地膜覆盖的方式播种，安阳单行区两重复种植，行长5m，行宽80cm，株距25cm，新疆库尔勒2行区两重复种植，行长3m，行距按新疆当地宽窄行设置，株距为10cm。对株系按照小区进行常规田间调查和纤维品质测定。获得了 2年3个环境的纤维品质的数据(附表2和附表3)。
[0071]表13个环境中染色体片段代换系纤维强度性状描述性统计分析
[0072]
【权利要求】
1.来自海岛棉海I与棉花纤维强度有关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为HAU198024(1、NAU3177.、CGR514928(1、NAU3405220 和 NAU1325210， 其中，各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下:
① HAU1980240 正向引物序列为 AGTGCAACGGCTTAGGATAC， 反向引物序列为GTGGATGAATGAGGCATCTG，可扩增长度为240bp的海I的DNA片段； (2)NAU3177160 正向引物序列为 AGCAAATTGAAAAGCACCTC， 反向引物序列为GTCACCCTTTTGCTGTTTTT，可扩增长度为160bp的海I的DNA片段； ③CGR5149.正向引物序列为 CTACCAAACGCTCCCTTACG， 反向引物序列为CGGAATCTTTCAAGGATGGA，可扩增长度为280bp的海I的DNA片段；
④NAU340522(i 正向引物序列为 AATAGCAAAGCCTTCAGTGC， 反向引物序列为GAAGTGCAAA`AACCGTACCT，可扩增长度为220bp的海I的DNA片段；
⑤NAU1325210 正向引物序列为 GCTCACACAGATGGAGTTTG， 反向引物序列为CCATGGGTATGGATTTCTTC，可扩增长度为2IObp的海I的DNA片段。
2.—种陆地棉纤维强度辅助育种方法,其特征在于， 该方法包括以下步骤: (1)DNA提取，使用与海岛棉海I纤维强度性状紧密连锁的分子标记HAU198024Q、NAU317716(1、CGR514928(1、NAU3405220和NAU132521(I对群体单株的基因型进行分子检测； (2)对检测结果进行分析，选择带有海岛棉海I特征条带的植株，获得纤维强度得到提闻的陆地棉品种， 其中，所述与海岛棉海I纤维强度性状紧密连锁的分子标记HAU198024(1、NAU3177.、CGR5149280,NAU3405220和NAU1325210的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下:
① HAU1980240 正向引物序列为 AGTGCAACGGCTTAGGATAC， 反向引物序列为GTGGATGAATGAGGCATCTG，可扩增长度为240bp的海I的DNA片段；
(2)NAU3177160 正向引物序列为 AGCAAATTGAAAAGCACCTC, 反向引物序列为GTCACCCTTTTGCTGTTTTT，可扩增长度为160bp的海I的DNA片段； ③CGR5149.正向引物序列为 CTACCAAACGCTCCCTTACG， 反向引物序列为CGGAATCTTTCAAGGATGGA，可扩增长度为280bp的海I的DNA片段；
④NAU340522(i 正向引物序列为 AATAGCAAAGCCTTCAGTGC， 反向引物序列为GAAGTGCAAAAACCGTACCT，可扩增长度为220bp的海I的DNA片段；⑤NAU1325210正向引物序列为 GCTCACACAGATGGAGTTTG，反向引物序列为CCATGGGTATGGATTTCTTC，可扩增长度为2IObp的海I的DNA片段。
3.权利要求1所述来自海岛棉海I与棉花纤维强度有关的分子标记在棉花育种中的应 用。
【文档编号】A01H1/04GK103497949SQ201310481269
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】袁友禄, 石玉真, 马留军, 兰孟焦, 杨泽茂, 张金凤, 张保才, 李俊文, 刘爱英, 王涛, 龚举武, 商海红, 巩万奎 申请人:中国农业科学院棉花研究所