直接速冻蜂巢从冷冻虫体内获取天然生物毒素的方法
【专利摘要】本发明涉及一种直接速冻蜂巢从冷冻虫体内获取天然生物毒素的方法。具体是指用不高于-20℃的冷冻剂对膜翅目细腰亚目针尾部昆虫的巢和虫体进行直接冷冻，从冷冻状态下提取的毒素类活性物质保持天然结构，可以用于制备抗病毒、抗菌、抗风湿、抗肿瘤、抗心脑血管疾病的药物、日化用品和医疗器械。本发明方法是适用于蜜蜂总科和胡蜂总科中的长腹胡蜂科、铃腹胡蜂科、异腹胡蜂科、狭腹胡蜂科、马蜂科、胡蜂科、蚁科等膜翅目昆虫的安全采毒关键技术。本关键技术能解决蜜蜂和胡蜂总科蜂毒采集中瓶颈问题，具有显著的经济价值，可满足市场短缺和采毒创新技术的不足。
【专利说明】直接速冻蜂巢从冷冻虫体内获取天然生物毒素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药【技术领域】，具体而言，本发明涉及一种用等于或低于零下20°C的冷冻剂对蜜蜂和胡蜂等膜翅目细腰亚目针尾部蜂类昆虫的蜂巢和虫体进行直接迅速冷冻，并从冷冻状态下的虫体中获取毒素类活性物质的生物医药取毒方法。是普适于膜翅目细腰亚目针尾部蜂类昆虫，包括但不限于蜜蜂总科和胡蜂总科中的长腹胡蜂科、铃腹胡蜂科、异腹胡蜂科、狭腹胡蜂科、马蜂科、胡蜂科的安全釆毒关键技术。
【背景技术】
[0002]膜翅目(Hymenoptera)，细腰亚目(Apocrita)，针尾部(Aculeata)昆虫有胡蜂总科(Vespoidea)、泥蜂总科(Sphecoidea)和蜜蜂总科(Apoidea)等3个总科的数万种蜂类昆虫，该蜂类昆虫的职蜂大都带有毒囊与螯针，能分泌富含生物活性的蜂毒类生物毒素。
[0003]蜂毒是具有高度生物学活性和药理学活性的复杂混合物。胡蜂毒不仅具有过敏性，且可以造成血纤维蛋白溶解作用、对骨骼肌的破坏、神经系统症状和视觉障碍引发的过敏性休克等(Lombardini，C 等，Am J Emerg Medj 2009，153:131-135 ;Patriarca，G等，Intl J Immunopathol Pharmacol, 2008,21:669-677 ；SchuItze-Werninghausj C等，Pediatr Allergy Immunol, 1999，10:133-137 ;Puchalska_Niedbal，L 等，Ann AcadMed Stetin，2007，53Suppll:90-93 ;Rocha，T 等，Toxicon，2007，50:589-599);胡蜂毒还显示对心血管、降压、抗菌、抑制乙酰胆碱酯酶等许多有前景的生理活性(Rubin，Y等，Cardiovascular haemodynamics of oriental hornet venom sac extract, PharmacolToxicol， 1993，72:268-272 ;Ho，CL 等，Structures and biological activities of newwasp venom peptides isolated feom the black-bellied hornet(Vespa basalis)venom.Toxicon, 1998，36:609-617 ;Konno，K 等，Molecular determinants of bindingof a wasp toxin (PMTXs) and its analogs in the Na+channels proteins.NeurosciLett，2000，285:29-32 ;Ho，CL 等，Enhancing the hypotensive effect and diminishingthe cytolytic activity of hornet mastoparan B by D—amino acid substitution，Toxicon, 2001，39:1561-1566 ;Dami，MP 等，Antibacterial and proteolyticactivity in venom from the endoparasitic wasp Pimpla hypochondriaca(Hymenoptera:1chneumonidae)，J Insect Physiol，2003，49:945-954 ;Wang，几等，Isolatedprolongation of activated partial thromboplastin time following wasp sting, ActaPaediatr Taiwan，2005，46:164-165 ;Abt，M 等，Characterization of phenoloxidaseactivity in venom from the ectoparasitoid Nasonia vitripennis(Walker)(Hymenoptera:Pteromalidae).J Invertebr Pathol, 2007，94:108-118 ;Polsinelli，GA等，Insect-specific irreversible inhibitors of acetylcholine-esterase inpests including the bed bug,the eastern yellowjacket, German and Americancockroaches, and the confused flour beetle, Chem Biol Interact，2010，187:142—147 ;Ye，J 等，A defensin antimicrobial peptide from the venoms of Nasonia vitripennis,Toxicon, 2010, 56:101-106)。
[0004]我国南部分布着大量的胡蜂种群，胡蜂是膜翅目细腰亚目针尾部胡蜂总科昆虫的总称，世界上已知有5000多种，中国记载的有200余种，在中国分布甚广。胡蜂毒在国际市场上的售价居高不下，国外基本垄断了其研究和关键技术。开发蜂毒系列产品，对于我国战略性新兴产业的发展，以及增进山区养殖户的经济收入、脱贫都具有重要意义。广阔的医药前景也给蜂毒采集工作者带来了机遇和挑战。如何采取得到大量的、质量可控的胡蜂蜂毒是摆在我国科研工作者面前的关键技术之瓶颈。我国目前常见的采取蜂毒的模式是:用捕捉到的职蜂取毒囊分离出蜂毒；或者用电脉冲法刺激职蜂用尾针蛰刺取毒器上的玻璃板，将蜂毒留在取毒器玻璃板上，再予以收集。
[0005]蜜蜂是膜翅目细腰亚目针尾部蜜蜂总昆虫的通称，全世界已知约1.5万种，中国已知约1000种。中华蜜蜂(中蜂)、意大利蜂(意蜂)、东北黑蜂、伊犁黑蜂、卡尼鄂拉蜂、高加索蜂等几种蜜蜂为重要的资源昆虫。蜜蜂蜂毒中含有蜂毒肽、蜂毒明肽、肥大细胞脱颗粒肽、心脏肽等，对神经系统、心血管系统和免疫系统等分别发挥不同的药理作用，有很大的医药价值。2013年3月美国华盛顿大学公开了蜜蜂蜂毒能够杀死HIV病毒而不伤害正常组织细胞，更是强化了蜂毒类生物活性物质对于未来解除疾病折磨的可能性。然而，我国相关蜂毒采集工作仍是使用上述常规的电动脉冲采毒器，蜂群由于受到的刺激信息不足，攻击意愿并不强烈，造成采毒效率不能达到最高水平。由是观之，随着蜂毒类活性物质的生物医药用途日益增多，对蜂毒的需求将会几何级别的增长，因而，走在世界前面，率先在我国进一步加强蜂毒采集的技术攻关是十分必要的。
[0006]从我国专利技术发展的历史看，李光宏和黄世梅在1986年申请了实用新型专利《封闭式蜜蜂蜂毒采集器》(CN85203663U) ；1989年李铁生和郭凡修共同申请了实用新型专利《电动闪光型胡蜂蜂毒自动`采集器》(CN2037925U);其中描述了使用红白光束诱使胡蜂排毒的一种仪器。1994年徐文龙等申报的实用新型专利《继箱型蜂毒采集器》(CN2168397Y)，其原理也是基于通过电流使蜜蜂进入尺寸形状与蜂箱之继箱一致的采毒箱进行毒液收集。2000年张金华设计的实用新型《速冻式蜂毒原液采集器》(CN2391418Y)，其特色是采用液氮冷冻室避免了采集过程中蜂毒的挥发。2006年，杨雷等公开了一种《自动采集蜂毒的方法及装置》(CN1714631A)，描述了由电源、自动控制器、收集器组成的采集蜂毒的装置；2007年，张文礼等设计并申请了实用新型专利《副盖式蜜蜂电子取毒器》(CN2927685Y):主要是发明了将取毒板面向下朝向蜂箱，避免了空气中尘埃和杂质落在采毒的面板上，保证了蜂毒的纯度。
[0007]但是，上述方法都无法解决胡蜂蜂毒采毒过程中遭遇到的无法控制胡蜂群攻击的强烈程度，取毒量小，浪费大，毒素采集成本居高不下等问题。再者，已公开的许多方法都是仅适用于蜜蜂(尤其是中华蜜蜂、意大利蜂)毒素的采集，而不适用于攻击性较强的胡蜂总科的昆虫采毒。受到惊吓或者意识到危险的胡蜂群对人体的攻击几乎是快速而致命、难以逃脱的。因此，野外取毒时，工作人员需要在全身穿戴严密的专业防护服的情况下完成采毒任务，在炎热的地带采毒是一项十分艰巨的工作，十分容易发生脱水、虚脱、流汗遮掩视线造成操作失误等危险。并且，采集蜂毒时由于蜂群大量攻击穿戴防护服的工作人员，造成宝贵的蜂毒大量浪费在无法回收收集蜂毒的防护服上。况且，采集到的蜂毒，如在外部空间开放式放置一段时间后，蜂毒成分开始发生微妙的生理生化变化，易造成蜂毒减效和失效。然而，如何创造一种有效的采集蜂毒的关键技术，使之既可以避免采毒人员的危险，又能够有效解决并提高价值较高的胡蜂蜂毒采集量，使采集或者养殖一窝胡蜂可以得到更多的蜂毒量，扩大农村山区养殖户的单产量及收入，增加山区贫困养殖户的脱贫数量，进一步满足重大疾病治疗对于蜂毒的不断增长的市场需求，以往已有的报道及经验尚十分缺乏。而市场是急需一批创新性的养殖和采集蜂毒技术的集合及综合应用的。
[0008]再者，以往许多采毒者是应用将蜂体窒息杀死，再剥取蜂体毒囊取毒的方法。该方法缺陷在于:蜂体活体常温下解剖时，毒液容易沾染在毒囊壁上；且毒囊很容易被挤破而造成流失等导致的不必要的蜂毒物理损失。再者，长时间操作未冷冻蜂体时，死去的蜂体毒囊中的蜂毒类生化物质易发生变质、蛋白变性、多肽氧化等不利情况，不利于蜂毒大分子的原始结构保存。
[0009]因此，如何巧妙地应用现代昆虫生理学特性，结合生物冷冻技术不破坏多肽类3维空间结构等生物学特征，结合完全的蜂体解剖技术手段，将蜂巢中的蜂群一网打尽，提供一个几乎无危险的环境以允许细心操作，发掘出新的足量的蜂毒，是迫在眉睫的。基于此，本发明人经过长期艰苦而危险的多批次实验，最终找出能够使蜂群迅速冷冻失去行动能力、同时保持了蜂毒活性肽的原始结构、使每窝蜂巢采毒量迅速有效增加的组合式关键技术方法。本方法同时适用于胡蜂总科和蜜蜂总科的蜂毒采集工作。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种从膜翅目细腰亚目针尾部蜂类昆虫体内获取生物毒素活性物质的方法；其特征是:该类活性物质是从速冻的蜂巢中的冷冻蜂类昆虫体内取出的，具体而言，是从迅速冷冻条件下的昆虫体内的毒囊中取出的。
[0011]其中，膜翅目 细腰亚目针尾部蜂类昆虫是指膜翅目细腰亚目针尾部中的胡蜂总科(Vespoidea)、泥蜂总科、蜜蜂总科(Apoidea)昆虫；优选蜜蜂总科中的中华蜜蜂(中蜂)、意大利蜂(意蜂)和胡蜂总科中的长腹胡蜂科、铃腹胡蜂科、异腹胡蜂科、狭腹胡蜂科、马蜂科、胡蜂科昆虫。
[0012]本发明的再一目的是提供了一种适用于采取昆虫生物毒素的冷冻剂，具体是指工业制冷剂液态二氧化碳、干冰、液氮、液氦中的一种或多种制成的或者联合使用的、能使昆虫在低温下失去攻击能力的冷冻剂。
[0013]本发明的再一目的是提供了一种取毒技术，也即使用上述冷冻剂喷灌、喷淋、浇灌形式对蜜蜂巢和胡蜂巢进行冷冻后，打开蜜蜂巢或者胡蜂巢，对已经冷冻的蜜蜂或者胡蜂的毒囊进行摘取分离而得到毒素类活性物质。
[0014]本发明的又一目的是提供了一种从膜翅目昆虫胡蜂和蜜蜂中得到具有经济效益的蜂毒类活性物质，作为制药企业使用的原料药物。
[0015]发明人长期观察后发现:一般来说，在遇到空气气温降低的情况下，胡蜂蜂群会逐渐减少活动强度，蜷曲不动，而本冷冻剂速冻技术就是能快速使整个蜂巢降温，在职蜂能够开展攻击之前使之进入类似冬眠状态，直至完全失去出巢攻击能力；同时，大量惰性气体或二氧化碳使蜂类昆虫窒息。进一步的冷冻，会使得整个蜂巢中的蜂王、职蜂蜂体均变成坚硬的虫体，使得胡蜂毒囊和蜜蜂毒囊很容易用手术刀予以剥离，不沾染周边其他组织残留；使得职蜂的毒液全部在保留于毒囊的情况下就被采集得到；采毒量大大增加。[0016]本发明人将上述对蜜蜂和胡蜂群快速冷冻技术和手术剥离毒囊技术有机地结合起来，作为采集蜜蜂和胡蜂蜂毒的关键技术，从而发明了创新性的“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术。发明人团队发现:在使用同一蜂群、同一取毒器、同一取毒电压、同一采毒操作员的情况下，用迅速冷冻蜂巢法获取胡蜂和蜜蜂毒类活性物质时，能使蜜蜂毒采毒量比仅仅使用常规采毒器法采毒量提高34±8% ;胡蜂蜂毒采集量提高了 38±7% ;行之有效地实现了单次取毒得到的蜜蜂或胡蜂毒素产率得到有效提高，且保证了采集蜂毒的质量不受外界采毒器的污染和干扰。该取毒效果属于意想不到的发现。该关键技术对于贫困山区胡蜂养殖农民有着显著的经济效益和推广应用前景。本发明人经查新发现，以往国内外专利及文章专著中均无使用“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术综合作业采集膜翅目昆虫生物毒素的相关报道。该生理生物采毒技术具有确切的新颖性和创造性，从而构成本发明。
[0017]本发明的关键技术及其有益之处在于:使用冷冻剂对蜂巢整体实施冷冻简单易行，但是非常有效。巢中昆虫保留了所有生物毒素于虫体毒囊中；而用手术刀剥离冻硬的冷冻毒囊时，又避免了活体未冷冻时毒液容易沾染于毒囊壁、容易被挤破而造成的毒素类活性物质物理损失。同时还避免了未冷冻条件下长时间操作蜂体时，死去的蜂体毒囊中的蜂毒类生化物质在常温下发生变质、蛋白变性、多肽氧化的不利情况，保证了蜂毒大分子的原始结构。可用于膜翅目胡蜂总科中的长腹胡蜂科、铃腹胡蜂科、异腹胡蜂科、狭腹胡蜂科、马蜂科、胡蜂科以及蜜蜂总科中的中蜂和意蜂等蜂类昆虫毒素的采集。夜晚和白天均可对蜂群进行蜂毒采集工作。具有显著的经济价值，满足市场的短缺和采毒创新技术的不足。本发明中的技术及方法使用的原料来源方便易得，制备步骤简便，利于产业化。更为重要的是:对于开发市场广大的生物毒素药物提供了物质基础来源，以及提供了创新性地获取蜜蜂和胡蜂毒素的普适关键技术。通过规范化养殖胡蜂及采毒又能给连片特困地区的农民增加收入、脱贫，具有显著的巨大社会效益和经济效益。
具体实施方案
[0018]为了更好地理解本发明的实质，下面分别用对意大利蜜蜂和胡蜂总科中的长腹胡蜂科、铃腹胡蜂科、异腹胡蜂科、狭腹胡蜂科、马蜂科、胡蜂科的膜翅目昆虫进行毒素采集的实验结果，说明本发明中的“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术关键技术在生物毒素研发领域中的应用和功效。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
[0019]实施例1:胡蜂科金黄虎头蜂Vespa mandarinia Smith的“冷冻剥离毒囊全面采毒”试验1.1采集胡蜂毒地点:云南德宏州梁河县境内高山，海拔1382米，林中。蜂体标本据云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心毛本勇教授鉴定为Vespamandarinia Smith (金环胡蜂,又名金黄虎头蜂)。
[0020]1.2采集胡蜂毒装置:冷冻剂(液氮)储藏罐、耐低温加压泵及喷头、低温手术室(室温为4摄氏度的冷屋)、手术剪、手术刀、手术镊子、棕色玻璃瓶、大镊子、Tris-Buffer缓冲液。
[0021]1.3采集胡蜂毒方法:穿戴防护服的情况下，将接上耐低温加压泵的液氮罐提至蜂巢旁边，打开长柄喷雾·器的开关，将液氮对准蜂巢职蜂的出口处喷洒，阻碍职蜂的出洞攻击。随着准备出洞的职蜂消失，加大液氮喷淋力度，将喷口堵在蜂巢巢穴出口进行喷淋，大约10分钟后，蜂巢急剧降温。至确认无职蜂活动时，逐步打开蜂巢，挑拣已被迅速冷冻的蜂体。将职蜂蜂体在低温手术室中进行深度冷冻(浸入液氮中20秒左右)。用手术剪减去蜂腹(含全部毒囊)，用手术刀对剖开蜂腹，用手术镊子夹出整个毒囊。剥去囊壳，将呈冷冻状态的蜂毒颗粒放置入装有低温Tris-Buffer缓冲液的棕色瓶中。
[0022]1.4实验结果与说明:经梅特勒十万分之一电子天平称重，采取的523头职蜂中共获得蜂毒1472晕克。
[0023]实施例2:胡蜂科金黄虎头蜂Vespa mandarinia Smith的常规米毒试验
[0024]2.1采集胡蜂毒地点:与实施例1.1项下的蜂巢距离为2.1公里处，大小及生长状态环境相似的一窝金黄虎头蜂。蜂体标本据云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心毛本勇教授鉴定为Vespa mandarinia Smith(金环胡蜂,又名金黄虎头蜂)。
[0025]2.2采集胡蜂毒装置:使用本工程研究中心改装的同一批次的副盖式蜂毒采集器，木框，长80公分，宽50公分；内嵌4片长20公分/宽33公分取毒玻璃；输入电压12V,输出自动间歇脉动电压。
[0026]2.3采集胡蜂毒方法:将采毒器置于蜂巢前，按照常规采毒规程，打开取毒器电源开关，敲击地面及蜂巢口，吸引胡蜂出来攻击蜂毒采集器。30分钟后，关闭电源，扫掉不再排毒的金黄虎头蜂，收集玻璃板上的蜂毒，装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。
[0027]2.4实验结果与说 明:本次使用常规采毒法采集得到的金黄虎头蜂蜂毒为830毫克。比第一次实施“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术时(实施例1)获取蜂毒量降低了 43.7% ；差别显著。本发明所有实施例都是在严格控制变量的基础上进行的。实施例中各实施之实验所采取之胡蜂毒均经过《药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心》质检室进行HPLC (Agilentl200)指纹图谱检测，SDS-PAGE电泳检测。实施例1和2获得之胡蜂毒均属于品质相同的金黄虎头蜂蜂毒。
[0028]实施例3:马蜂科黄裙马蜂(Polistes sagittarius Saussure)的常规采毒与“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采毒所得蜂毒量的比较试验
[0029]3.1实验地点:云南文山州富宁县。2窝黄裙马蜂相距1.9公里左右。山林中。蜂体标本经云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心杨自忠教授鉴定为马蜂科黄裙马蜂(Polistes sagittarius Saussure)。
[0030]3.2常规采毒装置及方法:采集胡蜂毒装置同实施例2中2.2所述，使用本工程研究中心改装的同一批次的副盖式蜂毒采集器，木框，长80公分，宽50公分；内嵌4片长20公分/宽33公分取毒玻璃；输入电压6V,输出自动间歇脉动电压。将米毒器置于蜂巢前，按照常规采毒规程，打开取毒器电源开关，敲击地面及蜂巢口，吸引胡蜂出来攻击蜂毒采集器。30分钟后，关闭电源，扫掉不再排毒的黄裙马蜂，收集玻璃板上的蜂毒，装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。得到黄裙马蜂蜂毒82毫克。
[0031]3.3 “冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采毒装置及方法:同实施例1。其关键技术是:用液态二氧化碳进行速冻喷淋；按照实施例1中1.3所述操作程序收集冷冻后毒囊中的黄裙马蜂蜂毒，精制后装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。得到黄裙马蜂蜂毒111晕克。
[0032]3.4实验结果与说明:使用“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采集黄裙马蜂毒素比常规采毒法得到的黄裙马蜂毒素重量高出35.4%。说明使用“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采集马蜂科昆虫毒素有着较大的先进性和实I用性。
[0033]实施例4:铃腹胡蜂科带铃腹胡蜂(Popalidia fasciata Fabricius)的常规采毒与“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采毒所得蜂毒量的比较试验
[0034]4.1实验地点:云南省文山州广南县那伦乡。2窝带铃腹胡蜂相距1.6公里左右。海拔908公尺公路边山林中。标本经云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心杨自忠教授鉴定为膜翅目铃腹胡蜂科带铃腹胡蜂(Popalidia fasciataFabriciusX
[0035]4.2常规采毒装置及方法:采集胡蜂毒装置同实施例2中2.2所述，使用本工程研究中心改装的同一批次的副盖式蜂毒采集器，木框，长80公分，宽50公分；内嵌4片长20公分/宽33公分取毒玻璃；输入电压6V,输出自动间歇脉动电压。将米毒器置于蜂巢前，按照常规采毒规程，打开取毒器电源开关，敲击地面及蜂巢口，吸引胡蜂出来攻击蜂毒采集器。30分钟后，关闭电源，扫掉不再排毒的带铃腹胡蜂，收集玻璃板上的蜂毒，装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。得到带铃腹胡蜂蜂毒36毫克。
[0036]4.3 “冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采毒装置及方法:同实施例1。其关键技术是:用液态二氧化碳对带铃腹胡蜂蜂巢进行速冻喷淋；按照实施例1中1.3所述操作程序收集冷冻后带铃腹胡蜂毒囊中的蜂毒，精制后装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。得到带铃腹胡蜂蜂毒51毫克。
[0037]4.4实验结果与说明:使用“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采集带铃腹胡蜂毒素比常规采毒法得到的带铃腹胡蜂毒素重量高出41.7%。说明使用“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采集铃腹胡蜂科昆虫毒素有着较大的先进性和实用性。
[0038]实施例5:异腹胡蜂科变侧异腹胡蜂(Parapolybia varia varia Fabricius)的常规采毒与“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采毒所得蜂毒量的比较试验
`[0039]5.1实验地点:云南省文山州麻栗坡县。2窝变侧异腹胡蜂相距2.1公里左右。海拔690~720公尺公路边山林中。蜂体标本经云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心杨自忠教授鉴定为膜翅目异腹胡蜂科变侧异腹胡蜂(Parapolybia variavaria Fabricius)。
[0040]5.2常规采毒装置及方法:采集胡蜂毒装置同实施例2中2.2所述，使用本工程研究中心改装的同一批次的副盖式蜂毒采集器，木框，长80公分，宽50公分；内嵌4片长20公分/宽33公分取毒玻璃；输入电压6V,输出自动间歇脉动电压。将米毒器置于蜂巢前，按照常规采毒规程，打开取毒器电源开关，敲击地面及蜂巢口，吸引胡蜂出来攻击蜂毒采集器。30分钟后，关闭电源，扫掉不再排毒的变侧异腹胡蜂，收集玻璃板上的蜂毒，装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。得到变侧异腹胡蜂蜂毒65毫克。
[0041]5.3 “冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采毒装置及方法:同实施例1。其关键技术是:用液态二氧化碳对变侧异腹胡蜂蜂巢进行速冻喷淋；按照实施例1中1.3所述操作程序收集冷冻后变侧异腹胡蜂毒囊中的蜂毒，精制后装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。得到变侧异腹胡蜂蜂毒91毫克。
[0042]5.4实验结果与说明:得到实验结果显示，使用“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采集变侧异腹胡蜂毒素比常规采毒法得到的变侧异腹胡蜂毒素重量高出40.0%。说明使用“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采集异腹胡蜂科昆虫毒素有着较大的先进性和实用性。
[0043]实施例6:狭腹胡蜂科光全狭腹胡蜂(Holischnogaster micans Saussure)的常规采毒与“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采毒所得蜂毒量的比较试验
[0044]6.1实验地点:云南省孟连县勐马镇。2窝光全狭腹胡蜂相距2.2公里左右。海拔961~990公尺乡村道路路边山林中。蜂体标本经云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心郭云胶教授鉴定为膜翅目狭腹胡蜂科光全狭腹胡蜂(Holischnogaster micans Saussure)。
[0045]6.2常规采毒装置及方法:采集胡蜂毒装置同实施例2中2.2所述，使用本工程研究中心改装的同一批次的副盖式蜂毒采集器，木框，长80公分，宽50公分；内嵌4片长20公分/宽33公分取毒玻璃；输入电压6V,输出自动间歇脉动电压。将米毒器置于蜂巢前，按照常规采毒规程，打开取毒器电源开关，敲击地面及蜂巢口，吸引光全狭腹胡蜂出来攻击蜂毒采集器。30分钟后，关闭电源，扫掉不再排毒的光全狭腹胡蜂，收集玻璃板上的蜂毒，装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。得到光全狭腹胡蜂蜂毒23毫克。
[0046]6.3 “冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采毒装置及方法:同实施例1。其关键技术是:用液氮对光全狭腹胡蜂蜂巢进行速冻喷淋；按照实施例1中1.3所述操作程序收集冷冻后光全狭腹胡蜂毒囊中的蜂毒，精制后装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。得到光全狭腹胡蜂蜂毒32毫克。
[0047]6.4实验结果与说明 :使用“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采集光全狭腹胡蜂毒素比常规采毒法得到的光全狭腹胡蜂毒素重量高出39.1%。说明使用“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采集狭腹胡蜂科昆虫毒素有着较大的先进性和实用性。
[0048]实施例7:意大利密蜂(Apis mellifera ligustica Spinola)的常规采毒与“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采毒所得蜂毒量的比较试验
[0049]7.1实验地点:云南省曲靖市罗平县。2窝意大利蜜蜂相距3公里左右。海拔955~968公尺乡村道路路边油菜花地中。蜂体标本经云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心毛本勇教授鉴定为膜翅目意大利蜜蜂(Apis mellifera ligusticaSpinolaX
[0050]7.2常规采毒装置及方法:采集蜜蜂毒装置同实施例2中2.2所述，使用本工程研究中心改装的同一批次的副盖式蜂毒采集器，木框，长80公分，宽50公分；内嵌4片长20公分/宽33公分取毒玻璃；输入电压3V,输出自动间歇脉动电压。将米毒器置于意大利蜜蜂蜂巢前，按照常规采毒规程，打开取毒器电源开关，敲击蜂巢，吸引蜜蜂出来攻击蜂毒采集器。30分钟后，关闭电源，扫掉不再排毒的意大利蜜蜂，收集玻璃板上的蜂毒，装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。得到蜜蜂蜂毒26毫克。
[0051]7.3 “冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采毒装置及方法:同实施例1。其关键技术是:用液氮对意大利蜜蜂蜂巢进行速冻喷淋；按照实施例1中1.3所述操作程序收集冷冻后意大利蜜蜂毒囊中的蜂毒，精制后装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。得到蜜蜂蜂毒35毫克。
[0052]7.4实验结果与说明:使用“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采集意大利蜜蜂毒素比常规采毒法得到的意大利蜜蜂毒素重量高出34.6%。说明使用“冷冻剥离毒囊全面采毒”技术采集蜜蜂总科昆虫毒素有着较大的先进性和实用性。[0053]在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合·，或改进。
【权利要求】
1.一种获取毒素类活性物质的方法；其特征是:该类活性物质是从冷冻条件下的膜翅目细腰亚目针尾部蜂类昆虫体内的毒囊中取出的；其中，膜翅目细腰亚目针尾部蜂类昆虫是指膜翅目Hymenoptera中的细腰亚目Apocrita之针尾部Aculeata的胡蜂总科Vespoidea、泥蜂总科Sphecoidea、蜜蜂总科Apoidea昆虫。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于冷冻条件是指用或低于摄氏零下20度的冷冻剂对膜翅目细腰亚目针尾部蜂类昆虫的蜂巢和虫体进行直接冷冻，从而使虫体丧失活动能力，避免了对取毒人的攻击而得以实现。
3.根据权利要求2的方法，其特征为所述的冷冻剂是指工业制冷剂液态二氧化碳、干冰、液氮、液氦中的一种或多种。
4.根据权利要求1-3任一的方法，其特征为所述的毒素类活性物质是在使用冷冻剂喷灌、喷淋、浇灌形式对膜翅目细腰亚目针尾部蜂类昆虫的巢穴进行冷冻后，将巢穴打开，对已经冷冻的虫体毒囊进行摘取分离而得到的。
5.根据权利要求1-4任一的方法，其特征为所述的膜翅目细腰亚目针尾部蜂类昆虫是指胡蜂总科中的长腹胡蜂科、铃腹胡蜂科、异腹胡蜂科、狭腹胡蜂科、马蜂科、胡蜂科的膜翅目昆虫。
6.根据权利要求1-4任一的方法，其特征为所述的膜翅目细腰亚目针尾部蜂类昆虫是指蜜蜂总科中的中华蜜蜂、意大利蜂、东北黑蜂、伊犁黑蜂、卡尼鄂拉蜂、高加索蜂。
【文档编号】A01K59/00GK103655630SQ201310624443
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】赵昱, 赵婉宸, 江滇, 郭云胶, 刘建平 申请人:大理学院