一种苹果绵蚜蜡腺孔观察方法
【专利摘要】本发明公开了一种苹果绵蚜蜡腺孔观察方法，包括标本采集、苹果绵蚜初处理、脱脂处理、玻片标本制作、标本观察、数据分析等步骤；研究发现，苹果绵蚜各虫态体背均具有四列蜡腺孔，除中央两列每节各有一个蜡腺孔，两侧列除头部2、3节和腹部第8节无蜡腺孔外，其余每体节各有一个蜡腺孔，总计50个；每个蜡腺孔由若干蜡腺小孔呈梅花状排列组成，1、4列小孔数显著多于2、3列，腹部蜡腺孔小孔数目较其他部位蜡腺孔小孔数多，其中4-7节最多。本方法通过观察研究苹果绵蚜各虫态体背蜡腺孔的形态和排列特征快速鉴定苹果绵蚜，为苹果绵蚜的关卡检疫和防治提供实验依据，该方法具有准确性高、操作性强的优点，适用于关卡检疫中的快速检疫。
【专利说明】一种苹果绵蚜蜡腺孔观察方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种苹果绵蚜形态学鉴定方法，具体涉及一种苹果绵蚜蜡腺孔观察方法，属于植物保护领域。
【背景技术】
[0002]苹果绵姆(iZrio5Y通alanigerum (Hausmann))隶属于半翅目(Hemiptera)、绵姆科(Pemphigidae)、绵姆属(Briosoma Leech),又名血色姆虫、赤姆、绵姆,是国内外检疫对象之一，也是苹果属的重要检疫性害虫。苹果绵蚜的成蚜和若蚜形态相似，无翅孤雌蚜的成蚜近椭圆形，赤褐色，体侧具有瘤状突起物，着生短毛，身体被有白色蜡质绵絮物，有翅胎生雌蚜身体暗褐色，头及胸部黑色，体表覆盖白色绵絮物，比无翅胎生成蚜少。若蚜共4龄，身体略呈圆筒状，体色赤褐，喙细长，向后延伸。触角5节，身体被有白色绵絮物，有翅若蚜身体两侧有黑色翅芽。
[0003]苹果绵蚜可周年在苹果树体地上、地下部寄生刺吸树液，同时可以分泌唾液消化酶，刺激寄生组织增生形成肿瘤，影响苹果树的营养输导。并且，苹果绵蚜分泌白色蜡质绵絮物和排泄物蜜露，其中蜜露的主要成分为氨基酸和糖，是许多致病性及腐生性真菌(如烟霉菌(煤怠菌Gloeoaes Pomigena))的理想培养基,烟霉菌可造成树体及叶片发黑,使叶片光合作用降低，并且使果实表面形成果锈、污斑，影响果实的美观和味感，因此防治苹果绵蚜成为影响苹果种植业的关键因素。
[0004]苹果绵蚜体背的白色蜡质绵絮物是由体内泌蜡腺分泌，通过体壁的蜡腺孔排泄到体外。苹果绵蚜的背面有4条纵列的蜡腺孔，其有一定排列特征和分布规律，可以分泌白色蜡质绵絮物，对于苹果绵蚜的生命活动具有重要的作用:绵絮物可以包裹粘稠的蜜露，使蜜露免受污染，同时避免苹果绵蚜移动时受蜜露粘缚和覆盖，保持正常生理活动；减少真菌的污染；绵絮物能够保护苹果绵蚜免受雨水冲刷和捕食者、寄生者的伤害；同时，绵絮物可反射紫外线和太阳辐射，减少其对苹果绵蚜的伤害，并降低水分散失；此外，绵絮物包裹着苹果绵蚜，易被人、动物、交通工具等携带传播到非疫区，有利于扩散蔓延。
[0005]从1914年苹果绵蚜传入我国威海后，一个世纪以来，已传入到我国的大部分苹果产区，对苹果的产量和品质影响严重。而关卡检疫中对苹果绵蚜的鉴别主要依据外部形态学方法，而仅仅依据外部形态学方法，往往错检或漏检，造成苹果绵蚜进一步扩大蔓延。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是针对目前仅依靠外部形态特征鉴定苹果绵蚜的不足，提供一种苹果绵蚜蜡腺孔观察方法，通过研究苹果绵蚜蜡腺孔数目、排列特征和分布规律，了解苹果绵蚜分泌绵絮的生理过程和功能，准确鉴定苹果绵蚜、控制其传播蔓延，为关卡检疫中正确识别苹果绵蚜以及防止扩散蔓延提供依据；该方法具有准确性高、操作性强的优点，适用于关卡检疫中的快速检疫。
[0007]为了达到上述目的，本发明是这样实现的:一种苹果绵蚜蜡腺孔观察方法，包括以下步骤:
(1)样本采集:5~6月份苹果绵蚜危害期，选择受药剂影响小的苹果树，用剪刀剪下带有苹果绵蚜的枝条，轻拿轻放苹果枝，防止虫体从枝条上掉落；用剪刀将苹果叶剪下，仅留有叶柄，防止苹果枝蒸腾过大影响苹果绵蚜生存；将处理好的苹果枝插入装有三分之二水的1000mL大烧杯中,用纱布把烧杯口封住,放于阴凉通风处备用；
(2)苹果绵蚜初处理:选取一个苹果绵蚜虫落，用镊子把覆盖在苹果绵蚜虫落上的绵絮去掉，用毛笔轻轻把虫落扫至培养皿中，于双目实体解剖镜下分龄期，在此过程中，要轻柔地扫落或挑取苹果绵蚜，防止肢体损伤；将苹果绵蚜扫落到培养皿中后，用体积浓度为70-90%酒精反复清洗苹果绵蚜3次，使其身上的蜡质和绵絮同蚜体分离；最后将各龄期苹果绵蚜分别放入指形管中，用体积浓度为70-80%酒精浸溃24小时以上待用；
(3)苹果绵蚜脱脂处理:将步骤2中不同龄的苹果绵蚜从指形管中取出，用昆虫针在其腹部扎一小孔，然后放到盛有体积浓度为70-80%酒精的指形管中静置浸泡24-48h ;然后将苹果绵蚜从酒精溶液中取出，并用蒸馏水在培养皿中冲洗2-3次，不同龄期的苹果绵蚜分别浸泡于质量浓度为8-15%的氢氧化钠溶液中，并置于37°C的恒温箱中放置36-48h，至虫体发白透明后，从氢氧化钠溶液中取出，用蒸馏水清洗3次，并再次用昆虫针在其腹部扎另一小孔，然后将苹果绵蚜按龄期转移到装有体积浓度为70-80%酒精溶液的指形管中，再次静置至虫体透明为止；
(4)苹果绵蚜玻片标本的制作:从指形管中取出已脱脂较好即虫体透明的苹果绵蚜，放于凹玻片上，用蒸馏水冲洗3-5次将酒精溶液漂洗干净；然后将其放到凹载玻片上，用吸水纸将水吸净，染色剂染色5-15分钟后，用蒸馏水将染色剂冲洗干净；用吸管吸取一头已染色的苹果绵蚜，将其放置到载玻片上，并加一滴蒸馏水，然后将玻片放到双目实体解剖镜下，用昆虫针对虫体整姿；用吸水纸沿虫体整姿方向将水吸干，再将虫体静置5min后用霍氏封固剂制作压片，滴加霍氏封固剂和盖玻片时要注意防止气泡产生；将制好的玻片至于酒精灯外焰处，加热30-50秒，烘干至霍氏封固剂凝固并将玻片中的气泡赶走；将玻片平放于标本盒内，待封固剂完全干了之后再插入标本盒中；
(5)标本观察及数据处理:挑选制作较好、蜡腺孔较清楚的1-4龄若蚜、成蚜玻片标本各5枚，于双目实体显微镜下观察其蜡腺孔和小孔的数目及其分布形态，记录数据并分析；实验数据用Excel进行处理，并利用SPSS17.0统计学软件的多重比较对各组实验数据进行多重比较。
[0008]优选的，步骤2中，所述的清洗苹果绵蚜用的酒精浓度为75% ;所述的浸泡酒精的浓度为75%，浸泡时间为24-48h。
[0009]优选的，步骤2中，所述的毛笔为小号、软毛毛笔；步骤3中，所述的昆虫针为零号昆虫针。
[0010]优选的，步骤3中，所述的酒精浓度为75%，所述的氢氧化钠浓度为10%。
[0011]优选的，步骤4中，所述的染色剂为亮绿，质量浓度为0.5%，染色时间为10分钟。
[0012]本发明的有益效果是:本发明提供了一种苹果绵蚜蜡腺孔观察方法，准确性高、操作性强、适用于关卡检疫中的快速检 疫，可以准确鉴定苹果绵蚜，及时控制其传播蔓延。
【专利附图】
【附图说明】[0013]图1:苹果绵蚜2龄若蚜体壁上四列蜡腺孔排列特征图。
[0014]【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明的苹果绵蚜蜡腺孔观察方法进一步详细说明。
[0015]实施例1:
1、供试虫源:
采自山东莱阳地区和城阳地区管理粗放的苹果园内的苹果绵蚜。
[0016]2、供试仪器与材料:
双目实体显微镜、双目实体解剖镜、恒温箱、标签纸、镊子、烧杯、量筒、玻璃棒、载玻片、凹玻片、盖玻片、滤纸、吸水纸、霍氏封固剂、酒精溶液、亮绿染色剂、氢氧化钠固体、蒸馏水
坐寸ο
[0017]3、试验方法:
(O标本米集:
5~6月份苹果绵蚜危害期，在苹果园内选择受药剂影响小的果树，用剪刀小心地把带有苹果绵蚜的枝条剪下，带到室内，在此过程中，轻拿轻放采集的苹果枝条，防止虫体从枝条上掉落下来；用剪刀将苹果叶剪下，仅留有叶柄，将处理好的苹果枝插入装有三分之二水的1000mL烧杯中,用纱布把烧杯口封住,放于阴凉通风处备用。
[0018](2)苹果绵蚜初处理:
选取一个苹果绵蚜虫落，用镊子把覆盖在苹果绵蚜虫落上的绵絮去掉，用小号软毛毛笔轻轻把虫落扫至培养皿中，于双目实体解剖镜下分龄期，在此过程中，要轻柔地扫落或挑取苹果绵蚜，防止其肢体损伤；将苹果绵蚜扫落到培养皿中后，用75%酒精浸泡，并反复冲洗3次，使苹果绵蚜上的蜡质和绵絮同蚜体分离；最后将各龄期苹果绵蚜分别放入指形管中，用75%酒精浸溃48小时待用。
[0019](3)苹果绵蚜脱脂处理:
(a)将已分好龄期的苹果绵蚜从指形管中取出，用零号昆虫针在其腹部扎一小孔，然后再放到盛有75%酒精溶液的指形管中静置24h备用；
(b)浸泡结束后，将苹果绵蚜从酒精溶液中取出，并用蒸馏水在培养皿中冲洗2-3次；
(c)将苹果绵蚜分龄期浸泡于浓度为10%的氢氧化钠溶液中，并置于37°C的恒温箱中放置36h至虫体发白透明；
Cd)将苹果绵蚜从氢氧化钠溶液中取出，用蒸馏水清洗3次，并再次用零号昆虫针在其腹部扎另一小孔；然后将苹果绵蚜按龄期转移到装有75%酒精溶液的指形管中，再次静置至虫体透明为止。
[0020] (4)玻片标本的制作:
(a)清洗:从指形管中取出已脱脂较好即虫体透明的苹果绵蚜，放于凹玻片上，用蒸馏水将酒精溶液漂洗干净；
(b)染色:将苹果绵蚜放到凹载玻片上，用吸水纸将水吸净，使用0.5%亮绿染色剂进行染色，10分钟后，用蒸馏水将染色剂冲洗干净；若用水清洗后虫体未染上颜色，可能是因虫体未清洗干净，将苹果绵蚜重复(a)步骤后，再进行一次染色步骤；
(c)整姿:用吸管吸取一头已染色的苹果绵蚜，将其放置到载玻片上，并加一滴蒸馏水，然后将玻片放到双目实体解剖镜下，用零号昆虫针对虫体整姿，使其足肢不遮挡蚜虫躯体，以免影响蜡腺孔的观察；
Cd)干燥:用吸水纸沿虫体整姿方向将水吸干，再将虫体静置5min ；
(e)压片:用霍氏封固剂制作压片；
(f)去泡透明:将制好的玻片放于酒精灯外焰处，加热30秒，烘干至霍氏封固剂凝固并将玻片中的气泡赶走；
(g)放置标本盒内保存待用:先将玻片标本平放，待封固剂完全干了之后再插入标本盒中。
[0021]4、玻片标本观察和数据分析:
挑选制作较好、蜡腺孔较清楚的1-4龄若蚜、成蚜玻片标本各5枚，于双目实体显微镜下观察其蜡腺孔和小孔的数目及其分布规律，记录数据并分析；对实验数据用Excel进行处理，并利用SPSS17.0统计学软件的多重比较对各组实验数据进行多重比较。
[0022]实施例2:
不同龄期苹果绵蚜形态学鉴定特征如表1所示:
表1苹果绵蚜若蚜形态特征鉴别
【权利要求】
1.一种苹果绵蚜蜡腺孔观察方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)样本采集:于5~6月份苹果绵蚜危害期，选剪带有苹果绵蚜的枝条，剪下苹果叶仅留有叶柄，将处理好的苹果枝插入装有三分之二水的1000mL烧杯中，用纱布把烧杯口封住，放于阴凉通风处备用； (2)苹果绵蚜初处理:选取一个苹果绵蚜虫落，将覆盖在虫落上的绵絮去掉，用毛笔将虫落扫至培养皿中于解剖镜下分辩龄期，用体积浓度为70-90%酒精反复冲洗苹果绵蚜3次，然后将各龄期苹果绵蚜分别放入指形管中，用体积浓度为70-80%酒精浸溃24小时以上待用； (3)苹果绵蚜脱脂处理:将步骤2中不同龄期的苹果绵蚜从指形管中取出，用昆虫针在其腹部扎一小孔后于体积浓度为70-80%酒精中浸泡24-48h后冲洗干净，再于质量浓度为8-15%的氢氧化钠溶液中恒温静置至虫体发白透明，蒸馏水清洗后再次在腹部扎另一小孔，于体积浓度为70-80%酒精溶液中再次静置至虫体透明； (4)苹果绵蚜玻片标本的制作:取步骤3中透明的虫体放于凹玻片上，用蒸馏水冲洗3-5次，吸水纸将水吸净后用染色剂染色5-15分钟，再用蒸馏水将染色剂冲洗干净；虫体经整姿、干燥静置、压片、去泡透明后放于标本盒中待用； (5)玻片标本观察及数据处理:挑选1-4龄若蚜、成蚜玻片标本各5枚，于双目实体显微镜下观察其蜡腺孔和小孔的数目及其分布规律，记录数据，实验数据用Excel进行处理并利用SPSS17.0统计学软件对实验数据进行多重比较。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述的清洗苹果绵蚜用的酒精浓度为75% ;所述的浸泡酒精的浓度为75%，浸泡时间为24-48h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述的毛笔为小号、软毛毛笔；步骤3中，所述的昆虫针为零号昆虫针。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3所述的脱脂处理过程包括以下步骤: (a)将已分好龄期的苹果绵蚜从指形管中取出，用零号昆虫针在其腹部扎一小孔，然后再放到盛有75%酒精溶液的指形管中静置24-48h备用； (b)浸泡结束后，将苹果绵蚜从酒精溶液中取出，并用蒸馏水在培养皿中冲洗2-3次； (c)将苹果绵蚜分龄期浸泡于浓度为10%的氢氧化钠溶液中，并置于37°C的恒温箱中放置36-48h至虫体发白透明； Cd)将苹果绵蚜从氢氧化钠溶液中取出，用蒸馏水清洗3次，并再次用零号昆虫针在其腹部扎另一小孔；然后将苹果绵蚜按龄期转移到装有75%酒精溶液的指形管中，再次静置至透明为止。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中所述的标本制作过程包括以下步骤: (a)清洗:从指形管中取出已脱脂较好即虫体透明的苹果绵蚜，放于凹玻片上，用蒸馏水冲洗3-5次将酒精溶液漂洗干净； (b)染色:将苹果绵姆放到凹载玻片上,用吸水纸将水吸净,使用染色剂染色5-15分钟后，用蒸馏水将染色剂冲洗干净； (c)整姿:用吸管吸取一头已染色的苹果绵蚜，将其放置到载玻片上，并加一滴蒸馏水，然后将玻片放到双目实体解剖镜下，用零号昆虫针对虫体整姿； Cd)干燥:用吸水纸沿虫体整姿方向将水吸干，再将虫体静置5min ； (e)压片:用霍氏封固剂制作压片； (f)去泡透明:将制好的玻片放于酒精灯外焰处，加热约30-50秒，烘干至霍氏封固剂凝固并将玻片中的气泡赶走； (g)放置标本盒内保存待用:先将玻片平放，待封固剂完全干了之后再插入标本盒中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特 征在于，步骤b中，所述的染色剂为亮绿，质量浓度为0.5%，染色时间为10分钟。
【文档编号】A01K67/033GK103947609SQ201410156956
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】周洪旭, 谭秀梅, 孙立宁, 赵川德 申请人:青岛农业大学