一种用于防治韭菜迟眼蕈蚊的苏云金芽孢杆菌及其应用的制作方法

一种用于防治韭菜迟眼蕈蚊的苏云金芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了属于生物防治领域的一种用于防治韭菜迟眼蕈蚊的苏云金芽孢杆菌(Bacillus?thuringiensis)菌株JQ23，该菌株已于2014年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.9375。本发明还公开了一种含有JQ23的微生物杀虫剂及其制备方法。本发明苏云金芽孢杆菌JQ23对韭菜迟眼蕈蚊幼虫具有很高的毒力，为韭菜迟眼蕈蚊的防治提供了一种有效的方法；其次，本发明苏云金芽孢杆菌属于天然产物，对人畜无毒，对环境无污染；此外，本发明微生物杀虫剂制备方法简单，使用方便。
【专利说明】一种用于防治韭菜迟眼蕈蚊的苏云金芽孢杆菌及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物防治领域，具体涉及一种用于防治韭菜迟眼蕈蚊的苏云金芽孢杆 菌，以及该苏云金芽孢杆菌在蔬菜害虫防治中的应用。

【背景技术】
[0002] 韭菜迟眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga)又名韭蛆、黄脚蕈蚊，属双翅目，眼蕈蚊科， 主要危害韭菜、大葱、洋葱、小葱、大蒜等百合科蔬菜，偶尔也危害莴苣、青菜、芹菜等，是葱 蒜类蔬菜的主要害虫之一，在全国各地均有分布。韭菜迟眼蕈蚊的幼虫生活在土壤表层，群 集在韭菜地下部的鳞茎和柔嫩的茎部蛀食为害。初孵幼虫先为害韭菜叶鞘基部和鳞茎的上 端；春、秋季主要为害嫩茎，导致根茎腐烂。受害韭菜地上部分生长细弱，叶片发黄萎蔫下 垂，最后韭叶枯黄死亡。夏季气温高时，幼虫向下移动，为害韭菜鳞茎，致使整个鳞茎腐烂， 严重时整墩韭菜枯死。对于韭菜迟眼蕈蚊的防治方法主要有物理防治（糖醋液、臭氧等） 和化学防治。由于物理防治方法存在操作繁琐、防治效果受环境影响大等缺点，生产上主要 采用农药灌根等化学手段进行防治，但是由于韭蛆繁殖快、隐蔽性强、防治难度大，导致菜 农不规范或过量、甚至违规使用禁用的高毒农药进行防治，导致农药残留超标、污染环境、 危害人类健康以及杀害有益鸟类等问题，另一方面，长期大量使用化学农药增强害虫抗药 性、污染环境、杀伤鸟类、造成害虫再度猖獗的恶性循环，不能达到对害虫种群的有效控制， 同时造成韭菜农残超标，使消费者健康受到威胁。近年来毒韭菜事件频发，如：2004年4月 "香河毒韭菜进京事件"、2010年4月"青岛毒韭菜"和2011年3月河南南阳"毒韭菜事件"， 连续的毒韭菜曝光事件，使得消费者"谈韭色变"，严重影响了菜农的经济利益和消费者的 食品安全。
[0003] 生物防治由于具有专一性强、对人畜无毒害、不存在产生抗药性以及环境污染等 问题，日益受到人们的青睐。为了减少化学农药对环境的污染及对人民健康的威胁，筛 选对韭蛆有高致病性的生防微生物是防治韭蛆的有效方法和重要措施。苏云金芽孢杆 菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种从土壤或死亡昆虫体内分离出来的革兰 氏阳性细菌，此类菌在芽孢形成时期能产生一种或多种对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅 目、膜翅目、直翅目、等翅目、毛翅目或缨翅目等多种害虫具有杀虫活性的伴孢晶体蛋白 (Insecticidal Crystal Proteins,简称ICPs)。这种杀虫晶体蛋白对目标害虫高效专一、 对人畜无害、不污染环境，因而苏云金芽孢杆菌在害虫的生物防治中得到了广泛的应用。
[0004] 利用苏云金芽孢杆菌防治韭蛆的研究相对较少，如苏云金芽孢杆菌防治韭蛆的效 果可达75%左右（成学美等.植保技术与推广。1998年04期）或84.85% (解维星.2006， 华中农业大学硕士论文）。
[0005] 从上述可知，利用苏云金芽孢杆菌防治韭菜迟眼蕈蚊具有良好应用前景。


【发明内容】

[0006] 本发明目的在于提供一种用于防治韭菜迟眼蕈蚊的苏云金芽孢杆菌。该菌株对双 翅目眼蕈蚊科害虫韭菜迟眼蕈蚊具有高毒杀能力。
[0007] 本发明另一目的在于提供一种微生物杀虫剂。
[0008] 本发明第三目的在于提供上述微生物杀虫剂的制备方法。
[0009] 本发明第四目的在于提供上述苏云金芽孢杆菌的用途。
[0010] 实现本发明的技术方案如下：
[0011] 本发明一种苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)菌株JQ23,该菌株已于 2014年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 9375。
[0012] -种微生物杀虫剂，含有上述苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)菌株 JQ23。
[0013] 上述微生物杀虫剂，其剂型为液体剂型。
[0014] 上述微生物杀虫剂，其所述的液体剂型中含有上述苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)菌株 JQ23 的芽孢浓度为 107 ?108cfu/ml。
[0015] 上述微生物杀虫剂的制备方法，包括如下步骤：
[0016] (1)、菌种活化：将保存的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)菌株JQ23 在LB平板培养基上、在29?31°C下活化12?16h ;挑取单菌落在LB斜面培养基上、在 29?31°C下培养3?5天，得活化的菌株；
[0017] (2)、种子液制备：用无菌接种环刮取一小环步骤（1)中活化的菌株接种到LB液体 培养基50ml中，在29?31°C、转速为200?220rpm/min条件下培养10?14h，得种子液；
[0018] (3)、发酵培养：按照体积比为1?2%的比例将步骤（2)所得的种子液接入到黄 豆饼淀粉粉培养基中，在29?31°C、转速为200?220rpm/min条件下培养48?60h，得到 发酵液；
[0019] (4)、用水稀释步骤（3)所得的发酵液，调节pH值至6. 6?6. 8,添加0.02?0· 1% 的苯甲酸钠，即得微生物杀虫剂；或者将步骤（3)所得的发酵液在4°C、转速为5000rpm/ min条件下离心30min，取沉淀，得沉淀物，再用水稀释沉淀物，调节pH值至6. 6?6. 8,添加 0. 02 %?0. 1 %的苯甲酸钠，即得微生物杀虫剂。
[0020] 上述制备方法步骤（1)中所述的LB平板培养基或LB斜面培养基为本领域技术人 员所熟知的常用培养基，其组成成分及其重量比例为：胰蛋白胨l〇g，酵母提取物5g，氯化 钠 l〇g，琼脂粉 15g，水 1L，ρΗ7· 2。
[0021] 上述制备方法步骤（2)中所述的LB液体培养基为本领域技术人员熟知的常用培 养基，其组成成分及其重量比例为：胰蛋白胨l〇g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水lL，pH7. 2。
[0022] 上述制备方法步骤（3)中所述的黄豆饼粉培养基的组成成分及其重量百分 比为：黄豆饼粉2. 5 %、棉籽饼粉1.2 %、玉米淀粉1.5 %、酵母粉0.5 %、ΚΗ2Ρ040 . 03%、 MgS040 . 05%，水 1L。
[0023] 上述苏云金芽孢杆菌JQ23在防治蔬菜害虫上的应用。
[0024] 所述的蔬菜害虫是指双翅目眼蕈蚊科害虫。
[0025] 所述的眼蕈蚊科害虫是指亜菜迟眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga)。
[0026] 本发明菌株JQ23采集筛选的过程及其分类鉴定：
[0027](一）采集筛选的过程及形态分类鉴定：
[0028] 本发明菌株JQ23是河北省农林科学院植物保护研究所将2013年4月在河南省 采集的土样中分离到的菌株接种在LB固体培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠 l〇g，琼脂粉15g，水1L，pH7. 2)上在30°C条件下培养，不同时间取样镜检观察菌落（见图 1)形态特征、晶体特征等。在LB培养基上培养不同阶段观察结果如下，营养体：呈杆状，两 端钝圆，大小约1. 1?1.5X0. 5μπι;单个或两个以上呈链状存在。芽孢：椭圆形，大小约 1. 0?1. 2 X 0. 5 μ m，为休眠体；对高温或者干燥等不良环境有较强的抵抗力。伴孢晶体：球 形，直径约0. 4 μ m，具有杀虫活力。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠等 编著，科学出版社.2001年）中描述的芽孢杆菌形态特征基本一致，初步判断该菌株属于苏 云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)，并将其命名为JQ23。
[0029] (二）利用gyrB基因序列对JQ23菌株进行分子鉴定分类：
[0030] 将JQ23菌株接种于LB培养液，30°C振荡过夜，取lmL菌液于Eppenddorf管中，离 心，弃上清，200 μ L超纯水悬浮，100°C处理lOmin，12000rpm离心5min，取上清即为DNA模 板。利用芽孢杆菌gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的引 物序列为：
[0031] gyrB-F :5' TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT3,（SEQ ID No. 1)，
[0032] gyrB-R :5, TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC3,（SEQ ID No. 2);
[0033] gyrB 的 PCR 扩增反应体系（50μ L) :10XPCR Buffer(Mg2+)5y L ;dNTP Mixture(2.5mM)5yL，引物（10ymol/L)各 lyL，模板 lyL，Taq聚合酶（5U/yL)lyL， 超纯水补至 50μ L。反应程序为：95°C 5min ;95°C 30s，55°C 45s，72°C lmin，30 个循环； 72°C 10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司进行测序，得JQ23菌株的gyrB基 因序列（见SEQ ID No. 3)。将JQ23菌株的gyrB基因序列在Genbank中进行同源性比较， 结果发现JQ23与苏云金芽孢杆菌的gyrB基因序列同源性最高，达到99% ;同时利用MEGA 软件构建系统发育树，结果（见图3) JQ23菌株与苏云金芽孢杆菌聚合在一起，说明JQ23菌 株为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)，并且与任何其他菌株不同，是一个新菌 株。
[0034] (三）利用phoR基因序列对JQ23菌株进行分子鉴定分类：
[0035] 提取JQ23菌株的DNA，然后以JQ23菌株的DNA为模板，以ph〇R-F和ph 〇R-R为引 物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的引物序列为：
[0036] phoR-F :5' TTYARYTCATGRGAVACATT3'（SEQ ID No. 4);
[0037] phoR-R :5, GGNTAYAAANARGAGGAGCC3,（SEQ ID No. 5);
[0038] phoR 的 PCR 反应体系（50 μ L) : 10XPCR Buffer (Mg2+) 5 μ L，dNTP Mixture(2.5mM)5yL，引物（10ymol/L)各 2yL，模板 lyL，Taq 聚合酶（5U/yL)lyL， 超纯水补至 50μ L。反应程序为：95°C 5min ;95°C 30s，50°C 45s，72°C lmin，30 个循环； 72°C 10min。将所得扩增产物送交上海生工生物工程有限公司进行测序，得JQ23菌株的 phoR 基因序列（见 SEQ ID No. 6)。将 JQ23 的 phoR 基因序列（见 SEQ ID No. 6)在 Genbank 中进行同源性比较，结果发现JQ23菌株与苏云金芽孢杆菌的phoR基因序列同源性最高，达 到99% ;同时利用MEGA软件构建系统发育树，结果（见图4) JQ23菌株与苏云金芽孢杆菌 聚合在一起，说明JQ23菌株在分类上属于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)，并 且与任何其他菌株不同，是一个新菌株。
[0039] 本发明JQ23微生物杀虫剂的使用方法：将JQ23微生物杀虫剂直接兑水稀释至 1 X 107cfu?1 X 108cfu/ml，在韭蛆发生初期灌根防治，连续灌根3次，每次间隔5-7d。
[0040] 本发明具有的优点或有益效果：本发明苏云金芽孢杆菌菌株JQ23对韭菜迟眼蕈 蚊幼虫具有很高的毒力，其菌液浓度在IX 107cfu/mL以上时，对韭菜迟眼蕈蚊幼虫7天的 校正死亡率达83.84%以上；凡23微生物杀虫剂1父10 7(^11/1^使用浓度下，田间虫口减退 率达到66. 03%，防治效果达到85. 09%;本发明为韭菜迟眼蕈蚊的防治提供了一种有效的、 无害的、环保的方法；其次，本发明苏云金芽孢杆菌属于天然产物，对人畜无毒，对环境无污 染，将其作为微生物杀虫剂用于蔬菜害虫防治，属于环境友好型杀虫剂，该微生物杀虫剂的 开发和利用将有效杜绝"毒韭菜事件"再次发生，保障食品安全；此外，本发明JQ23的微生 物杀虫剂制备方法简单，使用方便。

【专利附图】

【附图说明】
[0041] 图1.为JQ23菌株菌落照片。
[0042] 图2.为JQ23菌株感染的韭菜迟眼蕈蚊幼虫对比照片，其中左侧的为健康的韭菜 迟眼蕈蚊幼虫，右侧的为被JQ23菌株感染的韭菜迟眼蕈蚊幼虫。
[0043] 图3.为根据gyrB基因序列构建的JQ23系统发育树。
[0044] 图4.为根据phoR基因序列构建的JQ23系统发育树。

【具体实施方式】
[0045] 实施例1 JQ23菌株微生物杀虫剂的制备
[0046] 按照如下方法进行：
[0047] (1)菌种活化：将保存的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)菌株 JQ23((已于2014年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 9375))在LB平板培养基（其组成成分及其重量比例为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g， 氯化钠 l〇g，琼脂粉15g，水lL，pH7. 2)上29°C活化13h，挑取单菌落在LB斜面培养基（（其 组成成分及其重量比例为：胰蛋白胨l〇g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，水1L， pH7. 2)上30°C培养3天，得活化的菌株。
[0048] (2)种子液的制备：用无菌接种环刮取一小环步骤（1)活化的菌株接种到LB液 体培养基（其组成成分及其重量比例为：胰蛋白胨l〇g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水1L， pH7. 2)50ml中，在30°C、摇床转速为200rpm/min的条件下培养12h，得种子液。
[0049] (3)发酵培养：按照体积比为1 %的比例将步骤（2)的种子液接入到黄豆饼淀 粉粉培养基（其组成成分及其重量百分比为：黄豆饼粉2. 5 %、棉籽饼粉1.2%、玉米淀 粉 1. 5 %、酵母粉 0· 5 %、ΚΗ2Ρ040· 03 %、MgS040. 05 %，加水混合溶解，调 ρΗ7· 2,121°C 灭菌 30min，再降到30°C备用）中，在30°C，转速为200rpm/min摇床培养48h，检测发酵液中菌 体和芽孢数量，待发酵液中胞晶分离达到95%时停止发酵培养，得发酵液（以下简称"菌 液"；经稀释平板计数法计数发酵液中的活菌数大于5. 46 X 108cfu/ml。
[0050] (4)将步骤⑶所得发酵液调节pH值至6. 6?6. 8,添加0. 02 %?0. 1 %的苯甲 酸钠，即得微生物杀虫剂；或者将发酵液在4°C、转速为5000rpm/min条件下离心30min，弃 掉上清液，所得沉淀为JQ23孢晶混合物，用水稀释菌体JQ23孢晶混合物至1 X 107cfu/ml浓 度，调节pH值至6. 6?6. 8,添加0. 02 %?0. 1 %的苯甲酸钠，即为微生物杀虫剂。
[0051] 实施例2 :本发明JQ23菌株防治韭菜迟眼蕈蚊幼虫室内生测试验
[0052] (一）试验设计：
[0053] 将实施例1制备的JQ23菌液用水分别稀释成5X108、1X108、1X10 7、1X106、 1 X 105cfu/ml五个浓度梯度。
[0054] 对照：无菌水
[0055] (二）试验方法：
[0056] (1)将灭菌的1. 5%水琼脂倒入一次性塑料培养皿中，厚度为3mm，上铺两层滤纸；
[0057] (2)将韭菜剪至大小为10mm的韭菜段，浸泡在实施例⑴制备的JQ23菌液中 20min，取出浸泡过JQ23菌液的韭菜段放入平皿中。
[0058] ⑶挑取大小一致、健康活泼的韭菜迟眼蕈蚊幼虫接种在步骤⑵中含菌的韭菜 段上，以无菌水为对照。置于25°C、光周期14h :10h(L :D)条件下饲养7d。每处理30头试 虫，设3次重复，施药后定期调查死亡虫数。数据统计分析应用SPSS18. 0软件进行数据处 理。
[0059] 表1本发明菌株JQ23防治韭菜迟眼蕈蚊2龄幼虫的试验结果
[0060]

【权利要求】
1. 一种苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)菌株JQ23,该菌株已于2014 年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9375。
2. -种微生物杀虫剂，其特征在于含有权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)菌株 JQ23。
3. 按照权利要求2所述的微生物杀虫剂，其特征在于其剂型为液体剂型。
4. 按照权利要求3所述的微生物杀虫剂，其特征在于其所述的液体剂型中含有权利要 求1所述的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)菌株JQ23的芽孢浓度为107? 108cfu/ml 〇
5. 权利要求3所述的微生物杀虫剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 、将保存的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)菌株JQ23在LB平板培养 基上、在29?31°C下活化12?16h ;挑取单菌落在LB斜面培养基上、在29?31°C下培养 3?5天，得活化的菌株； (2) 、用无菌接种环刮取一小环步骤（1)中活化的菌株接种到LB液体培养基50ml中， 在29?31°C、转速为200?220rpm/min条件下培养10?14h，得种子液； (3) 、按照体积比为1?2%的比例将步骤（2)所得的种子液接入到黄豆饼淀粉粉培养 基中，在29?31°C、转速为200?220rpm/min条件下培养48?60h，得到发酵液； (4) 、用水稀释步骤（3)所得的发酵液，调节pH值至6. 6?6. 8,添加0. 02?0. 1 %的 苯甲酸钠，即得微生物杀虫剂；或者将步骤（3)所得的发酵液在4°C、转速为5000rpm/min 条件下离心30min，取沉淀，得沉淀物，再用水稀释沉淀物，调节pH值至6. 6?6. 8,添加 0. 02 %?0. 1 %的苯甲酸钠，即得微生物杀虫剂。
6. 按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤（1)中所述的LB平板培养基或 LB斜面培养基的组成成分及其重量比例为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂 粉 15g，水 1L，ρΗ7· 2。
7. 按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤（2)中所述的LB液体培养基的 组成成分及其重量比例为：胰蛋白胨l〇g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水1L，pH7. 2。
8. 按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤（3)中所述的黄豆饼粉培养基 的组成成分及其重量百分比为：黄豆饼粉2. 5%、棉籽饼粉1. 2%、玉米淀粉1. 5%、酵母粉 0· 5 %、ΚΗ2Ρ040· 03 %、MgS040 . 05 %，水 1L。
9. 权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌菌株JQ23在防治眼蕈蚊科害虫上的应用。
10. 按照权利要求9所述的应用，其特征在于其所述的眼蕈蚊科害虫是指韭菜迟眼蕈 蚊（Bradysia odoriphaga)〇
【文档编号】A01P7/04GK104099277SQ201410338466
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】杜立新, 宋健, 曹伟平, 冯书亮, 王金耀 申请人:河北省农林科学院植物保护研究所