一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种珍珠莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞的培养、细胞悬浮体系的优化等步骤。本发明方法所制备的珍珠莲悬浮细胞生长周期短，次生代谢物产量高，增殖率高，有利于获得大规模的珍珠莲悬浮细胞以及药用次生代谢物质。
【专利说明】 一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组培条件下珍珠莲悬浮细胞的培养，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]珍珠莲，/7Zcw1S sarmentosa var.Ae/z/yi,桑科,木质攀援匍匍藤状灌木,又名凉粉树、冰粉树、岩石榴、幼枝密被褐色长柔毛，叶革质，卵状椭圆形，长8-10厘米，宽3-4厘米，先端渐尖，基部圆形至楔形，表面无毛，背面密被褐色柔毛或长柔毛，基生侧脉延长，侧脉5-7对，小脉网结成蜂窝状；叶柄长5-10毫米，被毛。产台湾、浙江、江西、福建、广西、广东、湖南、湖北、贵州、云南、四川、陕西、甘肃。常生于阔叶林下或灌木丛中。本变种在我国分布广，各地常见。清热解毒，消炎止泻。治小儿高热，惊风，肺炎，膀胱炎，百日咳，脚气病，肠炎，痢疾。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供珍珠莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法，生长周期短，次生代谢物产量高，增殖率高，有利于获得大规模的珍珠莲悬浮细胞以及药用次生代谢物质。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案:
选用珍珠莲幼嫩的叶片，用肥皂水刷洗5分钟，自来水冲洗15分钟，在超净工作台上用2 %的次氯酸钠消毒8分钟，无菌水冲洗7次，接种在N6+6-BA2.5mg/L+IBA0.5mg/L+NAA0.25mg/L+多胺lOmmol/L培养基上进行愈伤组织诱导培养，条件为暗光照，温度24 °C，湿度75%，将诱导出来的愈伤组织接入培养基N6+6-BA4.0mg/L+2,4-D6.0mg/L+NAA0.5mg/L+柠檬酸12_15mg/L中进行愈伤组织增殖培养，增殖培养两代后挑选均一稳定的愈伤组织接入 MS+KT2.0mg/L+TDZ2.0mg/L+2, 4-D2.0mg/L+5-磺基水杨酸 0.5%_3% 的液体培养基中进行悬浮细胞培养，培养条件为光照强度50001x，光照16h/d，温度24°C，湿度85%,洗涤，干燥。
[0005]采用本发明制备的珍珠莲悬浮细胞，产量大，能耗少，生长周期短，次生代谢物产量高。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
选用珍珠莲幼嫩的叶片，用肥皂水刷洗5分钟，自来水冲洗15分钟，在超净工作台上用2 %的次氯酸钠消毒8分钟，无菌水冲洗7次，接种在N6+6-BA2.5mg/L+IBA0.5mg/L+NAA0.25mg/L+多胺lOmmol/L培养基上进行愈伤组织诱导培养，条件为暗光照，温度24 °C，湿度75%，将诱导出来的愈伤组织接入培养基N6+6-BA4.0mg/L+2,4-D6.0mg/L+NAA0.5mg/L+柠檬酸12mg/L中进行愈伤组织增殖培养，增殖培养两代后挑选均一稳定的愈伤组织接入MS+KT2.0mg/L+TDZ2.0mg/L+2, 4-D2.0mg/L+5-磺基水杨酸0.5%的液体培养基中进行悬浮细胞培养，培养条件为光照强度50001x，光照16h/d，温度24°C，湿度85%，洗涤，干燥，悬浮细胞增长率59%。
[0008]实施例2
选用珍珠莲幼嫩的叶片，用肥皂水刷洗5分钟，自来水冲洗15分钟，在超净工作台上用2 %的次氯酸钠消毒8分钟，无菌水冲洗7次，接种在N6+6-BA2.5mg/L+IBA0.5mg/L+NAA0.25mg/L+多胺lOmmol/L培养基上进行愈伤组织诱导培养，条件为暗光照，温度24 °C，湿度75%，将诱导出来的愈伤组织接入培养基N6+6-BA4.0mg/L+2,4-D6.0mg/L+NAA0.5mg/L+柠檬酸13mg/L中进行愈伤组织增殖培养，增殖培养两代后挑选均一稳定的愈伤组织接入MS+KT2.0mg/L+TDZ2.0mg/L+2, 4-D2.0mg/L+5-磺基水杨酸1%的液体培养基中进行悬浮细胞培养，培养条件为光照强度50001x，光照16h/d，温度24°C，湿度85%，洗涤，干燥，悬浮细胞增长率55%。
[0009]实施例3
选用珍珠莲幼嫩的叶片，用肥皂水刷洗5分钟，自来水冲洗15分钟，在超净工作台上用2 %的次氯酸钠消毒8分钟，无菌水冲洗7次，接种在N6+6-BA2.5mg/L+IBA0.5mg/L+NAA0.25mg/L+多胺lOmmol/L培养基上进行愈伤组织诱导培养，条件为暗光照，温度24 °C，湿度75%，将诱导出来的愈伤组织接入培养基N6+6-BA4.0mg/L+2,4-D6.0mg/L+NAA0.5mg/L+柠檬酸15mg/L中进行愈伤组织增殖培养，增殖培养两代后挑选均一稳定的愈伤组织接入MS+KT2.0mg/L+TDZ2.0mg/L+2, 4-D2.0mg/L+5-磺基水杨酸3%的液体培养基中进行悬浮细胞培养，培养条件为光照强度50001x，光照16h/d，温度24°C，湿度85%，洗涤，干燥，悬浮细胞增长率54%。
【权利要求】
1.一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:珍珠莲的叶片经消毒处理，接种在 N6+6-BA2.5mg/L+IBA0.5mg/L+NAA0.25mg/L+ 多胺 lOmmol/L 培养基上进行愈伤组织诱导培养，将诱导出来的愈伤组织接入培养基N6+6-BA4.0mg/L+2，4-D6.0mg/L+NAA0.5mg/L+柠檬酸12-15mg/L中进行愈伤组织增殖培养，增殖培养两代后挑选均一稳定的愈伤组织接入MS+KT2.0mg/L+TDZ2.0mg/L+2, 4-D2.0mg/L+5-磺基水杨酸 0.5%-3% 的液体培养基中进行悬浮细胞培养，洗涤，干燥。
2.根据权利要求1所述的一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:所述的消毒处理为:选用珍珠莲幼嫩的叶片，用肥皂水刷洗5分钟，自来水冲洗15分钟,在超净工作台上用2%的次氯酸钠消毒8分钟，无菌水冲洗7次。
3.根据权利要求1所述的一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:诱导愈伤组织的培养基中附加了多胺，可以提高诱导成活率。
4.根据权利要求1所述的一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:诱导愈伤组织的条件为暗光照，温度24°C，湿度75%。
5.根据权利要求1所述的一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:珍珠莲愈伤组织增殖培养中添加了柠檬酸，具有抗氧化作用，可以防止褐化现象的出现。
6.根据权利要求1所述的一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:珍珠莲悬浮细胞培养中添加了 5-磺基水杨酸，对悬浮细胞的生长和内含物含量的调控具有显著的作用。
7.根据权利要求1所述的一种珍珠莲悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是:愈伤组织的增殖和悬浮细胞的培养条件为光照强度50001x，光照16h/d，温度24°C，湿度85%。
【文档编号】A01H4/00GK104255487SQ201410463359
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】杨存 申请人:南京通泽农业科技有限公司