一种滇南杜鹃的组培繁殖方法
【专利摘要】本发明公开了一种滇南杜鹃的组培繁殖方法，该方法适用于杜鹃花科滇南杜鹃的组培快繁，属植物生物【技术领域】。本发明以开花后的新嫩茎段为外植体，通过外植体消毒、丛生芽诱导、继代及壮苗、瓶外生根一系列步骤，有效解决了因滇南杜鹃分布区域窄、引种驯化难造成的植株量少，由种子播种开花时间长而导致的无法满足商业提取香料的需求问题。本发明提供的组培快繁方法，在1个月内增殖系数为10-20，生根率为80％-90％，移栽成活率为95％-98％，极大地提高了滇南杜鹃的繁殖系数，为该物种的引种驯化、保存和商业生产提供了技术支撑。
【专利说明】一种滇南杜鹃的组培繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物生物技术中植物组织培养方法，具体地说，涉及杜鹃花滇南杜鹃 的组织培养快繁方法。
【背景技术】
[0002] 滇南杜醇隶属于杜醇花科（Ericaceae)杜醇花属（Rhododendron L.)马银花亚属 (Subgen. Azaleastrum)长蕊组（Sect. Azaleastrum),常绿灌木。滇南杜醇花白色，有浓郁 的香味，是香料提取的良好材料，具有较高的经济利用价值。由于滇南杜鹃分布地域狭窄， 材料有限，难以满足香料生产的原材料供应。
[0003] 目前，组培快繁已成为中药材、花卉、濒危物种苗木生产的重要手段。据研究报道 杜鹃对培养基的适应性与杜鹃的基因型密切相关，不同品种的杜鹃对培养基的适应程度不 同。对于杜醇花科植物，目前已经报道适合组织培养使用的基本培养基有Read、Anderson、 WPM等，但由于杜鹃花科植物种类丰富、种间差异较大，应用时还需结合不同的杜鹃花亚属 甚至亚组进行调整。
[0004] 迄今，滇南杜鹃没有相关生物技术方法繁殖的研究与报道，为了使滇南杜鹃能广 泛应用于香料生产，解决滇南杜鹃自然匮乏、引种驯化难的问题，以更大的量和更快的速度 供应市场的需求，需要研究该种的组织培养，并形成一套专门的组织培养繁殖技术体系。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供滇南杜鹃的组织培养方法，使之在野外分布区域狭窄，引种 驯化难度大的情况，加快种苗繁殖，使之为香料市场提供足够的原材料，为滇南杜鹃的可持 续利用奠定组培种苗繁育基础。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明提供了如下的技术方案：
[0007] -种滇南杜鹃的组培繁殖方法，该方法包括以下步骤：
[0008] 1)外植体选择与消毒：取滇南杜鹃开花后嫩茎段为外植体，冲洗干净后消毒；
[0009] 2)改良培养基：改良Anderson培养基：将其中的NH4NO3由400mg/L减少为350mg/ L，KNO3由480mg/L减少为380mg/L，其余元素不变；
[0010] 3)丛生芽诱导：丛芽诱导培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+3. Omg/ L2-iP+0. 5mg/L ΖΤ+0. 8mg/L ΙΑΑ+0. 5g/L AC，蔗糖 30g/L，琼脂 7g/L，ρΗ5· 1-5. 2,暗培养 7 天后进行光照培养30天；
[0011] 4)继代培养：继代培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+2mg/L 2-iP+O. 4mg/ L IAA，蔗糖 30g/L，琼脂 7g/L，pH5. 1-5. 2,继代培养 30 天；
[0012] 5)壮苗培养：壮苗培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+lmg/L IAA，蔗糖 35g/L，琼脂 7g/L，ρΗ5· 1-5. 2 ;
[0013] 6)移栽：选取3cm高，茎粗达到I. 进行瓶外生根，用lmg/LNAA泡根1小 时后移栽。
[0014] 根据所述的组培繁殖方法，其中所述丛生芽诱导为全黑暗诱导7天后进行人工辅 助光诱导，光强度为2000LUX，温度为20-23°C ;继代及壮苗培养的光照条件为人工辅助光 2500LUX-3000LUX，温度为 18-23 °C。
[0015] 根据所述的组培繁殖方法，其中所述移栽是壮苗在瓶内生长至3cm高，茎粗达 I. 后经瓶内炼苗后分离，移到瓶外，生根时，将切口泡入lmg/LNAA 1小时后移栽至 大棚。
[0016] 根据所述的组培繁殖方法，其中所述移栽之前，移栽基质用800倍多菌灵进行喷 施消毒，所述移栽基质为底层为碎石，中层为体积比为1份珍珠岩+2份腐殖土 +1份红土， 上层为体积比为1份珍珠岩+1份腐殖土，PH为5. 1-5. 2,大棚温度为20-30°C，空气湿度 50?60%，基质湿度70?80%。
[0017] 本发明的方法可以更具体地表述如下：
[0018] 滇南杜鹃的组培繁殖方法，包括选择外植体、消毒、丛生芽诱导，瓶外移栽生根步 骤，取滇南杜鹃的开花后的新嫩茎段为外植体，消毒先用5ml洗洁精定容于IL水溶液中进 行浸泡清洗20min，再用无菌水冲洗至无泡沫后采用75 %的酒精灭菌20s，无菌水冲洗3遍 后，用0. 1 %升汞溶液添加2滴表面活性剂吐温-20进行表面消毒6min，分两次进行，第一 次消毒4min，不断震荡后用无菌水清洗3-5遍，再用0. 1 %升汞消毒2min后用无菌水清洗 3-5 遍。
[0019] 改良Anderson培养基的制备：因滇南杜醇花生存环境土壤为坡地酸性土壤，低 盐分浓度及高比值NH 4+/N(V对滇南杜鹃的生长较利。材料在改良Anderson培养基中褐 变率低、成活率高。改良Anderson培养基，是将原培养基中NH 4N03400mg/L减少为350mg/ L，原培养基中KNO3由480mg/L减少为380mg/L，其余元素不变。丛芽诱导培养基为改良 Anderson+3. Omg/L 2_iP (2-异戊烯腺噪呤）+0· 5mg/L ZT (玉米素）+0· 8mg/L ΙΑΑ+0. 5g/ L AC (活性炭），pH5. 1-5. 2,蔗糖 30g/L，琼脂 7g/L，pH5. 1-5. 2 ;诱导期加活性炭 0. 5g/L， 降低材料褐化死亡率，丛芽诱导为全黑暗诱导7天后进行人工辅助光诱导30天，光强度为 2000LUX，温度为 20-23°C。
[0020] 继代培养基为改良 Anderson+2mg/l 2-iP+O. 4mg/L IAA，蔗糖 30g/L，琼脂 7g/L， ρΗ5· 1-5. 2,继代培养30天；壮苗培养基为改良Anderson+lmg/L IAA，蔗糖35g/L，琼脂7g/ L，pH5. 1-5. 2 ;瓶外生根为移栽前使用lmg/LNAA泡根1小时候移栽。继代及壮苗培养的光 照条件为人工辅助光2500LUX-3000LUX，温度为20-23°C。
[0021] 移栽是瓶外生根，壮苗在瓶内生长至3cm高，茎粗达到I. 后经棚内炼苗后 分离，将切口泡入lmg/LNAA 1小时后移栽。移栽基质为底层为碎石，中层为1份珍珠岩+2 份腐殖土+1份红土，上层为1份珍珠岩+1份腐殖土（均为体积比，移栽前，移栽基质需用 800倍多菌灵进行喷施消毒），pH为5. 1-5. 2。大棚温度为20-30度，空气湿度50?60%， 基质湿度70?80%。
[0022] 本发明技术方案的提出是基于下述的研究基础：滇南杜鹃为杜鹃花科为数不多的 具有香味的植物，但滇南杜鹃分布区域狭窄，人工引种驯化难，为解决其自然资源少，达到 大量繁殖、保存和可持续利用，故此发明滇南杜鹃的组织培养技术。组培扩繁不仅可以在短 时间内获得大量的再生植株，而且以成年植株为原材料，缩短开花年限，为供应充足的原材 料市场，促进香料提取有积极的作用。
[0023] 相比现有技术，本发明存在如下的优益性和有益效果：
[0024] 1.本发明通过改良基础培养基配方，使得材料成活率较其他常用培养基提高 36% ；
[0025] 2.本发明建立了有效的滇南杜鹃组培快繁方法，解决了其分布狭窄，引种驯化难 的状况；
[0026] 3.本发明通过组培快繁得到的幼苗，成苗容易，保持了木本优良的性状；
[0027] 4.本发明利用一年生枝条进行组培快繁的方法大大缩短了开花年限，使其能迅速 的投入到香料生产原材料供应行列。
[0028] 本发明的组培快繁方法繁育的滇南杜鹃在1个月内增殖系数为10-20,生根率为 80% -90%，移栽成活率为95% -98%，极大地提高了滇南杜鹃的繁殖系数，为该物种的引 种驯化、保存和商业价值发挥利用提供了非常有效的繁殖方法。
【具体实施方式】
[0029] 下面用本发明的具体实施例来进一步阐述本发明的实质性内容，但并不以此来限 定本发明。
[0030] 实施例1
[0031] 1.培养基及基质筛选实施例
[0032] 取滇南杜鹃的开花后的新嫩莖段为外植体,消毒为常规组培外植体消毒,先用5ml 洗洁精定容于IL水溶液中进行浸泡清洗20min，再用无菌水冲洗至无泡沫后采用75 %的酒 精灭菌20s，无菌水冲洗3遍后，用0. 1 %升汞溶液添加2滴表面活性剂吐温-20进行表面 消毒6min，分两次进行，第一次消毒4min，不断震荡后用无菌水清洗5遍，再用0. 1 %升汞消 毒2min后用无菌水清洗5遍。将消毒后的嫩茎段两端褐化组织切去，并将其切成Icm左右 的茎段，每段上至少带一个腋芽。将茎段分别接种在WPM、Read、Anderson、改良Anderson 培养基上。
[0033] 各培养基激素及添加物都为 3. Omg/L 2-iP+O. 5mg/L ΖΤ+0. 8mg/L ΙΑΑ+0. 5g/ LAC (活性炭），蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5. 1-5. 2。暗培养基7天后，光照培养30天统计其 诱导率及新稍长。光强度为2000LUX，温度为18-23°C。
[0034] 表1基本培养基的筛选
【权利要求】
1. 一种滇南杜鹃的组培繁殖方法，其特征在于该方法包括以下步骤： 1) 外植体选择与消毒：取滇南杜鹃开花后嫩茎段为外植体，冲洗干净后消毒； 2) 改良培养基：改良Anderson培养基：将其中的ΝΗ4Ν03由400mg/L减少为350mg/L， ΚΝ03由480mg/L减少为380mg/L，其余元素不变； 3) 丛生芽诱导：丛芽诱导培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+3.0mg/ L2-iP+0. 5mg/L ΖΤ+0. 8mg/L ΙΑΑ+0. 5g/L AC，蔗糖 30g/L，琼脂 7g/L，ρΗ5· 1-5. 2,暗培养 7 天后进行光照培养30天； 4) 继代培养：继代培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+2mg/L 2-iP+O. 4mg/L IAA，蔗糖 30g/L，琼脂 7g/L，pH5. 1-5. 2,继代培养 30 天； 5) 壮苗培养：壮苗培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+lmg/L IAA，蔗糖35g/L， 琼脂 7g/L，ρΗ5· 1-5. 2 ; 6) 移栽：选取3cm高，茎粗达到1. 进行瓶外生根，用lmg/LNAA泡根1小时后 移栽。
2. 根据权利要求1所述的组培繁殖方法，其特征在于所述丛生芽诱导为全黑暗诱导7 天后进行人工辅助光诱导，光强度为2000LUX，温度为20-23°C;继代及壮苗培养的光照条件 为人工辅助光2500LUX - 3000LUX，温度为18-23°C。
3. 根据权利要求1所述的组培繁殖方法，其特征在于所述移栽是壮苗在瓶内生长至 3cm高，茎粗达1. 后经瓶内炼苗后分离，移到瓶外，生根时，将切口泡入lmg/LNAA 1 小时后移栽至大棚。
4. 根据权利要求1所述的组培繁殖方法，其特征在于所述移栽之前，移栽基质用800倍 多菌灵进行喷施消毒，所述移栽基质为底层为碎石，中层为体积比为1份珍珠岩+2份腐殖 土+1份红土，上层为体积比为1份珍珠岩+1份腐殖土，pH为5. 1-5. 2,大棚温度为20-30°C， 空气湿度50?60 %，基质湿度70?80 %。
5. 根据权利要求1所述的组培繁殖方法，其特征在于该方法包括取滇南杜鹃开花后嫩 枝，浸泡于清水中，将材料泡入洗洁精中清洗，然后将其用无菌水冲洗至无泡沫产生，将材 料用洁净的容器带至超净台上，采用75%的酒精灭菌20s，无菌水冲洗3遍后，配置0. 1 %升 汞溶液添加2滴表面活性剂吐温-20进行表面消毒6min，分两次进行，第一次消毒4min，不 断震荡后用无菌水清洗5遍，再用0. 1 %升汞消毒2min后用无菌水清洗5遍待用； 将材料切去两端后，将带芽莖段斜插入丛芽诱导培养基即改良Anderson+3. Omg/ L2-iP+0. 5mg/L ΖΤ+0· 8mg/l IAA+0. 5g/L AC，蔗糖 30g/L，琼脂 7g/L，ρΗ5· 1-5. 2,先进行黑 暗诱导7天后进行人工辅助光诱导，光强度为2000LUX，温度为18-23°C ; 待培养25-35天后，将丛生芽在超净台上分离，接入继代培养基为改良 Anderson+2. 5mg/l 2-iP+O. 8mg/l IAA，鹿糖 30g/L，琼脂 7g/L，ρΗ5· 1-5. 2,进行继代培养； 待继代30天后将苗分离，转接至壮苗培养基改良Anderson+lmg/lIAA，鹿糖35g/L，琼脂7g/ L，pH5. 1-5. 2中培养；继代及壮苗培养的光照条件为人工辅助光2500LUX -3000LUX，温度为 18-23。。； 培养25-35天后，选取3cm高，茎粗达1. 进行瓶外生根，移栽前用lmg/L NAA泡 根1小时，然后移栽入装有移栽基质的盆内，所述移栽基质为底层为碎石，中层为体积比为 1份珍珠岩+2份腐殖土 +1份红土，上层为体积比为1份珍珠岩+1份腐殖土，pH为5. 1-5. 2， 移栽基质使用前用800倍多菌灵进行喷施消毒，移栽盆放在大棚内，培养温度为20-30度， 空气湿度50?60 %，基质湿度70?80 %。
【文档编号】A01H4/00GK104285819SQ201410612891
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】马永鹏, 田晓玲, 罗桂芬, 黄承林 申请人:中国科学院昆明植物研究所