本发明发涉及一种匍枝马尾藻组织培养育苗的方法，属于海藻组织培养技术领域。
技术背景
马尾藻(Sargassumspp.)是褐藻门(Phaephyta)的一属，大多数为暖水性种类，广泛分布于暖水和温水海域。马尾藻属海藻具有较高的经济价值，经加工后可提取褐藻酸、碘晶、甘露醇和高活性膳食纤维等，是重要的工业原料。马尾藻属海藻富含蛋白质、脂肪、氨基酸、多种维生素、钙、钾、镁、锰、锌、碘、磷和硒等营养成份及一些独特的活性物质，如海藻多糖、藻脘酸、高度不饱和脂肪酸等，在食品、医药、保健和养殖生产中也极具开发潜力。另外，马尾藻生长迅速、体型较大，不仅为鱼、虾和贝类提供了优良的栖息场所，而且具有吸收和固定水体中的碳、氮、磷等营养物质，增加水体溶解氧等优点，在海洋生态环境修复等方面也具有重要意义。
匍枝马尾藻作为海南省广泛分布的一类热带大型海藻，不仅可应用于海藻肥、褐藻胶等工业产品的提取及食品、医药等多个领域，产生较高的经济价值；而且在海域生态修复方面，可在短期内形成一定规模的海藻生态系统，有效防治海水富营养化和赤潮的发生，从而改善海水养殖结构。
匍枝马尾藻在自然海区分布广泛，资源丰富，但是它在自然状态下的生长受到严格的季节限制，生物量明显表现出季节变化。在自然海区，匍枝马尾藻的生长周期包括生长期、繁殖期、衰退期、休止期。从每年的8月份到次年的2月份，匍枝马尾藻在自然海区的生长基本处于休止状态。目前匍枝马尾藻种苗生产主要依靠有性繁殖，但由于受到季节的影响，种苗生产受到很大的限制，很难长期大量生产幼苗。因此，如何使匍枝马尾藻种苗的生产摆脱季节限制，成为一个亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是在于提供一种采用组织培养来大量繁育匍枝马尾藻种苗的方法，其不受季节、自然生态条件等限制，需要的外植体材料少、养殖空间少、繁殖量大，可用于增殖或人工栽培。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种采用组织培养来大量繁育匍枝马尾藻种苗的方法，具体步骤如下。
1)选取生长良好的匍枝马尾藻新鲜藻体，去除藻体表面的杂藻和附着物，再用灭菌过滤海水反复冲洗4-6遍。将藻体置于20-22℃，光照强度2000-4000Lx，光周期14D：10L条件下暂养。
2)选取匍枝马尾藻样品中完整的幼嫩侧枝用70-75％酒精消毒5-10秒，然后用质量浓度0.8-1.4％的次氯酸钠消毒处理8-15分钟，再用灭菌海水冲洗2-4遍。将侧枝的茎或叶片切段用镊子放入事前准备好的培养液中；培养液采用PESI培养基；培养温度为20-25℃，光照强度为1000-4000lx，光照周期的光照∶黑暗＝8-10∶16-14h。
3)培养7-10天后茎和叶片切段切口处生出数簇不定芽，培养液5-7天更换一次，培养14-16天后不定芽生成再生叶片；将再生叶片从切段上分离，诱导再生叶片处继续再生出不定芽；以再生叶片为外植体继续再生出不定芽，连续诱导5-6代后产生大量不定芽；培养液采用PESI培养基；培养温度为20-25℃，光照强度为1500-4000lx，光照周期的光照∶黑暗＝8-10∶16-14h。
4)将不定芽从切段分离，离体培养20-25天，诱导不定芽再生出假根形成完整再生苗；培养液采用PESI培养基+0.1～0.5mg/L6-BA，培养温度为24-27℃，光照强度为1500-3000lx，光照周期的光照∶黑暗＝10-12∶12-14h。
所述步骤1)中，匍枝马尾藻样品样暂养培养液为灭菌过滤海水，内含0.05-0.10mol/LNaNO3和0.01-0.05mol/LNaH2PO4。
所述步骤2)中，将幼嫩侧枝的叶片横切成3-5mm切段，将幼嫩侧枝的茎横切成2-5mm的切段放入事前准备好的培养液中培养。
所述步骤2)中，不定芽诱导条件是采用PESI培养基，在20-25℃，光照强度1000-4000lx，光照周期的光照∶黑暗＝8-10∶16-14h条件下在培养。
所述步骤3)中，选取5-10mm的再生叶片横切成2-3mm切段放入事前准备好的培养液中培养。
所述步骤4)中，假根诱导条件是采用PESI培养基+0.1～0.5mg/L6-BA，在24-27℃，光照强度1500-3000lx，光照周期的光照∶黑暗＝10-12∶14-12h条件下在培养。
本发明具有如下优点：
(1)使用样品量少，周期短。本发明利用侧枝的茎或叶片作为外植体，而藻体叶片数量多，在短时间内可以完成再生过程，获得完整的再生苗。
(2)繁殖系数高。本发明获得的再生叶片可以连续多次作为再生源，量大且容易保存，种苗生产不受季节限制。
(3)培养条件容易控制。本发明可以调节培养条件以达到不同的实验目的。
(4)可长期对种质进行保存。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1：PESI培养液的配制
取20mlPESI储存液，用高压灭菌海水定容到1000ml。PESI储存液成分：NaNO3350mg，Na2glycerophosphate·5H2O50mg，Na2-EDTA25mg，FeCl3·6H2O0.25mg，H3BO35mg，MnCl21mg，ZnCl20.125mg，CoCl20.025mg，Tris500mg，KI0.1mg混合，用蒸馏水定容至100ml，pH值为7.6，然后高压灭菌保存于冰箱。
实施例2：匍枝马尾藻样品清洗
选取生长良好的匍枝马尾藻新鲜藻体，解剖镜下用毛刷清去除藻体表面的杂藻和附着物，再用灭菌过滤海水反复冲洗4-6遍。
实施例3：匍枝马尾藻样品暂养
组织培养前，将藻体置于20℃，光照强度2000lx，光周期14D：10L条件下暂养；培养液为灭菌过滤海水，内含0.10mol/LNaNO3和0.05mol/LNaH2PO4。
实施例4：匍枝马尾藻不定芽诱导
选取匍枝马尾藻样品中完整的幼嫩侧枝用70％酒精消毒10秒，然后用质量浓度1.0％的次氯酸钠消毒处理10分钟，再用灭菌海水冲洗4遍。将幼嫩侧枝的叶片横切成3mm切段或幼嫩侧枝的茎横切成2mm的切段用镊子放入事前准备好的培养液中；培养液采用PESI培养基，培养液5天更换一次；培养温度为20℃，光照强度为2000lx，光照周期的光照∶黑暗＝10∶14h。培养10天后茎和叶片切段切口处生出数簇不定芽。
实施例5：匍枝马尾藻不定芽增殖培养
将诱导出的不定芽在22℃，光照强度2000lx，光照周期10L：14D条件下培养15天，不定芽生成再生叶片，每5天换一次培养液；选取10mm的再生叶片从切段上分离，按实施例4方法继续诱导不定芽，连续培养5代，再生叶片生出大量不定芽。
实施例6：不定芽假根诱导
用小镊子将不定芽从切段分离置于PESI培养基+0.1mg/L6-BA，每7天换一次培养基，在24℃，光照强度1500lx，光照周期10L：14D条件下离体培养20-25天诱导不定芽再生出假根形成完整再生苗。