本发明属于生物技术育种技术领域，特别涉及一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法。
背景技术：
苦瓜离体胚挽救是苦瓜种质创制的重要途径之一。该方法可用于远缘杂交，利用具有相关抗性的资源来改良栽培品种，通过转育相关基因提高抗病性，而具有综合抗性好的资源一般为葫芦科中与苦瓜不同属的资源或苦瓜属中不同种的资源。这些资源与常规栽培种进行杂交，往往产生胚败育的现象，不能成功获得杂交种，需要在胚败育前进行挽救。苦瓜离体胚挽救也可用于诱变育种，用辐照过已受损伤的花粉来刺激子房膨大，剖开膨大的果实取种子进行离体胚挽救来获得再生苗。苦瓜在离体培养的过程中，容易愈伤化，即使是在没有激素的MS培养基中也一样产生愈伤现象，愈伤化的组织极难分化不定芽，常是多次继代后褐化死亡。在进行胚挽救时，既要考虑胚挽救效果，又要考虑胚挽救时期，太早由于种子属于活动旺盛的分生组织，培养易愈伤化，种子也难从果实中分离出来，增加培养难度，降低出苗率。太晚，胚已败育，不能获得植株。因此，胚挽救时期、接种方式和防止种子愈伤化的方法是提高苦瓜胚挽救成苗的关键。目前，有关苦瓜离体胚挽救成苗的方法的研究还未见有相关报道。公开于该
背景技术：
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现要素：
针对现有苦瓜离体胚挽救的不足，本发明公开了一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，解决苦瓜远缘杂交胚败育问题，提高辐射花粉授粉离体胚的成苗率，推进苦瓜抗性育种进程。为了实现上述目的，本发明是采用以下技术方案实现：一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：(1)授粉：为远缘杂交授粉或辐射花粉授粉；(2)胚挽救时期：取授粉后第5～10d的果实；(3)种子培养前处理：在无菌条件下，剖开果实取出种子，将种子置于MS培养基中，并于暗培养条件下培养10～15d；(4)接种方式：前处理结束后，切掉大部分种子，保留1/4含胚部分，放入MS培养基中培养，经7～20d光培养后，挑出绿胚并继续放MS培养基中培养，直至胚萌发成苗；(5)增殖培养：将含有子叶、真叶的苗，切掉顶芽并置于MS培养基培养，待子叶的腋芽长出后，切下腋芽继续置于MS培养基中培养；(6)生根培养：将未生根的苗置于生根诱导培养基进行生根诱导，将已生根的苗直接进行移栽前处理；(7)移栽前处理：将已生根的苗炼苗5～7d后，取出生根苗，洗净培养基，栽入基质中，盖膜保温保湿，温度25～30℃，湿度90～95％；(8)移栽：掀开膜后保持基质湿润，喷1次营养液，以叶面不滴水珠为止，待根系发育成侧根发达的根团时，即可移栽定植。作为优选，步骤(1)中所述的远缘杂交授粉为：把次日要开放的待改良的雌花套袋隔离，次日早上8～10时，采集当日开放、抗性好资源的雄花给套袋的雌花授粉，授粉后继续套袋隔离至座果，获得膨大果实。作为优选，所述抗性好的资源指葫芦科中与苦瓜不同属的资源或苦瓜属中不同种的资源。作为优选，步骤(1)中所述的辐射花粉授粉为：于早上8～10时采集次日开放的雄花，装入防水袋中，即进行C060y射线辐射，辐射剂量为150GY；并于取雄花当天下午把要授粉的雌花套袋，用辐照过的花粉授粉并作好标记，继续套袋隔离至座果，获得膨大果实。作为优选，步骤(3)中暗培养条件为温度24～28℃，光照时间0h/d。作为优选，步骤(4)中光培养条件为温度24～28℃，光强2000Lux，光照时间8h/d。作为优选，步骤(6)中所述的生根诱导培养基为1/2MS+IBA0.05mg/L。作为优选，步骤(7)中的基质是由蛭石和苦瓜专用基质按照体积比为1：1组成。作为优选，步骤(8)中的营养液为大量元素减半的MS培养基。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明的方法可减少嫩种子的愈伤率，使胚挽救时期提前至授粉后第5d；通过暗培养处理使种子处于失绿状态，幼胚周围的液体消失，没有胚部分的种壳变得中空，不跟幼胚争夺养分，且由于失绿而减少愈伤率。(2)本发明的方法可提高离体胚挽救的效率，可使胚萌发成苗率提高15％以上。由于整个种子培养幼胚难以突破种皮，几乎没有成苗。切掉大部分种子，培养1/4含胚部分，有利幼胚吸收培养基中营养，促进生长发育；同时有利减少人工剥离种壳取胚的工作量，减少污染机率，大大减少影响成苗率的人为因素。(3)本发明的方法可解决苦瓜远缘杂交胚败育问题，提高辐射花粉授粉离体胚的成苗率，推进苦瓜抗性育种进程。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例1：一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：(1)授粉：本试验采用的苦瓜材料为MC6；为远缘杂交授粉；所述的远缘杂交授粉为：把次日要开放的待改良的雌花套袋隔离，次日早上8时，采集当日开放、抗性好资源的雄花给套袋的雌花授粉，授粉后继续套袋隔离至座果，获得膨大果实；所述抗性好的资源指葫芦科中与苦瓜不同属的资源或苦瓜属中不同种的资源；(2)胚挽救时期：取授粉后第5d的果实；(3)种子培养前处理：在无菌条件下，剖开果实取出种子，将种子置于MS培养基中，并于暗培养条件下培养10d；暗培养条件为温度24℃，光照时间0h/d；(4)接种方式：前处理结束后，切掉大部分种子，保留1/4含胚部分，放入MS培养基中培养，经7d光培养后，挑出绿胚并继续放MS培养基中培养，直至胚萌发成苗；光培养条件为温度24℃，光强2000Lux，光照时间8h/d；(5)增殖培养：将含有子叶、真叶的苗，切掉顶芽并置于MS培养基培养，待子叶的腋芽长出后，切下腋芽继续置于MS培养基中培养；(6)生根培养：将未生根的苗置于生根诱导培养基进行生根诱导，将已生根的苗直接进行移栽前处理；所述的生根诱导培养基为1/2MS+IBA0.05mg/L；(7)移栽前处理：将已生根的苗炼苗5d后，取出生根苗，洗净培养基，栽入基质中，盖膜保温保湿，温度25℃，湿度90％；基质是由蛭石与苦瓜专用基质的体积比为1：1组成；所述的苦瓜专用基质为长春赛世农业开发有限责任公司生产的全价育苗基质；(8)移栽：掀开膜后保持基质湿润，喷1次营养液，以叶面不滴水珠为止，待根系发育成侧根发达的根团时，即可移栽定植；营养液为大量元素减半的MS培养基。实施例2：一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：(1)授粉：本试验采用的苦瓜材料为MC8；为辐射花粉授粉；所述的辐射花粉授粉为：于早上8时采集次日开放的雄花，装入防水袋中，即进行C060y射线辐射，辐射剂量为150GY；并于取雄花当天下午把要授粉的雌花套袋，用辐照过的花粉授粉并作好标记，继续套袋隔离至座果，获得膨大果实；(2)胚挽救时期：取授粉后第5d的果实；(3)种子培养前处理：在无菌条件下，剖开果实取出种子，将种子置于MS培养基中，并于暗培养条件下培养10d；暗培养条件为温度24℃，光照时间0h/d；(4)接种方式：前处理结束后，切掉大部分种子，保留1/4含胚部分，放入MS培养基中培养，经20d光培养后，挑出绿胚并继续放MS培养基中培养，直至胚萌发成苗；光培养条件为温度28℃，光强2000Lux，光照时间8h/d；(5)增殖培养：将含有子叶、真叶的苗，切掉顶芽并置于MS培养基培养，待子叶的腋芽长出后，切下腋芽继续置于MS培养基中培养；(6)生根培养：将未生根的苗置于生根诱导培养基进行生根诱导，将已生根的苗直接进行移栽前处理；所述的生根诱导培养基为1/2MS+IBA0.05mg/L；(7)移栽前处理：将已生根的苗炼苗7d后，取出生根苗，洗净培养基，栽入基质中，盖膜保温保湿，温度30℃，湿度95％；基质是由蛭石与苦瓜专用基质的体积比为1：1组成；所述的苦瓜专用基质为长春赛世农业开发有限责任公司生产的全价育苗基质；(8)移栽：掀开膜后保持基质湿润，喷1次营养液，以叶面不滴水珠为止，待根系发育成侧根发达的根团时，即可移栽定植；营养液为大量元素减半的MS培养基。实施例3：一种提高苦瓜离体胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：(1)授粉：本试验采用的苦瓜材料为MC9；为远缘杂交授粉；所述的远缘杂交授粉为：把次日要开放的待改良的雌花套袋隔离，次日早上9时，采集当日开放、...