本发明涉及昆虫低温驯化方法领域，具体为川硬皮肿腿蜂的一种长时低温驯化方法。
背景技术：
：川硬皮肿腿蜂SclerodermasichuanensisXiao是1994年发现的寄生粗鞘双条杉天牛幼虫和蛹的外寄生蜂。该蜂寄主范围广、搜索攻击力强、寄生率高，是一种能有效防治部分天牛、小蠹、吉丁虫和象甲等林木钻蛀性害虫的优良寄生蜂。其中以对天牛的控制效果最显著。该蜂的发现和大规模人工繁育应用是“杉天牛综合防治技术研究”和“经济林钻蛀害虫无公害防治技术研究”两个科研成果(四川省政府，1998、2005年科技进步二等奖)的主要组成部分，在肿腿蜂的大规模人工繁育
技术领域：
已取得突破性进展，可以常年批量生产。研究表明，川硬皮肿腿蜂不仅是控制杉棕天牛、粗鞘双条杉天牛、花椒虎天牛、青杨天牛和苹眼天牛等中小型天牛的理想天敌，而且对松褐天牛、星天牛、云斑天牛等中大型天牛的防控效果也较显著。松材线虫病是由松材线虫引起的一种毁灭性森林病害，传染力强、致死速度快、防治难度大，被誉为松树的“癌症”。松褐天牛是松材线虫的关键传播媒介，减少和控制松褐天牛种群数量、有效切断松材线虫传播途径是目前松材线虫病的重要防控策略。松材线虫病在我国已呈现由南向北扩散的趋势，一部分松材线虫和松褐天牛分布区冬季气温大都在零下，因此控制松褐天牛种群的肿腿蜂能否在这些寒冷地区越冬是影响其持续控制效果的关键。野外放蜂试验表明，未经驯化的川硬皮肿腿蜂很难在寒冷地区(冬季气温大多在零下)越冬，这不仅严重影响了该蜂对寒冷地区松褐天牛种群的持续控制效果，而且也大大限制了该蜂在其它寒冷地区林木钻蛀性害虫生物防治中的应用。积极探索有效的低温驯化方法，逐步提高川硬皮肿腿蜂的耐寒性，获得低温耐寒品系，是解决该蜂在寒冷地区顺利越冬的关键。技术实现要素：本发明的目的是提供一种高效便捷的川硬皮肿腿蜂长时低温驯化方法，该方法得到的川硬皮肿腿蜂耐寒性显著增强，可获得低温耐寒品系。本发明的具体技术方案为：川硬皮肿腿蜂的一种长时低温驯化方法，包括以下步骤：(1)驯化种蜂选择选择室温培育、发育健康的高龄蛹作为驯化材料；(2)低温驯化处理在5～7℃下培育14～16d作驯化处理；(3)定向驯化第一代高龄蛹低温驯化后置室温条件下培养至成蜂羽化，取成活下来的雌成蜂在室温条件下进行下一代蜂培育，待蜂发育至高龄蛹阶段又进行低温驯化处理，连续驯化n(n≧8)代。所述的高龄蛹为化蛹后10～14d的蛹。本发明的积极效果体现在：(1)可用于驯化培育川硬皮肿腿蜂耐寒品系，满足寒冷地区松褐天牛及其它林业钻蛀性害虫生物防治的需要；(2)受驯蜂的过冷却点、体液结冰点及半致死低温死亡率(TL50)和冷识别温度下死亡率均显著降低；(4)受驯蜂虫体耐寒物质如结合水、粗脂肪、小分子醇类(包括甘油、山梨醇和甘露醇)和糖原等的含量显著升高；(3)受驯蜂的发育历期和寄生繁殖能力不受影响。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。川硬皮肿腿蜂的培育方法可以参考现有技术，或参考申请号为200510020659.4进行繁殖培育。实施例1：川硬皮肿腿蜂的一种长时低温驯化方法，包括以下步骤：(1)驯化种蜂选择选择室温培育、发育健康的高龄蛹作为驯化材料；(2)低温驯化处理在6℃下驯化15d；(3)定向驯化第一代高龄蛹低温驯化后转发至室温条件下继续培养至成蜂羽化，取成活下来的雌成蜂在室温条件下进行下一代蜂培育，待蜂发育至高龄蛹阶段又进行低温驯化处理，连续驯化9代。所述的高龄蛹为化蛹后14d的蛹。驯化效果检测分别对第4～9代受驯蜂的发育历期、过冷却点、结冰点、半致死低温(TL50)死亡率、冷识别温度下的死亡率和寄生繁殖能力及虫体主要耐寒物质含量(包括虫体水分、粗脂肪和甘油、山梨醇、甘露醇等小分子醇类及糖原的含量)进行检测。结果表明，低温驯化对川硬皮肿腿蜂的发育历期和寄生繁殖能力无显著影响(表1和表5)；低温驯化可显著降低川硬皮肿腿蜂的过冷却点、结冰点、半致死低温(TL50)死亡率和冷识别温度下的死亡率(表2～表4)，大大提高虫体耐寒物质：结合水、粗脂肪、甘油、山梨醇和甘露醇等小分子醇类和糖原的含量(表6～表8)。即：所述低温驯化方法是可行的，能显著提高川硬皮肿腿蜂的耐寒性，逐代定向驯化可获得其低温耐寒品系。表1低温驯化对川硬皮肿腿蜂发育历期的影响注：表1中数据为3次重复的平均值±标准差。表中同行数据后字母不同者差异显著(LSD，P<0.05)。表2低温驯化对川硬皮肿腿蜂成虫过冷却点和结冰点的影响处理代数过冷却点结冰点对照组-13.52±1.22b-9.44±1.88b长时低温驯化4代-14.06±0.32ab-10.35±0.34ab长时低温驯化5代-14.09±0.35ab-10.42±0.56ab长时低温驯化6代-14.17±0.28ab-10.78±0.63ab长时低温驯化7代-14.24±0.38ab-10.92±0.53ab长时低温驯化8代-14.49±0.41a-11.55±0.48a长时低温驯化9代-14.56±0.50a-11.78±0.48a表3低温驯化对川硬皮肿腿蜂成虫在TL50下的死亡率的影响表4低温驯化对川硬皮肿腿蜂成虫在冷识别温度下的死亡率的影响处理代数冷识别温度下死亡率对照组79.67±1.53b长时低温驯化4代62.33±5.69a长时低温驯化5代61.28±4.36a长时低温驯化6代59.47±4.62a长时低温驯化7代58.23±5.17a长时低温驯化8代57.00±5.57a长时低温驯化9代55.34±4.48a表5低温驯化对川硬皮肿腿蜂成虫繁殖能力的影响驯化代数寄生率(％)产卵量(粒/雌)对照组83.33±1.15b19.47±0.89b长时低温驯化4代70.67±3.05a16.32±0.46a长时低温驯化5代72.98±5.25a16.47±0.32a长时低温驯化6代75.25±3.14ab17.21±0.53a长时低温驯化7代77.56±4.27ab18.59±0.34ab长时低温驯化8代83.33±1.15b19.42±0.23b长时低温驯化9代83.79±1.65b19.73±0.56b表6低温驯化对川硬皮肿腿蜂成虫虫体含水量的影响表7低温驯化对川硬皮肿腿蜂成虫虫体糖类和粗脂肪含量的影响驯化代数糖原(ug/mg)总糖(ug/mg)粗脂肪(％)对照组4.78±1.15a14.54±1.70a11.82±0.46a长时低温驯化4代8.18±0.60b16.21±0.72a15.31±0.37b长时低温驯化5代8.49±0.81b16.47±1.21a15.52±0.56b长时低温驯化6代9.17±1.03b17.43±0.87ab15.96±0.47b长时低温驯化7代10.99±0.75bc18.21±1.06ab16.18±0.52b长时低温驯化8代11.64±0.54c19.59±0.88b16.47±1.12b长时低温驯化9代11.87±0.68c19.76±1.13b16.52±0.64b表8低温驯化对川硬皮肿腿蜂成虫虫体小分子醇类含量的影响驯化代数甘油(ug/mg)山梨醇(ug/mg)甘露醇(％)对照组3.72±0.55a5.09±0.58a0.49±0.08a长时低温驯化4代7.13±0.46b13.16±0.79b1.34±0.25ab长时低温驯化5代7.26±0.43b13.47±0.51b1.33±0.34ab长时低温驯化6代7.42±0.67bc13.98±0.45b1.35±0.21ab长时低温驯化7代7.69±0.42bc14.62±0.67bc1.37±0.16ab长时低温驯化8代7.84±0.56c15.59±0.91c1.45±0.10b长时低温驯化9代7.93±0.37c15.75±0.84c1.46±0.25b注：表2～表8中数据为3次重复的平均值±标准差。表中同列数据后字母不同者差异显著(LSD，P<0.05)。川硬皮肿腿蜂长时低温驯化条件筛选，包括以下步骤(1)种蜂选择选择室温(26℃±1℃)培育、发育健康的川硬皮肿腿蜂卵(3d)、低龄幼虫(孵化后3d)、高龄幼虫(孵化后6d)、低龄蛹(化蛹后7d)、高龄蛹(化蛹后14d)、成虫(羽化后7d)作为供试材料，供试材料由四川农业大学川硬皮肿腿蜂繁育中心提供。(2)低温暴露处理将上述供试川硬皮肿腿蜂卵、幼虫、蛹和成虫分别置0℃、3℃、6℃、9℃下暴露5d、10d、15d后取出。每处理重复3次，每次重复的供试虫数如下。成虫：100头/次；卵：200粒/次；幼虫和蛹：200头/次。以室温培养，未经过任何低温处理的川硬皮肿腿蜂卵、幼虫、蛹和成虫为对照。(3)低温暴露后的培养观察将低温暴露处理后的供试蜂置室温下正常培养。对低温暴露的卵、幼虫和蛹分别观察其孵化、结茧(或化蛹)和羽化情况，以此确定供试卵、幼虫和蛹的死亡和存活数；对低温暴露的成虫，培养24h后观察记录其死亡和存活数。(4)低温暴露死亡率比较供试川硬皮肿腿蜂卵、幼虫、蛹和成虫的低温暴露死亡率见表9。(5)长时低温驯化条件筛选为保证驯化成功，一般需将供试材料的死亡率控制50％左右，这样既能让供试材料得到驯化，也能保证驯化后有一定的存活量，以利于下一轮驯化。川硬皮肿腿蜂为外寄生蜂，其卵和幼虫附着于寄主体表，受干扰易脱落，卵和幼虫一旦脱落就会因得不到营养供给而干瘪死亡，不宜作为驯化材料；当其发育至蛹期(特别高龄蛹阶段)，成熟的蜂蛹会从寄主上自然脱落，选择此时驯化对该蜂发育影响较小；到了成虫期，蜂个体发育已完全成熟，表现出对供试低温驯化强度不敏感。综合考虑，选择了高龄蛹50％左右死亡率对应的长时低温处理作为最优驯化条件，即：高龄蛹(化蛹后14d)6℃下驯化15d。表9川硬皮肿腿蜂不同发育阶段的长时低温暴露死亡率注：表9中数据为3次重复的平均值±标准差，同行数据后字母不同者差异显著(LSD，P<0.05)。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。当前第1页1 2 3