一种瓦氏秋海棠的离体再生方法与流程

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种瓦氏秋海棠的离体再生方法。
背景技术：
：瓦氏秋海棠(BegoniawallichianaLehm)为秋海棠科(Begoniaceae)秋海棠属(Begonia)多年生草本植物，原产于北美洲墨西哥等地。瓦氏秋海棠生长速度快，四季均可开花，雌雄同株异花，花白色；同时，其抗性较强，叶表面被生纤毛，不容易滋生病虫害，是一个潜在的成为模式植物的候选物种，也是一种良好的家庭观赏植物。但是，瓦氏秋海棠的种子细小，体积仅是拟南芥种子的一半大小，肉眼难辨，单株种植困难，并且，在温室或自然条件下，瓦氏秋海棠扦插不易成活，无法大量繁殖。目前，还没有见到瓦氏秋海棠组织培养的相关报道，因此，需要建立瓦氏秋海棠的离体培养和再生体系的方法，既可用于大量快繁，也为将来进行瓦氏秋海棠的分子育种及秋海棠属的分子生物学研究建立基础。技术实现要素：本发明的目的是提供一种瓦氏秋海棠的离体再生方法，有针对性地诱导瓦氏秋海棠叶片形成不定芽，继而诱导根的发育，最终使试管苗能够发育成为完整的植株，移栽成活率达到95％以上，繁殖周期约40～60天，增殖系数约为3～5左右，可以有效地扩繁和再生瓦氏秋海棠。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：一种瓦氏秋海棠的离体再生方法，包括如下步骤：1)萌发培养将瓦氏秋海棠种子消毒，然后播种于萌发培养基上，进行光照培养，培养温度为20～25℃，光照时间为12～18小时/天，种子生长10～15天后萌发，形成幼苗，待子叶抽出后，将幼苗分成单株，移苗至萌发培养基上，继续培养至长出叶片；2)诱导培养将步骤1)的幼叶剪切为面积在0.5～1cm2的叶片，作为外植体，接种于诱导培养基上进行光照培养20～30天，诱导产生愈伤组织和不定芽，培养温度为20～25℃，光照时间为12～18小时/天；其中，诱导培养基中含有：MS培养基，6-BA4.0～6.0mg/L，NAA0.1～0.4mg/L，2,4-D0.1～0.2mg/L和植物凝胶3～4g/L，pH调节到5.8～6.2；3)生根培养将步骤2)中获得的不定芽置于生根培养基中，进行生根培养，培养15～20天，获得瓦氏秋海棠的生根苗；4)移栽将步骤3)获得的生根苗移栽至栽培基质中，覆盖保鲜膜保湿，在温室中光照培养3～7天，揭膜，转入自然光下继续生长，及时浇水，施肥，经常规培养后获得瓦氏秋海棠栽培苗。进一步，步骤1)中所述的萌发培养基中包含：1/2MS培养基或MS培养基，蔗糖10～30g/L和植物凝胶3～4g/L，pH为5.8～6.2；步骤3)中生根培养基包含1/2MS，NAA0.1～0.3mg/L，植物凝胶3～4g/L。又进一步，步骤4)中所述的栽培基质为由蛭石：珍珠岩：土按体积比为1：1～2：1～2制成的混合基质。优选地，步骤1)中对瓦氏秋海棠种子进行消毒的过程为：将瓦氏秋海棠种子用酒精消毒8～10秒钟，去除酒精，加入次氯酸钠溶液消毒3～5分钟，弃去消毒液，再用无菌水洗3～5次。又优选地，步骤1)中，将瓦氏秋海棠的种子在消毒后用灭菌的0.1％低熔点琼脂糖悬浮。本发明提供另一种瓦氏秋海棠的离体再生方法，包括以下步骤：1)诱导培养将野外生长的瓦氏秋海棠叶片剪切为面积在0.5～1cm2的叶片，作为外植体，接种于诱导培养基上进行光照培养20～30天，诱导产生不定芽和愈伤组织，培养温度为20～25℃，光照时间为12～18小时/天；其中，诱导培养基中含有：MS培养基，6-BA4.0～6.0mg/L，NAA0.1～0.4mg/L，2,4-D0.1～0.2mg/L和植物凝胶3～4g/L，pH调节到5.8～6.2；2)生根培养将步骤1)中获得的不定芽插入到生根培养基中，进行生根培养，培养15～20天，获得瓦氏秋海棠的生根苗；3)移栽将步骤2)获得的生根苗移栽至栽培基质中，覆盖保鲜膜保湿，在温室中光照培养3～7天，揭膜，转入自然光下继续生长，及时浇水，施肥，经常规培养后获得瓦氏秋海棠栽培苗。进一步，步骤2)中的生根培养基包含1/2MS培养基，NAA0.1～0.3mg/L，植物凝胶3～4g/L。优选地，进行诱导培养时，在将所述的外植体接种至诱导培养基前，先对其进行消毒，利用0.1％HgCl溶液对叶片消毒4～8分钟。本发明所述的MS培养基为国际通用的培养基，其成分和配制方法参看谭文澄、戴策刚主编《观赏植物组织培养技术》，北京：中国林业出版社，1991，1/2MS培养基是指MS培养基中的无机盐成分含量减半。本发明所述各种培养基中添加的植物凝胶起支撑固定作用，其也可由琼脂等常用支撑固定材料代替。在离体培养条件下，培养基中植物生长调节剂对于细胞脱分化起关键性作用。本发明通过在培养基中添加植物生长调节剂，能够有目的地诱导瓦氏秋海棠不定芽的形成。由外植体直接诱导不定芽时，不定芽的诱导主要靠细胞分裂素6-BA(即6-苄基氨基嘌呤)和生长素NAA(即α-奈乙酸)的共同作用。现有技术中，诱导愈伤组织时，生长素类物质大多选用2，4-D(即2，4-二氯苯氧乙酸)或者NAA，或者2，4-D和NAA共同使用。但是，经过实验发现，在瓦氏秋海棠的愈伤组织的诱导过程中，由于基物种差异，选用上述方案时，在不使用细胞分裂素6-BA的情况下，会导致外植体直接死亡；添加细胞分裂素6-BA和生长素NAA时，并不能很好地诱导瓦氏秋海棠不定芽的产生，而在添加6-BA的情况下，当生长素NAA和2,4-D联合使用时，愈伤组织的形成和不定芽的产生则容易得多。本发明选择6-BA，NAA和2，4-D搭配使用，并合理配置其含量，可以很好地诱导不定芽和愈伤的产生，出芽率达到50～65％。经过生根，最终使试管苗能够发育成为完整的植株，移栽成活率达到95％以上，为今后更进一步利用该物种奠定良好的基础。本发明在将瓦氏秋海棠的种子在消毒后用灭菌的0.1％低熔点琼脂糖悬浮，再点播于萌发培养基上，可以使瓦氏秋海棠的种子均匀地分散在培养基中。瓦氏秋海棠种子细小，此方法可避免种子聚集在一起，从而提高种子萌发率和便于移栽。本发明的有益效果：本发明结合瓦氏秋海棠的生长特点，诱导过程中，在培养基中添加了合适含量的6-BA，NAA和2，4-D，能够有针对性地诱导瓦氏秋海棠的叶片形成不定芽，继而诱导生根，最终发育成为完整的植株，移栽成活率达到95％以上。附图说明图1为本发明实施例1中在萌发培养基上萌发的幼苗。图2为本发明实施例1中培养至长出幼叶的幼苗。图3为本发明实施例1中接种至诱导培养基上的外植体。图4为本发明实施例1中外植体在诱导培养基上形成的愈伤组织和不定芽。图5为本发明实施例1中不定芽转移到生根培养基中获得的生根苗。图6为本发明实施例1中的生根苗移栽后的瓦氏秋海棠栽培苗。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1一种瓦氏秋海棠的离体再生方法，包括如下步骤：1)萌发培养将瓦氏秋海棠种子消毒，然后用灭菌的0.1％低熔点琼脂糖悬浮，点播于萌发培养基上，进行光照培养，培养温度为20～25℃，光照时间为16小时/天，种子生长10～15天后萌发(参见图1)，萌发率几乎100％，形成幼苗，当小苗基部有少量根出现时，将幼苗分单株移苗，继续在萌发培养基上培养，长出幼叶，直至叶片展开(参见图2)。其中，所述的萌发培养基包含：MS培养基2.2g/L，蔗糖20g/L和植物凝胶4g/L，pH为5.8～6.2；2)诱导培养将步骤1)的幼叶剪切为面积在0.5～1cm2的叶片，作为外植体，接种于诱导培养基上(参见图3)，进行光照培养20～30天，诱导产生愈伤组织和不定芽(参见图4)，培养温度为20～25℃，光照时间为16小时/天；其中，诱导培养基含有：MS培养基，6-BA4.0mg/L，NAA0.2mg/L，2,4-D0.1mg/L和植物凝胶4g/L，pH调节到5.8～6.2；不定芽的出芽率可达50～65％，增殖系数在3～5左右，诱导培养基处理条件及出芽率参见表1。表1从表1可以看出，在诱导培养基中分别单独缺少6-BA，NAA或2,4-D时，外植体几乎不能够正常生长，也不能正常形成愈伤组织和诱导出不定芽。其中，6-BA对瓦氏秋海棠的愈伤组织形成和不定芽诱导起主导性作用。3)生根培养将步骤2)中获得的不定芽移植到生根培养基中，进行生根培养，培养15天，获得瓦氏秋海棠的生根苗(参见图5)；4)移栽将步骤3)获得的生根苗移栽至栽培基质中，覆盖保鲜膜保湿，在温室中光照培养3～7天，揭膜，转入自然光下继续生长，及时浇水，施肥，经常规培养后获得瓦氏秋海棠栽培苗(参见图6)，移栽成活率95％左右。实施例2一种瓦氏秋海棠的离体再生方法，包括如下步骤：1)诱导培养将来自野外生长的瓦氏秋海棠叶片作为外植体，剪切成面积为0.5～1cm2的叶片，消毒处理条件参见表2。表2编号消毒方法外植体数外植体成活率本发明10.1％HgCl，8分钟2069％本发明20.1％HgCl，4分钟2069％对比例170％酒精30秒，0.1％HgCl8分钟200％由表2可见，经70％酒精处理30秒后再利用0.1％HgCl处理的外植体全部死亡，而本发明在利用野外生长的瓦市秋海棠叶片时，采用0.1％HgCl溶液对叶片消毒4～8分钟，可以保证外植体消毒彻底，并且有较高的存活率。将消毒后的外植体接种于诱导培养基上，进行光照培养20～30天，诱导产生不定芽，培养温度为25℃，光照时间为16小时/天；其中，诱导培养基含有：MS培养基，6-BA4.0mg/L，NAA0.2mg/L，2,4-D0.1mg/L和植物凝胶4g/L，pH调节到5.8～6.2；增殖系数3～5左右。2)生根培养将步骤2)中获得的不定芽移植到生根培养基中，进行生根培养，培养15～20天，获得瓦氏秋海棠的生根苗。3)移栽将步骤3)获得的生根苗移栽至栽培基质中，覆盖保鲜膜保湿，在温室中光照培养1周，揭膜，转入自然光下继续生长，及时浇水，施肥，经常规培养后获得瓦氏秋海棠栽培苗，移栽成活率95％左右。当前第1页1 2 3