本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种促进月季种子无菌萌发的方法。
背景技术：
月季(Rosa chinensis)是蔷薇科蔷薇属的植物，原产于中国，其用途广泛，有“花中皇后”、“花中女王”的美誉。月季是我国十大名花之一，是当今世界四大鲜切花之一。种子繁殖是月季进行育种的关键环节之一，但蔷薇属植物的种子都具有休眠的特性，萌发困难，自然发芽率极低，常规方法发芽率通常低于10％，且发芽时间长，整齐度差。因此，打破种子休眠是种子萌发的根本前提。月季种子必须经历一定时间的低温层积才能解除休眠。
目前，低温层积的传统做法是：利用冬季低温条件，将种子埋藏在沙子中，经过一段时间后，即可使种子萌发。这种打破种子休眠的方法将时间限制在冬天，具有一定的局限性，一定程度上限制了月季育种的工作进程。尤其是在进行月季的远缘杂交育种中，利用胚挽救技术获得月季组培植株的方法需要经历的时间更长。若能够人为控制层积的温度，将低温层积与无菌技术相结合，则可有效快速地获得月季的无菌组培苗，有利于缩短月季远缘杂交育种的进程。目前尚未有将低温层积与无菌相结合的技术方法应用于月季种子的无菌萌发上。
技术实现要素：
针对现有技术的不足之处，本发明提供一种促进月季种子无菌萌发的方法，从而可以达到提高月季种子的发芽率。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种促进月季种子无菌萌发的方法，包括如下步骤：
(1)河沙的无菌处理：将湿润的河沙装入组培瓶中，沙子体积为组培瓶容积的1/2，然后采用高压蒸汽消毒，在压力为0.1013Mpa、温度为121℃的条件下进行消毒，消毒时间为25-30min，灭菌后使其自然冷却，备用；
(2)无菌水的制备：在组培瓶中装入70-80mL的自来水，然后采用高压蒸汽消毒，在压力为0.1013mPa、温度为121℃的条件下进行消毒，消毒时间为25-30min，得到无菌水；
(3)种子的无菌处理：灭菌前，先将月季种子倒入盛有清水的容器中，并分搅拌，捞出漂浮在水面的瘪种子和杂质，然后在自来水中浸泡24h，浸泡完成后即可进行灭菌处理：先将月季种子先用0.1-0.5％洗衣粉溶液中浸泡30min后，然后在流水下冲洗30min，再转入超净工作台上，用75％乙醇浸泡种子20-30s，无菌水冲洗3次；再用0.1％升汞溶液浸泡种子12-15min，此操作过程中轻轻震荡月季种子，使升汞溶液很好地接触种子，最后无菌水冲洗3次，得到无菌月季种子；
(4)种子的预处理：将无菌月季种子用浓度为200-250mg/L的无菌GA3溶液浸泡24h，备用；
(5)无菌低温层积：在超净工作台上，将经过无菌处理的月季种子埋入经高温灭菌的沙子中，并在沙子中加入无菌水使其保持湿润，种子播种完毕，将装有沙子的组培瓶置于冰箱的冷藏室进行冷藏40-60d；待冷藏结束后，将组培瓶移入培养室进行常温遮光培养10-15d，待遮光培养结束后统计出芽率。
作为优选，步骤(1)中所述的组培瓶规格为240mL，直径68mm，口径62mm，高90mm。
作为优选，步骤(5)中冷藏室的温度设定为4-7℃。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的促进月季种子无菌萌发的方法将低温层积与无菌相结合的技术方法应用于月季种子的无菌萌发上，可显著提高月季种子的出芽率，出芽时间短，可有效快速地获得月季的无菌组培苗，有利于缩短月季远缘杂交育种的进程。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1：
一种促进月季种子无菌萌发的方法，包括如下步骤：
(1)河沙的无菌处理：将湿润的河沙装入组培瓶中，沙子体积为组培瓶容积的1/2，然后采用高压蒸汽消毒，在压力为0.1013Mpa、温度为121℃的条件下进行消毒，消毒时间为30min，灭菌后使其自然冷却，备用；所述的组培瓶规格为240mL，直径68mm，口径62mm，高90mm；
(2)无菌水的制备：在组培瓶中装入80mL的自来水，然后采用高压蒸汽消毒，在压力为0.1013mPa、温度为121℃的条件下进行消毒，消毒时间为30min，得到无菌水；
(3)种子的无菌处理：灭菌前，先将月季种子倒入盛有清水的容器中，并分搅拌，捞出漂浮在水面的瘪种子和杂质，然后在自来水中浸泡24h，浸泡完成后即可进行灭菌处理：先将月季种子先用0.5％洗衣粉溶液中浸泡30min后，然后在流水下冲洗30min，再转入超净工作台上，用75％乙醇浸泡种子30s，无菌水冲洗3次；再用0.1％升汞溶液浸泡种子15min，此操作过程中轻轻震荡月季种子，使升汞溶液很好地接触种子，最后无菌水冲洗3次，得到无菌月季种子；
(4)种子的预处理：将无菌月季种子用浓度为250mg/L的无菌GA3溶液浸泡24h，备用；
(5)无菌低温层积：在超净工作台上，将经过无菌处理的月季种子埋入经高温灭菌的沙子中，并在沙子中加入无菌水使其保持湿润，种子播种完毕，将装有沙子的组培瓶置于冰箱的冷藏室进行冷藏60d；待冷藏结束后，将组培瓶移入培养室进行常温遮光培养15d，待遮光培养结束后统计出芽率；冷藏室的温度设定为7℃。
实施例2：
一种促进月季种子无菌萌发的方法，包括如下步骤：
(1)河沙的无菌处理：将湿润的河沙装入组培瓶中，沙子体积为组培瓶容积的1/2，然后采用高压蒸汽消毒，在压力为0.1013Mpa、温度为121℃的条件下进行消毒，消毒时间为25min，灭菌后使其自然冷却，备用；所述的组培瓶规格为240mL，直径68mm，口径62mm，高90mm；
(2)无菌水的制备：在组培瓶中装入70mL的自来水，然后采用高压蒸汽消毒，在压力为0.1013mPa、温度为121℃的条件下进行消毒，消毒时间为25-30min，得到无菌水；
(3)种子的无菌处理：灭菌前，先将月季种子倒入盛有清水的容器中，并分搅拌，捞出漂浮在水面的瘪种子和杂质，然后在自来水中浸泡24h，浸泡完成后即可进行灭菌处理：先将月季种子先用0.1％洗衣粉溶液中浸泡30min后，然后在流水下冲洗30min，再转入超净工作台上，用75％乙醇浸泡种子20s，无菌水冲洗3次；再用0.1％升汞溶液浸泡种子12min，此操作过程中轻轻震荡月季种子，使升汞溶液很好地接触种子，最后无菌水冲洗3次，得到无菌月季种子；
(4)种子的预处理：将无菌月季种子用浓度为200mg/L的无菌GA3溶液浸泡24h，备用；
(5)无菌低温层积：在超净工作台上，将经过无菌处理的月季种子埋入经高温灭菌的沙子中，并在沙子中加入无菌水使其保持湿润，种子播种完毕，将装有沙子的组培瓶置于冰箱的冷藏室进行冷藏40d；待冷藏结束后，将组培瓶移入培养室进行常温遮光培养10d，待遮光培养结束后统计出芽率；冷藏室的温度设定为4℃。
实施例3：
一种促进月季种子无菌萌发的方法，包括如下步骤：
(1)河沙的无菌处理：将湿润的河沙装入组培瓶中，沙子体积为组培瓶容积的1/2，然后采用高压蒸汽消毒，在压力为0.1013Mpa、温度为121℃的条件下进行消毒，消毒时间为28min，灭菌后使其自然冷却，备用；所述的组培瓶规格为240mL，直径68mm，口径62mm，高90mm；
(2)无菌水的制备：在组培瓶中装入75mL的自来水，然后采用高压蒸汽消毒，在压力为0.1013mPa、温度为121℃的条件下进行消毒，消毒时间为28min，得到无菌水；
(3)种子的无菌处理：灭菌前，先将月季种子倒入盛有清水的容器中，并分搅拌，捞出漂浮在水面的瘪种子和杂质，然后在自来水中浸泡24h，浸泡完成后即可进行灭菌处理：先将月季种子先用0.2％洗衣粉溶液中浸泡30min后，然后在流水下冲洗30min，再转入超净工作台上，用75％乙醇浸泡种子25s，无菌水冲洗3次；再用0.1％升汞溶液浸泡种子14min，此操作过程中轻轻震荡月季种子，使升汞溶液很好地接触种子，最后无菌水冲洗3次，得到无菌月季种子；
(4)种子的预处理：将无菌月季种子用浓度为220mg/L的无菌GA3溶液浸泡24h，备用；
(5)无菌低温层积：在超净工作台上，将经过无菌处理的月季种子埋入经高温灭菌的沙子中，并在沙子中加入无菌水使其保持湿润，种子播种完毕，将装有沙子的组培瓶置于冰箱的冷藏室进行冷藏50d；待冷藏结束后，将组培瓶移入培养室进行常温遮光培养13d，待遮光培养结束后统计出芽率；冷藏室的温度设定为5℃。
将上述实施例1-3得到的促进月季种子无菌萌发的方法得到月季种子出芽率进行调查统计，结果见表1。
表1本发明的促进月季种子无菌萌发的方法对月季种子出芽率的测定
注：对照为采用常规方法对月季种子进行处理。
由表1可知，本发明的实施例1-3中月季种子的出芽率分别为52％、48％和49％，远高于对照。可见，本发明的方法具有明显的技术优势，值得进一步推广和应用。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。