本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种离体沉香木结香方法。
背景技术：
目前沉香结香方法一般在活体的沉香属植物上进行，容易受户外种植环境的影响。本发明通过切取沉香属植物枝干的一部分（长约2-10cm,直径1~8cm），通过在新鲜的沉香属植物上接种沉香菌种（从沉香属植物中分离），或者浸泡在结香菌液中，30天后离体沉香木出现颜色变化，逐渐变黑，剔除变色部门的沉香木GC-MS检测含有挥发性成分。
现有沉香结香方法有在活体沉香属植物砍伤法、半断干法、化学法和人工接种结香法，结香效率不高，结香不稳定，操作复杂，生产成本高。
类似的技术有申请号为201310522116.7的中国发明专利公开了一种以植物组织培养方式制作沉香的方法，先提供一种沉香植株培植体，沉香植株培植体的组织与细胞再生为沉香植株，在沉香植株上完成微生物接种和结香实验。然而这种技术需要组织培养再生，过程中容易污染，需要重复操作，降低生产效率。
技术实现要素：
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种离体沉香木结香方法，该结香方法生产工艺简单，成本低，周期短，不受树龄的限制，不受气候和土壤的限制，充分的利用和保护了沉香资源。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种离体沉香木结香方法，包括如下步骤：
（1）沉香预处理：截取新鲜沉香木段，剥去表皮，消毒冲洗，打孔，备用；
（2）结香菌种的准备：将沉香菌种经固体培养得到固体菌种；或者，将沉香菌种经液体培养得到液体菌液，过滤，收集菌丝；
（3）接种：将固体菌种接种在沉香木的孔内，接种的沉香木放在已经灭菌过的培养瓶中，瓶底放入湿棉花，生长30d以上，得到沉香；或者，将菌丝塞入沉香木的孔内，并把沉香木浸泡在过滤后的液体菌液内，在已灭菌的培养瓶内生长30d以上，得到沉香。
沉香菌种主要是真菌，从沉香属植物上分离出来，经过纯化和鉴定，它们大多是硬孔菌属、拟层孔菌属、可可毛色二孢属、镰刀菌属、拟盘多毛孢属、头孢菌属、霉属、腐木菌属或小球壳菌属。
优选的，所述步骤（1）具体为：截取长度为2-10cm的新鲜沉香木段，剥去表皮，表面消毒后用无菌水冲洗，用电钻在沉香木段表面打孔2-3个，备用。
优选的，所述步骤（2）中，将沉香菌种经固体培养得到固体菌种的步骤具体为：
A、配制PDA培养基；
B、将PDA培养基在无菌室中倒平板，制得多个平板培养基；
C、取2-3种不同的沉香菌种分别接种在不同的平板培养基中培养，得到固体菌种。
优选的，所述步骤A中，每升PDA培养基包括如下组分：鲜沉香木100-300g、葡萄糖18-22g、琼脂15-20g和土豆180-220g。
优选的，所述步骤A中，PDA培养基的制备方法具体为：
A1、熬煮：取100-300g鲜沉香木切碎，加入1000mL水中预煮35-45min；将土豆180-220g去皮后切成小块放入水中，加热至沸腾，维持20-30min，至土豆可捣碎为止；趁热过滤，滤液加水补充至1000mL；
A2、溶解：把滤液放入锅中，加入18-22g葡萄糖和15-20g琼脂，小火加热，搅拌，待琼脂完全溶解后，再加水补充至所需量，制得PDA培养基；
A3、灭菌：将PDA培养基分装在250mL的三角烧瓶中，在119-123℃温度下灭菌20-30min。
优选的，所述步骤C中，培养温度为25-30℃，培养时间为3-10d。
优选的，所述步骤（2）中，将沉香菌种经液体培养得到液体菌液，过滤，收集菌丝的步骤具体为：
a、配制PD培养基，分装后进行灭菌；
b、取沉香菌种2-3种分别接种在分装后的不同的PD培养基中，先静置培养再振荡培养，得到液体菌液；
c、将培养后的液体菌液在无菌室内过滤，收集菌丝。
优选的，所述步骤a中，每升PD培养基包括如下组分：鲜沉香木100-300g、葡萄糖18-22g和土豆180-220g。
优选的，所述步骤a中，PD培养基的制备方法为：
a1、熬煮：取100-300g鲜沉香木切碎，加入1000mL水中预煮35-45min；将土豆180-220g去皮后切成小块放入水中，加热至沸腾，维持20-30min，至土豆可捣碎为止；趁热过滤，滤液加水补充至1000mL；
a2、溶解：把滤液放入锅中，加入18-22g葡萄糖，小火加热，搅拌均匀，加水补充至所需量，制得PD培养基；
a3、灭菌：将PD培养基分装在250mL的三角烧瓶中，每瓶装量为200mL，瓶口加棉塞后再包扎牛皮纸封口，在1.3-1.5kg/cm2压力下灭菌20-30min，取出冷却到30℃以下。
优选的，所述步骤b中，静置培养的温度为23-25℃，培养时间为42-54h；振荡培养采用复式摇床，其振荡频率为80-100次/min，振幅为6-10cm；或者采用旋转式摇床，其振荡频率为200-220转/min，振荡培养室温控制在25-30℃，振荡培养3-10d。
本发明的有益效果在于：本发明的离体沉香木结香方法生产工艺简单，成本低，周期短，不受树龄的限制，不受气候和土壤的限制，充分的利用和保护了沉香资源。
本发明扩充了沉香属植物结香方法，实现在室内也可以生产沉香，可人为控制生产沉香的环境，且更易收集材料。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
一种离体沉香木结香方法，包括如下步骤：
（1）沉香预处理：截取长度为2cm的新鲜沉香木段，剥去表皮，表面消毒后用无菌水冲洗，用电钻在沉香木段表面打孔2个，备用；
（2）结香菌种的准备：将沉香菌种经固体培养得到固体菌种；
A、配制PDA培养基；
所述步骤A中，每升PDA培养基包括如下组分：鲜沉香木100g、葡萄糖18g、琼脂15g和土豆180g。
所述步骤A中，PDA培养基的制备方法具体为：
A1、熬煮：取100g鲜沉香木切碎，加入1000mL水中预煮35min；将土豆180g去皮后切成小块放入水中，加热至沸腾，维持20min，至土豆可捣碎为止；趁热过滤，滤液加水补充至1000mL；
A2、溶解：把滤液放入锅中，加入18g葡萄糖和15g琼脂，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再加水补充至所需量，制得PDA培养基；
A3、灭菌：将PDA培养基分装在250mL的三角瓶中，在119℃温度下灭菌20min。
B、将PDA培养基在无菌室中倒平板，制得平板培养基；
C、取2种不同的沉香菌种分别接种在平板培养基中培养，培养温度为25℃，培养时间为3d，得到固体菌种。
（3）接种：将不同的固体菌种接种在沉香木的不同的孔内，接种的沉香木放在已经灭菌过的培养瓶中，瓶底放入含水量为50%的湿棉花，在25℃环境下生长30d，可发现沉香木颜色变深，出现黑褐色，即为沉香。
（4）可继续生长3个月，回收沉香。
实施例2
一种离体沉香木结香方法，包括如下步骤：
（1）沉香预处理：截取长度为6cm的新鲜沉香木段，剥去表皮，表面消毒后用无菌水冲洗，用电钻在沉香木段表面打孔3个，备用；
（2）结香菌种的准备：将沉香菌种经固体培养得到固体菌种；
A、配制PDA培养基；
所述步骤A中，每升PDA培养基包括如下组分：鲜沉香木200g、葡萄糖20g、琼脂18g和土豆200g。
所述步骤A中，PDA培养基的制备方法具体为：
A1、熬煮：取200g鲜沉香木切碎，加入1000mL水中预煮40min；将土豆200g去皮后切成小块放入水中，加热至沸腾，维持25min，至土豆可捣碎为止；趁热过滤，滤液加水补充至1000mL；
A2、溶解：把滤液放入锅中，加入20g葡萄糖和18g琼脂，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再加水补充至所需量，制得PDA培养基；
A3、灭菌：将PDA培养基分装在250mL的三角瓶中，在121℃温度下灭菌25min。
B、将PDA培养基在无菌室中倒平板，制得平板培养基；
C、取3种不同的沉香菌种分别接种在平板培养基中培养，培养温度为28℃，培养时间为6d，得到固体菌种。
（3）接种：将不同的固体菌种接种在沉香木的不同的孔内，接种的沉香木放在已经灭菌过的培养瓶中，瓶底放入含水量为55%的湿棉花，在30℃环境下生长40d，可发现沉香木颜色变深，出现黑褐色，即为沉香。
（4）可继续生长2.5个月，回收沉香。
实施例3
一种离体沉香木结香方法，包括如下步骤：
（1）沉香预处理：截取长度为10cm的新鲜沉香木段，剥去表皮，表面消毒后用无菌水冲洗，用电钻在沉香木段表面打孔2个，备用；
（2）结香菌种的准备：将沉香菌种经固体培养得到固体菌种；
A、配制PDA培养基；
所述步骤A中，每升PDA培养基包括如下组分：鲜沉香木300g、葡萄糖22g、琼脂20g和土豆220g。
所述步骤A中，PDA培养基的制备方法具体为：
A1、熬煮：取300g鲜沉香木切碎，加入1000mL水中预煮45min；将土豆220g去皮后切成小块放入水中，加热至沸腾，维持30min，至土豆可捣碎为止；趁热过滤，滤液加水补充至1000mL；
A2、溶解：把滤液放入锅中，加入22g葡萄糖和20g琼脂，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再加水补充至所需量，制得PDA培养基；
A3、灭菌：将PDA培养基分装在250mL的三角瓶中，在123℃温度下灭菌30min。
B、将PDA培养基在无菌室中倒平板，制得平板培养基；
C、取2种不同的沉香菌种分别接种在平板培养基中培养，培养温度为30℃，培养时间为10d，得到固体菌种。
（3）接种：将不同的固体菌种接种在沉香木的不同的孔内，接种的沉香木放在已经灭菌过的培养瓶中，瓶底放入含水量为60%的湿棉花，在35℃环境下生长50d以上，可发现沉香木颜色变深，出现黑褐色，即为沉香。
（4）可继续生长2个月，回收沉香。
实施例4
一种离体沉香木结香方法，包括如下步骤：
（1）沉香预处理：截取长度为2cm的新鲜沉香木段，剥去表皮，表面消毒后用无菌水冲洗，用电钻在沉香木段表面打孔3个，备用；
（2）结香菌种的准备：将沉香菌种经液体培养得到液体菌液，过滤，收集菌丝；
a、配制PD培养基，分装后进行灭菌；
所述步骤a中，每升PD培养基包括如下组分：鲜沉香木100g、葡萄糖18g和土豆180g。
所述步骤a中，PD培养基的制备方法为：
a1、熬煮：取100g鲜沉香木切碎，加入1000mL水中预煮35min；将土豆180g去皮后切成小块放入水中，加热至沸腾，维持20min，至土豆可捣碎为止；趁热过滤，滤液加水补充至1000mL；
a2、溶解：把滤液放入锅中，加入18g葡萄糖，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒不断搅拌均匀，加水补充至所需量，制得PD培养基；
a3、灭菌：将PD培养基分装在250mL的三角烧瓶中，每瓶装量为200mL，瓶口加棉塞后再包扎牛皮纸封口，在1.3kg/cm2压力下灭菌20min，取出冷却到30℃以下。
b、取沉香菌种3种分别接种在分装后的不同的PD培养基中，先静置培养再振荡培养，静置培养的温度为23℃，培养时间为42h；振荡培养采用复式摇床，其振荡频率为80次/min，振幅为6cm；或者采用旋转式摇床，其振荡频率为200转/min，振荡培养室温控制在25℃，振荡培养3d，得到液体菌液；
c、将培养后的液体菌液在无菌室内过滤，收集菌丝。
（3）接种：不同的液体培养中的菌丝塞入沉香木的不同的孔内，并把沉香木浸泡在过滤的前3种菌丝的液体菌液内，在已灭菌的培养瓶内生长30d，即可发现沉香木颜色变深，出现黑褐色，即为沉香。
（4）可继续生长3个月，回收沉香。
实施例5
一种离体沉香木结香方法，包括如下步骤：
（1）沉香预处理：截取长度为6cm的新鲜沉香木段，剥去表皮，表面消毒后用无菌水冲洗，用电钻在沉香木段表面打孔2个，备用；
（2）结香菌种的准备：将沉香菌种经液体培养得到液体菌液，过滤，收集菌丝；
a、配制PD培养基，分装后进行灭菌；
所述步骤a中，每升PD培养基包括如下组分：鲜沉香木200g、葡萄糖20g和土豆200g。
所述步骤a中，PD培养基的制备方法为：
a1、熬煮：取200g鲜沉香木切碎，加入1000mL水中预煮40min；将土豆200g去皮后切成小块放入水中，加热至沸腾，维持25min，至土豆可捣碎为止；趁热过滤，滤液加水补充至1000mL；
a2、溶解：把滤液放入锅中，加入20g葡萄糖，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒不断搅拌均匀，加水补充至所需量，制得PD培养基；
a3、灭菌：将PD培养基分装在250mL的三角烧瓶中，每瓶装量为200mL，瓶口加棉塞后再包扎牛皮纸封口，在1.4kg/cm2压力下灭菌25min，取出冷却到30℃以下。
b、取沉香菌种2种分别接种在分装后的不同的PD培养基中，先静置培养再振荡培养，静置培养的温度为24℃，培养时间为48h；振荡培养采用复式摇床，其振荡频率为90次/min，振幅为8cm；或者采用旋转式摇床，其振荡频率为210转/min，振荡培养室温控制在28℃，振荡培养6d，得到液体菌液；
c、将培养后的液体菌液在无菌室内过滤，收集菌丝。
（3）接种：不同的液体培养中的菌丝塞入沉香木的不同的孔内，并把沉香木浸泡在过滤的前2种菌丝的液体菌液内，在已灭菌的培养瓶内生长40d以上，即可发现沉香木颜色变深，出现黑褐色，即为沉香。
（4）可继续生长2.5个月，回收沉香。
实施例6
一种离体沉香木结香方法，包括如下步骤：
（1）沉香预处理：截取长度为10cm的新鲜沉香木段，剥去表皮，表面消毒后用无菌水冲洗，用电钻在沉香木段表面打孔3个，备用；
（2）结香菌种的准备：将沉香菌种经液体培养得到液体菌液，过滤，收集菌丝；
a、配制PD培养基，分装后进行灭菌；
所述步骤a中，每升PD培养基包括如下组分：鲜沉香木300g、葡萄糖22g和土豆220g。
所述步骤a中，PD培养基的制备方法为：
a1、熬煮：取300g鲜沉香木切碎，加入1000mL水中预煮45min；将土豆220g去皮后切成小块放入水中，加热至沸腾，维持30min，至土豆可捣碎为止；趁热过滤，滤液加水补充至1000mL；
a2、溶解：把滤液放入锅中，加入22g葡萄糖，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒不断搅拌均匀，加水补充至所需量，制得PD培养基；
a3、灭菌：将PD培养基分装在250mL的三角烧瓶中，每瓶装量为200mL，瓶口加棉塞后再包扎牛皮纸封口，在1.5kg/cm2压力下灭菌30min，取出冷却到30℃以下。
b、取沉香菌种3种分别接种在分装后的不同的PD培养基中，先静置培养再振荡培养，静置培养的温度为25℃，培养时间为54h；振荡培养采用复式摇床，其振荡频率为100次/min，振幅为10cm；或者采用旋转式摇床，其振荡频率为220转/min，振荡培养室温控制在30℃，振荡培养10d，得到液体菌液；
c、将培养后的液体菌液在无菌室内过滤，收集菌丝。
（3）接种：不同的液体培养中的菌丝塞入沉香木的不同的孔内，并把沉香木浸泡在过滤的前3种菌丝的液体菌液内，在已灭菌的培养瓶内生长50d，即可发现沉香木颜色变深，出现黑褐色，即为沉香。
（4）可继续生长2个月，回收沉香。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。