本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种非人灵长类动物的精子冷冻保存及复苏方法。
背景技术：
非人灵长类动物特别是食蟹猴及恒河猴在遗传学、解剖学和生理学上与人类具有高度相似性，使其广泛应用于在生命科学和医学研究领域。生殖生理方面，因为这两种动物具有与人相似的月经周期，常利用这一特点来揭示人类的生殖规律和寻求控制生育的途径和方法。随着转基因和基因敲除模型动物模型的大量建立和广泛使用，其保存和繁育体系的建立愈显重要，其中精子冷冻就是体外受精（invitrofertilization,ivf）或卵胞浆内单精子显微注射（intracytoplasmicsperminjection,icsi）工作中不可缺少的重要组成部分。但是随着灵长类动物资源的越来越缺乏，导致该物种的数量急剧下降，现生的非人灵长类均被列为频危的珍稀物种。因此加强非人灵长类动物的种质资源保护，如：精子、卵母细胞及胚胎等对于保护这种珍贵的遗传资源及维护物种的多样性是至关重要的。
非人灵长类动物除了因为精子本身比较脆弱外，精子在冷冻过程中对温度和冷冻条件十分敏感也是一个重要并且难控制的因素，另外受生殖季节的局限性影响，恒河猴及食蟹猴在一定的季节才具备充足的并且有受精能力的精子，因此研究和发展非人灵长类动物精子的冷冻保存技术对于研究胚胎早期的发育和提高物种的繁殖率有重要的意义，该技术不仅会明显降低活体动物个体保存的昂贵费用，还可缩小繁殖周期使高效生产实验动物成为可能，另外对非人灵长类动物的种质资源保存有重大价值，也可为非人灵长类其它动物精子冷冻保存提供借鉴。
随着冷冻技术的发展，人类和许多物种己经成功实现精子的冷冻保存，然而由于物种间的差异性，导致不同物种的精子冷冻保存方法并不相同。其中，大多数人们采用在液氮-196℃的低温中长期保存精子，但冷冻的程序却并不一样。常见的冷冻保存方法有程序降温法、液氮蒸气冷冻法、干燥冷冻法。程序冷冻法通过分步降温，使精子细胞逐步适应低温环境，可减少冷休克的发生，其优点是相对稳定，减少了人为因素的影响，缺点是需要程序冷冻仪，耗时长，消耗液氮多。液氮蒸汽法简单快捷，而且不需要昂贵的仪器，缺点是可能受人为及环境因素的影响较多，温度的控制不能统一，操作时要极其小心，且可获得理想的精子存活率。干燥冷冻法是将冷冻后的精子直接转入真空冷冻干燥机中，经过干燥处理精子中固态的玻璃化冰变为气态，降低了精子内形成的冰晶对精子的损伤。此法样品能够在4℃下或常温下长期保存，不需液氮和低温装置，便于运输，在动物尤其是牛精子中取得了很大进展。但是该方法冷冻保存的精子冷冻复苏率很低，大部分精子死亡并没有受精能力，因此只适用于对精子活力要求较低的实验。
目前关于非人灵长类精子冷冻保存报道也不少，但大多数采用在液氮中上方平衡不同时间（包括10分钟、15分钟）配合含卵黄的冷冻液及5%的甘油或乙二醇作为冷冻保护剂进行冷冻保存。也有研究者用spermcryo无卵黄冷冻液冷冻保存食蟹猴精子，分别获得32.3%和41.9%的精子冷冻保存复苏率，但复苏率仍不佳。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供一种非人灵长类动物的精子冷冻保存及复苏方法，通过改进液氮蒸气冷冻法，提高复苏后存活率及受精率。
本发明通过下列技术方案实现：一种非人灵长类动物的精子冷冻保存方法，经过下列操作：
精液在常温下液化30分钟，用htf培养液将猴精液稀释10倍，根据精液的体积，添加甘油，使甘油的体积终浓度达10%，分装于1.5ml冻存管中，4℃下放置30分钟，再转移到液氮上方（刚好在液面上方，不接触到液面为标准）悬挂30分钟，最后置于液氮中保存即可。
上述非人灵长类动物的精子复苏方法，将所述置于液氮中保存的冻存管在水浴37℃下轻轻摇动1～3分钟至完全融化，使其复苏。
本发明采用改进的液氮蒸气冷冻法对非人灵长类动物精子进行冷冻保存和复苏：以10%甘油为冷冻保护剂、htf（humantubalfluid）为稀释液，先在4℃冰箱放置30分钟，再转移到液氮罐上方（刚好在液面上方，不接触到液面为标准）悬挂30分钟，最后放入液氮中，复苏时直接把冻存管投入37℃溶解即可。研究结果表明，食蟹猴和恒河猴平均精子活力为58.74%±3.91%，精子冷冻复苏率为66.03%±5.42%，与先前的研究的冷冻复苏效果相比，复苏后存活率及受精率都有提高。是一种有效、快速且简便的冷冻及复苏方法，可推广至非人灵长类其它动物的精子冷冻保存及种质资源的保护。
非人灵长类动物精子冷冻保存的作用是保证优良精子的来源、避免生殖季节的局限性，降低体外受精的成本，提高人工繁殖灵长类后代的效率及增加精子功能和受精能力研究的稳定性和便捷性。因此，发展和研究灵长类精子的冷冻保存技术有重要的意义，该技术不仅会明显降低活体动物个体保存的昂贵费用，还可缩小繁殖周期使高效生产实验动物成为可能，对于物种的迂地保护与遗传种质资源的保存有着及其重大的意义。
本发明具备的效果及优点：
1、在4℃冰箱放置30分钟，再转移至液氮上方30分钟，虽然时间超过已有的研究报道，但是缓慢的降温过程有利于减少对精子的损害，最终的精子复苏率和精子活力就能证明这个时间的优势；
2、相比程序冷冻仪而言，可节省昂贵的设备费用；
3、冷冻液用htf在非人灵长类属于首次，虽然htf已经在人类和小鼠精子冷冻保存方面应用，但在非人灵长类动物没有做过尝试，htf相比卵黄来说成分明确，而卵黄的成分较为复杂，通常来源于家禽的蛋，可能携带一些潜在的传染性病原体（病毒、细菌、支原体），极大的增加对精子污染的风险，甚至影响精子的受精能力，而且不同来源的卵黄质量参差不齐，其对精子的冷冻保护效果也就存在差异，很难标准化。
总之，非人灵长类动物精液冷冻复苏后精子活力和精子冷冻复苏率均高于同类型研究报道，可以充分发挥优良雄性非人灵长类的繁殖效率，也可以保存优良的遗传基因，同时为其他珍惜濒危灵长类动物精子冷冻保存研究提供经验借鉴；可以有效降价冷冻成本，冷冻程序简单便捷，是一种有效、快速且简便的冷冻保存及复苏方法，可在普通的实验室开展，应用性广。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
实施例1
实验动物：6只健康、生育能力强的雄性食蟹猴和恒河猴（各3只，年龄7～10岁）来自于中国医学科学院医学生物学研究所药物安全性评价研究中心。每只猴单笼词养，每天喂食3餐，每天给予一定量的干净新鲜水果作为辅食。保持每日12h/12h光照与黑暗，17～22℃室温。中国医学科学院医学生物学研究所药物安全性评价研究中心已通过昆明市科技局的实验动物使用许可。本实验方案实施前已经中国医学科学院医学生物学研究所伦理审查委员会审查批准。动物的使用符合3r(reduction,replacement,refinement)原则。研究中所有实验动物相关的操作严格按照国际实验动物伦理行为准则“guideforthecareanduseoflaboratory”实施。
主要仪器设备：nikon显微镜（日本）；sw-cj-2f净化工作台（苏州净化），上海一恒电热恒温水浴槽（cu420）；手术器械购自上海医疗器械集团公司手术器械厂；不锈钢恒温手术床购自美国shor-line公司；巴斯德吸管购自美国falcon公司；移液管购自德国eppendorf公司；冻存管购自丹麦nunc公司；动物电刺激采精仪购自成都华智开物科技有限公司。显微操作系统购自德国eppendorf公司；培养皿、巴斯德吸管购自美国falcon公司；移液管购自德国eppendorf公司；三气培养箱购自美国forma公司。
试剂：人输卵管液（humantubalfluid，htf）购自sage公司；甘油购自天津市大茂化学试剂厂；卵母细胞体外操作液（htf-hepes）、胚胎培养液购自美国irvine公司。
根据上述材料，恒河猴和食蟹猴精子冷冻及复苏步骤如下：
（1）以常规方法采精，将精液在常温下液化30分钟，用htf培养液将猴精液稀释10倍，根据精液的体积，添加甘油，使甘油的体积终浓度达10%，分装于1.5ml冻存管中，4℃下放置30分钟，再转移到液氮上方（刚好在液面上方，不接触到液面为标准）悬挂30分钟，最后置于液氮中保存即可。
（2）待需要复苏时，打开恒温水浴锅，把温度升至37℃，将所述置于液氮中保存的冻存管在水浴37℃下轻轻摇动1～3分钟至完全融化，使其复苏。
icsi及胚胎培养：冷冻1～2周后解冻复苏，分别将成熟卵子和精子置于20μl的注射微滴中，活动精子在7%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone,pvp）制动后，持卵针固定成熟卵母细胞，并将第一极体置于12点位置，注射针在3点位置传入卵母细胞，分别穿过透明带和卵膜，负压吸引轻轻破膜后缓缓将精子注入到卵母细胞中，再轻轻退针。卵母细胞经洗涤后培养于37℃、5%co2、5%o2中，icsi后的卵子培养至第二天（14～16小时后），则为受精卵，受精卵继续培养16小时左右，出现第一次有丝分裂成2细胞期，培养至第三天胚胎发育成4～8细胞期。
精子活力的检测：
表1冷冻复苏后的精子活力和精子寿命及icsi后的受精率
注：#表示p＞0.01，两者之间比较没有显著差异。
从表1可以看出，食蟹猴和恒河猴精子冷冻复苏后精子活力分别达57.60%±8.86%和62.58%±11.77%；受精率分别达62.69%±9.58%和69.75%±8.72%，均不低于同类研究报道，而恒河猴冷冻复苏后精子活力和受精率都高于食蟹猴，是因为食蟹猴的精子相比恒河猴更脆弱，受冷冻液和外界环境因素影响更大，但两个物种间比较没有显著差异。
结果：恒河猴和食蟹猴的精子冷冻液及冷冻复苏方法有较好的应用效果，值得推广。
下面通过对比试验进一步验证本发明的显著效果：
对比例1：冷冻方法为：以常规方法采精，将精液在常温下液化30分钟，用htf培养液将猴精液稀释10倍，根据精液的体积，添加甘油，使甘油的体积终浓度达10%，分装于1.5ml冻存管中，4℃下放置15分钟，再转移到液氮上方（刚好在液面上方，不接触到液面为标准）悬挂15分钟，最后置于液氮中保存即可。
对比例2：冷冻方法为：以常规方法采精，将精液在常温下液化30分钟，用htf培养液将猴精液稀释10倍，根据精液的体积，添加甘油，使甘油的体积终浓度达10%，分装于1.5ml冻存管中，4℃下放置40分钟，再转移到液氮上方（刚好在液面上方，不接触到液面为标准）悬挂40分钟，最后置于液氮中保存即可。
对比例3：同实施例1，仅替换：添加甘油，使甘油的体积终浓度达10%。
对比例4：同实施例1，仅替换：添加甘油，使甘油的体积终浓度达15%。
对比例5：同实施例1，仅替换：添加乙二醇，使乙二醇的体积终浓度达10%。
将上述对比例和实施例用于试验动物食蟹猴，分别按对比例1～5的冷冻方法进行冷冻1～2周后，再按实施例1的复苏方法复苏。
精子活力的检测：
分别取15ul新鲜精子或冷冻复苏精子样本置于37℃预热的makler精子计数板上，在显微镜下记录直线运动精子占精子总数的百分率,即为精子活力。每次至少计数200个精子，每份样品计数两次，最后精子活力为两次次计数所得的平均值。然后计算精子冷冻复苏率，即精子冷冻复苏率=冷冻后精子活力/鲜精子活力×l00%。同时计时精子寿命，即从精子加入到培养皿中时开始计时精子在体外存活时间。见下表：
表2几种精子冷冻方案解冻复苏后精子活力检测比较
*p﹤0.01，差异显著
从表2可以看出对比例1、2、3、4、5的冷冻复苏精子活力分别为42.15%±7.53%、35.16%±6.47%、36.58%±6.61%、34.14%±8.20%和37.32%±9.46%；精子冷冻复苏率分别为47.22%±6.18%、38.43%±5.54%、41.85%±7.76%、37.64%±8.13%和40.72%±9.22%；受精率分别为：51.25%±8.47%、44.05%±6.33%、43.23%±5.21%、39.72%±4.16%和46.38%±7.56%；实施例1冷冻复苏精子活力为58.74%±8.91%，精子冷冻复苏率为66.03%±10.42%；受精率为67.58%±6.45%。对比例1、2、3、4、5和实施例1冻存方法在冷冻复苏精子活力、精子冷冻复苏率及受精率方面均有显著差异（p﹤0.01）。
并且实施例1的冷冻复苏后精子活力和精子冷冻复苏率均不低于同类型的研究报道，支大龙等用spermcryo冷冻液冷冻保存食蟹猴精子获得41.9%的精子冷冻保存复苏率，parasfl报道称采用spermcryo冷冻液获得人类精子冷冻保存精子复苏率是32.3%，卢晟盛等在改良tte中加入3～5%的甘油冷冻保存食蟹猴复苏后活率和复苏率达到45%和62%。