一种基于地沟油的拌种剂及其制备方法与流程

本发明属于农业技术领域，具体是一种基于地沟油的拌种剂及其制备方法，主要应用于提高种子的出芽速率及土壤对种子的保温性。

背景技术

拌种剂是用于植物种子拌种包衣、秧苗和林木移栽或扦插时蘸根等的一种液体，主要用于玉米、麦子、豆类、瓜果、蔬菜等绿化植物的杀虫和杀菌。拌种剂是一类能与种子混拌并附着或浸透种子内、能够防治病虫危害的农药的总成，剂型包括悬浮剂、粉剂、可湿性粉剂、悬浮种衣剂等，要求有效成分对作物发芽生长无毒害作用，形成的药膜具有透水性、透气性，不影响种子生命和呼吸作用。目前使用的拌种剂成分多为化学药物，其毒性较大且残留期较长，影响着土壤安全及粮食安全。

地沟油为动植物的油脂在氧化后形成的长链甘油三酯。地沟油处理较为困难，目前使用脂肪酶生产生物柴油也存在着成本较高、酶易失活、废弃物难处理等问题。地沟油中油脂主要为甘油三酯，其有着较好的保温性且其与多种植物种子中的油脂较为相似，因此其有作为植物种子的拌种剂的应用前景。但地沟油作为拌种剂也有存在的问题，因地沟油成分与植物种子成分存在差别，因此植物生根前后对植物生长的促进作用有限。如何将两者进行有机的连接成为处理地沟油同时促进植物生长的关键因素。

土壤中的微生物直接决定了土壤的肥力及种植潜力，其中芽孢杆菌是一种极其重要的农业微生物，起到了增产、抗病等关键作用。除此之外，很多其他菌种例如酵母、假单胞菌等也对土壤肥力起到了一定作用。使用某些可代谢地沟油的菌种，既可以将地沟油转化消耗为微生物提供生长的碳源和能源，又能使小分子脂肪酸对植物生长起到促进作用。因此，该种方案成为处理地沟油、促进植物生长的良好选择。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种基于地沟油的拌种剂，该拌种剂将地沟油与生物菌剂进行结合，可用于促进种子萌发和植物初期生长，在解决地沟油问题的同时实现其高值化利用。

本发明的另一目的在于提供上述基于地沟油的拌种剂的制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供一种基于地沟油的拌种剂，该拌种剂由复合配方和稀释剂组成，其中复合配方由0.5-2.5重量份地沟油、0.1-0.5重量份铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、0.1-0.5重量份枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)及0.02-0.1重量份安琪酵母(saccharomycescerevisiae)组成，稀释剂为10重量份的无菌水。

优选地，其中复合配方由1重量份地沟油、0.2重量份铜绿假单胞菌、0.1重量份枯草芽孢杆菌及0.1重量份安琪酵母组成，稀释剂为10重量份的无菌水。

其中，所述地沟油为餐厨垃圾中回收获得的油脂，主要组成为动植物油脂，主要成分为长链脂肪酸甘油三酯。

所述铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌由北京化工大学田平芳教授馈赠，安琪酵母为市售馒头发酵所用的酵母干粉。

本发明还提供一种如上述基于地沟油的拌种剂的制备方法，包括如下步骤：

1)细菌培养：将铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌按1％体积比分别接种到lb培养基中，37℃转速300rpm培养48h，安琪酵母按1％体积比接种到ypd培养基中，30℃转速200rpm培养48h；

2)冻干：分别收集铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和安琪酵母，12000rpm离心，然后用pbs缓冲液清洗细胞2次，在冷冻干燥机中-80℃冻干成菌粉；

3)在无菌水中加入地沟油、铜绿假单胞菌冻干粉、枯草芽孢杆菌冻干粉和安琪酵母冻干粉混合制成拌种剂。

使用时按10颗种子喷洒5ml拌种剂的量进行配比。拌种剂加入到预先种好白菜或玉米种子的土壤中，2周内可有效提高7％以上的出芽高度。

目前尚未有研究报道使用地沟油和生物菌剂的直接结合，制作生物拌种剂促进植物生长。本发明通过大量实验，使用三种菌剂和地沟油进行混合，制备了用于植物生长的拌种剂。该发明简单、方便、成本低、环境友好、安全。本发明对现代农业和社会经济的可持续发展、农业生态环境安全和农产品质量安全起到积极作用，可以大面积推广应用。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种基于地沟油的拌种剂，该拌种剂通过地沟油与多种菌的复配，一方面通过菌降解实现地沟油的分解和再利用，解决地沟油的处理难度高的问题，另一方面使用的菌也为农作物提供了增产抗病增加土壤肥力的效果。

附图说明

图1a和图1b为铜绿假单胞菌含量与植物生长的影响，其中图1a中植物为白菜，图1b中植物为玉米。

图2a和图2b为枯草芽孢杆菌含量与植物生长的影响，其中图2a中植物为白菜，图2b中植物为玉米。

图3a和图3b为安琪酵母含量与植物生长的影响，其中图3a中植物为白菜，图3b中植物为玉米。

图4a和图4b为地沟油含量与植物生长的影响，其中图4a中植物为白菜，图4b中植物为玉米。

图5为本专利中枯草芽孢杆菌对真菌的防治效果。

图6为本专利中铜绿假单胞菌和安琪酵母对地沟油的降解。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的实质，下面结合实例对本发明的技术内容作详细的说明，但本发明的内容并不局限如此，不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。

本发明所用地沟油为餐厨垃圾中回收获得的油脂，主要组成为动植物油脂，主要成分为长链脂肪酸甘油三酯。

所述铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌由北京化工大学田平芳教授馈赠，安琪酵母为市售馒头发酵所用的酵母干粉。

本发明采用以下技术方案：

培养基配制：

lb培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g：酵母提取物(yeastextract)5g：氯化钠(nacl)10g加双蒸水至1000ml,用5mol/lnaoh(约0.2ml)调ph至7.2，121℃灭菌30min。

ypd培养基：将溶解10g酵母膏(yeastextract)，20g蛋白胨(peptone)于900ml水中，高压121℃灭菌20min，加入100ml20gdextrose葡萄糖(glucose)，(葡糖糖溶液灭菌后加入)。

pbs配制：

pbs1l配方ph7.4：磷酸二氢钾(kh2po4)0.27g，磷酸氢二钠(na2hpo4)1.42g，氯化钠(nacl)8g，氯化钾(kcl)0.2g，加去离子水约800ml充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调ph至7.4，最后定容到1l。

菌的冻干粉的制备：

将铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌按1％体积比分别接种到lb培养基中，

37℃转速300rpm培养48h，安琪酵母按1％体积比接种到ypd培养基中，30℃转速200rpm培养48h。

分别收集铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和安琪酵母，12000rpm离心，然后用pbs缓冲液清洗细胞2次，在冷冻干燥机中-80℃冻干成菌粉。

实施例1

将白菜和玉米种子用水进行浸泡，常温下浸泡24h后，在含有营养土的土壤中进行种植。每10cm直径的花盆中种植10粒种子浇水湿润，每天从花盆下方托盘中浇水，保证托盘中水分充足。花盆置于实验室靠窗窗台上，实验室温度恒定为25℃。

实施例2

取地沟油0.5g、枯草芽孢杆菌0.1g、安琪酵母0.1g，加入至10ml无菌水中。另取铜绿假单胞菌0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g五组样品，混匀后滴灌加入种有白菜和玉米种子的土壤中。在25℃40％恒温恒湿培养箱中，500lx光强度下培养。经过2周培养后测定植株高度，记录数据如图1所示。

由图1a和图1b可以看出，随着铜绿假单胞菌数量的增加，植物生长速度加快。铜绿假单胞菌用于降解地沟油脂，将植物无法利用的地沟油脂降解为植物可以利用的小分子脂肪酸。其中铜绿假单胞菌的用量中0.2-0.5g对植物植株高度的影响变化较小，同时考虑铜绿假单胞菌的加入成本，因此选择0.2g铜绿假单胞菌为最优加入量。

实施例3

取地沟油0.5g、铜绿假单胞菌0.1g、安琪酵母0.1g，加入至10ml无菌水中。另取枯草芽孢杆菌0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g五组样品，混匀后滴灌加入种有白菜和玉米种子的土壤中。在25℃40％恒温恒湿培养箱中，500lx光强度下培养。经过2周培养后测定植株高度，记录数据如图2a和图2b所示。

由图2a和图2b可以看出，枯草芽孢杆菌的加入量对植物高度的影响较小，菌粉加入量增加后植物高度变化在0.1cm以内。但因枯草芽孢杆菌为生物防控菌种，为了防止霉菌发酵而必须加入，因此选定枯草芽孢杆菌最优加入量为0.1g。

实施例4

取地沟油0.5g、铜绿假单胞菌0.1g、枯草芽孢杆菌0.1g，加入至10ml无菌水中。另取安琪酵母0.02g、0.04、0.06、0.08、0.1g五组样品，混匀后滴灌加入种有白菜和玉米种子的土壤中。在25℃40％恒温恒湿培养箱中，500lx光强度下培养。经过2周培养后测定植株高度，记录数据如图3a和图3b所示。

由图3a和图3b可以看出，安琪酵母的加入量对植物高度的影响较大，菌粉加入量增加后植物高度变化在0.5cm以上。但因安琪酵母价格较高，为了控制总成本，因此选定安琪酵母最优加入量为0.1g。

实施例5

取铜绿假单胞菌0.2g、枯草芽孢杆菌0.1g，安琪酵母0.1g，加入至10ml无菌水中。另取地沟油0.5g、1g、1.5g、2g、2.5g五组样品，混匀后滴灌加入种有白菜和玉米种子的土壤中。在25℃40％恒温恒湿培养箱中，500lx光强度下培养。经过2周培养后测定植株高度，记录数据如图4a和图4b所示。

由图4a和图4b可以看出，地沟油的加入量对植物高度的影响在前两个点较大，后期随着地沟油浓度的增大，菌粉降解地沟油的能力达到上限。因此在该种情况下，最大地沟油加入量为1g。

实施例6

选择实施例2-4中筛选出的铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌，安琪酵母的最优加入量组成配方，加入至10ml无菌水中，对配方中枯草芽孢杆菌抗真菌的效果进行鉴定，鉴定结果如图5中所示。从图5中可以看出枯草芽孢杆菌的接入，对真菌类病害(如桃褐腐病、番茄晚疫病、番茄早疫病、番茄灰霉病、黄瓜灰霉病)具有一定的防治作用。对配方中铜绿假单胞菌和安琪酵母的混合鉴定其在液体中降解地沟油的能力，如图6中所示。从图6可以看出，地沟油的含量随时间逐步下降，说明在配方菌剂作用下地沟油被铜绿假单胞菌和安琪酵母分解为生长所需要的碳源，而这些碳源可被植物种子生长所利用。

由上述实施例可以看出，本专利中所含有的枯草芽孢杆菌对多种真菌病害病原菌有着理想的防效。本专利中的铜绿假单胞菌和安琪酵母对地沟油有着明显的降解和利用作用。因此，由铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌，安琪酵母和地沟油复配成的拌种剂不仅可以有效防治植物真菌病害，还可以通过分解地沟油为植物种子提供生长所需要的营养，促进种子萌发和初期生长，同时也为地沟油的分解和再利用提供了一种有效途径，解决了地沟油处理难度高的问题。