本发明属于饲养业的工艺技术领域，具体涉及到一种低温保存猪精液的抗氧化稀释液制备方法。
背景技术：
精液保存是猪人工授精技术的关键，它既可以延长精子的贮存时间，又便于长途运输，同时扩大了精液的使用范围，提高公猪的配种效能，加快猪群品种改良。猪精液低温保存技术在运输和操作上，相对冷冻保存而言简便、经济，而保存时间比常温保存长、成本低。目前低温保存研究还停留在稀释液的筛选阶段。
冷冻保护是影响猪冻精质量的重要因素，自从人们发现甘油的冷冻保护特性后，迅速促进了家畜冷冻精液的发展，但是，甘油作为一种渗透性冷冻保护剂，能都渗入精子细胞的内部，浓缩或结合细胞内水分，降低溶液中盐的浓度和稀释液的渗透压，一方面对精子有保护作用，另一方面又对精子有一定的毒害作用，部分精子经脱水后冷冻效果较好，但结冻后却无运动力和受精能力。与牛精子不同的是，猪精子对低温打击极端敏感，而低温打击的主要危害是降低精子活力，增强精子膜的离子通透性，导致精子膜受到损伤和精细胞脂类物质的流失，而镜子膜的完整性对于精子的受精能力至关重要，近年来人们致力于研究非渗透性冷冻保护剂，并结合先稀释液中添加其他成分以改善冻后精子质量。
弱酸环境被认为是精液保存的理想环境，但超出一定的酸性范围，容易引起精子死亡。猪精子的等渗渗透压为290～300mosm，可耐受的渗透压为240～380mosm，等渗或稍微高渗的环境比低渗的环境更利于保护精子。可能与稀释液中添加缓冲剂碳酸氢钠和柠檬酸三钠有关，它们可以维持精液ph的动态平衡，虽然成分只有葡萄糖和蔗糖，但二者即作为营养成分满足了精子的能量需要，又维持了渗透压，其中蔗糖在低温条件下还能保护精子的活力和顶体完整率。对于猪精子而言，弱酸和略高的渗透压更利于其4℃低温保存，人工采取的精液易受微生物的污染，而青霉素和链霉素作为稀释液中的抗菌剂，被广泛应用于常温保存稀释液中抑制微生物的生长繁殖，但二者对革兰氏阴性菌如大肠杆菌效果较差。有试验证明庆大霉素对多种革兰氏阴性菌有杀灭作用。
技术实现要素：
一种低温保存猪精液的抗氧化稀释液制备方法，
猪精子与牛精子低温保存的效果不同，在猪精子的低温储存过程中，由于冷冻和解冻的过程发生脂质过氧化反应降低了精子的质量，并导致40~50%的精子失去活力，最主要原因是由于这一过程中精子与外界相互接触，致使精子中的活性氧增加，引起精子膜的流动性改变，线粒体和dna损伤，降低了精液的品质。但是低温保存精液，低温可以减缓精子的运动，从而降低自身能量的损耗和新陈代谢，有效延长了精子的保存时间。
发明为了实现低温储存猪精液，同时解决以上出现的冷冻—解冻过程中过多活性氧出现导致的精子损伤率提高的问题，发明一种低温保存猪精液的稀释液，具体是通过以下的方法实现的：
（1）利用酵母的破碎提取液作为基础稀释液，后期添加其他活性成分，酵母提取液在提取的过程中从细胞溶出的物质包括：蛋白质、低分子肽、氨基酸、核酸降解物、微量元素和b族维生素等各种活性成分，都提供给精子相当完美的模拟生物细胞生存环境，各项活性成分的配比恰到好处，且成分全面，相对于人工配比的精液稀释液，添加的活性物质太多，量的方面不好拿捏，稍有不平衡就有导致稀释液渗透压的不稳定，导致精子因渗透压及其它方面的问题而死亡。
不仅如此，酵母细胞还富含丰富的海藻糖，海藻糖不同于蔗糖或是乳糖，它可以在生物活性细胞脱水的情况下，在细胞膜外形成一层保护膜，这一点可以在冷冻的过程中发挥保护细胞的作用，防止猪精子在降温过程中受到的低温打击。
首先采用的是啤酒酵母泥作为酵母菌的来源，废酵母泥是啤酒生产过程中的副产物，每年都会造成大量的浪费，这里经过3~5次的水洗，然后离心得到含有酵母菌细胞的酵母菌液，其啤酒酵母的有效活菌数不少于1.0×106cfu/ml。
通过微波辐射的作用破碎酵母细胞，微波功率为600~800w的电磁作用环境下2~5min，微波是通过波场中介质的摆动摩擦作用产生能量，具有很好的选择性、瞬时性和高效性，细胞内不同位置的物质，对于微波的吸收能力存在差异，从而导致为波场中的细胞局部受热，细胞在一定的强度下出现缺口而破碎，起到充分裂解酵母细胞的功能。
不仅如此，发明既然选择微波的破碎细胞方式，同时加入一定量的葡萄籽粉，利用微波的辐射作用和添加的一定量乙醇溶剂，可以在一定程度上提取葡萄籽中含有的原花青素，原花青素是一种新型高效抗氧化剂，属于一类有着特殊分子结构的生物类黄酮，溶于水和大多数的有机溶剂，已有文献证明在猪精液的冷冻保护方面，其抗氧化性能使维生素e的50倍，维生素c的20倍，是一种高效清除自由基的细胞内活性物质，同时参与磷酸、花生四烯酸的代谢和蛋白质磷酸化，保护脂质不发生过氧化损伤。
将葡萄籽研磨过80~120目筛的微粉，待前述酵母细胞破碎稀释液冷却后添加至混合其中，然后加入有机溶剂乙醇，控制乙醇浓度50~70%，将微波辐射的功率调整为250~400w，作用30~50min，属于提取过程，在微波辐射的环境下，有机溶剂可以同时实现对酵母细胞中活性成分的提取，其中包括海藻糖，同时可以提取葡萄籽粉中的原花青素。
这里很好的控制了微波的辐射功率，即利用高功率的辐射先杀死并破碎酵母细胞，同时高辐射带来高温，不利于后期长时间的萃取过程，在萃取的过程中合理的控制微波功率使稀释液的温度始终在60~80℃，比较符合提取的温度，同时葡萄籽粉与酵母破碎稀释液的料液比控制在1:15~20的时候，原花青素的的提取量达到最高。
完成后的稀释液含有提取后的酵母细胞和葡萄籽粉残余物，这类不规则大颗粒物质，会对精子细胞膜造成机械性损伤；同时，大颗粒物质使得精液稀释后变得浑浊，加上精子会游向大颗粒物质并附着在其边缘，严重影响后期受精，所以发明选择加入一定量的生物絮凝剂羧甲基纤维素钠，浓度为15~20g/l，于恒温水浴中保温20min后再进行离心处理，取上清液，通过减压蒸馏回收乙醇，真空度0.08mpa的条件下，升温至60~70℃沸腾回流回收乙醇并浓缩提取液。
适量的加入羧甲基纤维素钠还有一个好处，在于可以增加溶液一定的粘稠度，提高稀释液的发散程度，使精子均匀的悬浮在稀释液中，可以提高稀释液对精子的保护作用，有利于精子活率、活力的维持，同时明显提高精子脂膜完成率和顶体完整率，原理是粘稠的稀释液可以降低精子的运动能力，减少不必要的能量消耗。
最后添加辅料，搅均匀即可，辅料占上述提取稀释液的10~20%，由以下重量百分比的原料制成：青霉素5~10%、乙二胺四乙酸钠10~15%、卵黄4~12%、葡萄糖30~60%、柠檬酸10~25%、谷氨酸5~15%、半胱氨酸6~18%。
本发明的有益效果：通过从废弃的啤酒酵母泥中提取酵母，破碎酵母，利用酵母提取液作为底液，添加其他活性成分，制成的一种猪精液低温储存的稀释液，同时控释微波的功率和添加乙醇的浓度，不仅提取到了一定的酵母海藻糖，还成功的从加入的葡萄籽粉中提取到了一定量的原花青素，证明都是很好的冷冻精液稀释液中非常好的抗氧化物质，有效冷冻稀释液的猪精液保存效果。
具体实施方式
实施例1：
（1）首先采用的是啤酒酵母泥作为酵母菌的来源，经过3~5次的水洗，然后离心得到含有酵母菌细胞的酵母菌液，其啤酒酵母的有效活菌数不少于1.0×106cfu/ml。
（2）通过微波辐射的作用破碎酵母细胞，微波功率为700w的电磁作用环境下4min，将葡萄籽研磨过100目筛的微粉，待前述酵母细胞破碎稀释液冷却后添加至混合其中，然后加入有机溶剂乙醇，控制乙醇浓度55%，将微波辐射的功率调整为300w，作用45min，属于提取过程。
（3）将（2）所述的提取液加入一定量的生物絮凝剂羧甲基纤维素钠，控制稀释液浓度为15~20g/l，于恒温水浴中保温20min后再进行离心处理，取上清液，通过减压蒸馏回收乙醇，真空度0.08mpa的条件下，升温至60~70℃沸腾回流回收乙醇并浓缩提取液。
（4）最后添加辅料，搅均匀即可，辅料占上述提取稀释液的10~20%，由以下重量百分比的原料制成：青霉素10%、乙二胺四乙酸钠10%、卵黄8%、葡萄糖40%、柠檬酸15%、谷氨酸5%、半胱氨酸12%。