一种平欧杂种榛组织培养的方法与流程

本发明涉及组织培养技术领域，特别涉及一种平欧杂种榛组织培养的方法。

背景技术：

在生产中，榛子苗木主要以压条法繁殖，压条技术现已基本成熟。但是榛树每年根部新萌出的枝条有限，使得压条繁殖的系数比较低，育苗速度较慢，远不能满足生产中对榛苗的大量需求。嫁接繁育时，苗木产生大量的根蘖，从而给生产和管理带来许多不便，所以很少采用。近些年，我国科研工作者虽然在棒子的扦插和组织培养方而取得了一定进展，但在生产上应用的效果并不稳定，故而也较少采用。截止目前，还没有找到一种比压条更为简单而高效的快速繁殖榛苗的方法。

目前，国内的榛子组培虽然取得了一些进展，但离生产还有一定距离，目前我国还未建立起适用范围广的榛子组培基本培养基，选用的外植体仍局限于芽、嫩梢、茎段等幼嫩组织，用成苗的器官、组织诱导脱分化的报道极少。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种平欧杂种榛组织培养的方法，解决了用于平欧杂种榛组织培养的培养基、激素配比，及用于组织培养的单茎段消毒不合理，进而导致平欧杂种榛组织成活率低，培养不易成功的问题。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种平欧杂种榛组织培养的方法，包括以下步骤：

(1)5月中旬取平欧杂种榛的嫩枝，剪成3～4cm的茎段，作为组织培养的外植体；

(2)将上述外植体用浓度为70～75体积％的酒精消毒10～30s，再用浓度为0.08～0.12体积％的hgcl2消毒6～10min，冲洗后备用；

(3)将上述外植体切成1～2cm长的带芽单茎段，接种到含有7.5g/lpvp的初代培养基中进行初代培养，得到初代培养的单茎段；

(4)将经过初代培养后的单茎段接种到增殖培养基中进行增殖培养，所述增殖培养基为nrm培养基，所述增殖培养基中还含有1.5mg/l的6-ba和0.01mg/l的iba，得到增殖培养的单茎段；

(5)将增殖培养后的单茎段蘸取1g/l的naa10s后扦插到基质中。

优选的，所述初代培养基为nrm培养基。

优选的，所述初代培养基或增殖培养基中还含有葡萄糖，所述葡萄糖的浓度为30g/l。

优选的，所述初代培养基或增殖培养基中还含有n-n′-乙基双-[2-邻羟基苯]-甘氨酸与铁的螯合物，其浓度为75～150mg/l。

优选的，所述基质为草碳和河沙以2∶1的重量比混合的混合物。

优选的，所述步骤(3)～(5)培养的条件为：温度控制为21℃～25℃，光照时间12～16h，光照强度2000～3000lx。

现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)以嫩梢、嫩枝和半木质化枝条为试材筛选最佳外植体的试验显示，榛子组培最佳外植体是春天刚萌发的嫩枝，带菌较少，消毒较易，且成活率较高。

2)naclo消毒处理的外植体其褐化率显著高于hgcl2处理，不适合于本试验品种的消毒。在防褐化方面，pvp和vc都能明显的降低其褐化率，但二者之间的差异并不显著，由于vc极易被氧化，本发明最终采用每升培养基中附加7.5gpvp。

3)在以dkw、wpm、nrm和ms为基本培养基时发现，促进株高伸长方面，培养基的作用效力是：dkw＞wpm＞nrm＞ms，且dkw培养基上的苗健壮，不易形成丛生芽或腋芽萌发；在促进芽分化方面，培养基的作用效力表现为nrm＞dkw＞wpm＞ms，nrm培养基上的芽苗极易产生丛生芽。故在以增殖为目的是易选择nrm作为基本培养基，而在以壮苗为目的时，易选择dkw作为基本培养基。

4)对比蔗糖、葡萄糖、果糖和乳糖四种糖作为碳源的试验显示，四种糖都能促进榛子的生长，但以葡萄糖和果糖的效果较佳，可能是由于其分子量小，易于吸收造成的，本发明最终选用每升培养基中附加30g葡萄糖。

5)铁盐不仅对榛子芽苗的芽数和芽长有促进作用，而且对榛子叶色影响很大，缺铁导致叶片黄化。相比feedta，fe138(有机螯合铁)更有利于榛子的增殖，且当添加100mg/l的fe138时，榛子芽苗的叶色表现出正常率。

6)增殖培养时，以nrm为基本培养基同时附加6-ba1.5mg/l+iba0.01mg/l，增殖系数可达6.7。当6-ba和iba浓度都较高或较低时，平均株高和增殖倍数较低，虽然不利于芽苗的增殖，但是茎段较粗并且叶色较绿。

7)促进生根的激素中，naa处理的生根效果要比iba的好。生根方式方面，瓶外生根将茎基部浸蘸于1.0g/l的naa溶液中10s，之后扦插于草炭河沙(2∶1)基质中，生根率可达到70.3％，而且苗长势较健壮，省去了炼苗移栽的步骤，成活率较高，值得推广。

附图说明

图1不同类型外植体的初代生长情况；a：嫩枝的生长情况(达维)，b：嫩梢的生长情况(达维)，c：半木质化绿枝的生长情况(辽榛3号)。

图2生长于不同基本培养基上的芽苗；a：dkw培养基上的苗(84-69)，b：nrm培养基上的苗(84-69)。

图3不同铁盐种类及浓度的芽苗生长情况；a：添加feedta1倍，b：添加fe138100mg/l。

图4生长于不同激素组合的芽苗；a：生长于6-ba1.5mg/l，iba0.01mg/l的芽苗(84-69)，b：生长于6-ba2.0mg/l，iba0.02mg/l的芽苗(84-69)，c：生长于6-ba1.0mg/l，iba0.005mg/l的芽苗(84-69)。

图5不同生根处理的生根情况；a：瓶外生根(84-69)，b：瓶外生根苗的长势(84-69)，c：瓶内生根(84-69)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1材料与方法

1.1试验材料

对沈阳农业大学榛资源圃的品种(系)调查发现，平欧杂种榛达维、玉坠、辽榛3号和84-69这些品种(系)不仅抗性强、丰产稳产，而且其榛果品质良好，适于在沈阳及周边地区推广。本试验选取以上品种(系)为试材，分别于4月下旬取其刚萌发的嫩梢、5月中旬取其旺盛生长的嫩枝、6月上旬取其半木质化的绿枝为样本。嫩梢去掉叶片和托叶、新生的嫩枝和半木质化的绿枝剪成3～4cm的茎段，作为组织培养的外植体。

如无特别说明，本试验每升培养基中琼脂7g，据试验需求添加其他激素，调节ph5.8，分装后121℃高压灭菌20min。接种后放到培养室中培养，温度控制在23℃左右，光照时间12～16h，光照强度2000～3000lx。

1.2试验方法

1.2.1外植体褐化抑制和消毒方法的筛选

针对榛属植物消毒后，褐化比较严重的现象。将经过0.1％hgcl2消毒7min后的外植体接种到空白和含有聚乙烯吡咯烷酮(pvp)(5g/l，7.5g/l，10g/l)或维生素c(vc)(1g/l，2g/l，3g/l)的培养基中，一周后统计其褐化率。

将取回来的外植体先用流水冲洗1个小时，再用洗衣粉水浸泡20min，用清水洗净后，转移到无菌操作台上进行“75％酒精浸泡30s→无菌水冲洗4～5次→naclo(15min、20min、25min)或hgcl2(6min、8min、10min)消毒→无菌水冲洗5～6次”，最后将茎段剪成1～2cm，接种到含有上步所筛选出防褐化剂的培养基中。3天后开始观察记录、持续一个月，统计各处理的污染率(污染的外植体数/接种总外植体数)、褐化率(褐化外植体数/接种总外植体数)和成活率(成活外植体数/接种总外植体数)。

1.2.2基本培养基的筛选

将上步存活下来的无菌茎段接种于含有3.0mg/l6-ba和0.01mg/liba的dkw(driverandkuniyuki)、wpm(woodyplantmedium)、nrm(nasandread)和ms培养基中，30天后统计芽苗株高(每瓶苗的平均株高)和单株芽数(单个外植体萌生嫩枝的数量)等生长指标。

1.2.3糖类的筛选

将无菌茎段接种于含有3.0mg/l6-ba和0.01mg/liba的上步所筛选培养基中，培养基中分别附加30g(蔗糖、葡萄糖、果糖或者乳糖)，30天后，统计芽苗的株高和单株芽数。

1.2.4铁盐的筛选

将无菌芽苗接种于含有3.0mg/l6-ba和0.01mg/liba的以上所筛选的培养基中，同时在培养基中附加不同浓度的feedta(1倍，1.5倍，2倍)或者fe138(100mg/l，150mg/l，200mg/l)，一个月后统计芽苗株高、单株芽数和植株生长情况。

1.2.5增殖培养基的筛选

将培养好的无菌芽苗剪成1～2cm长的茎段，转接于含有iba(0.005mg/l，0.01mg/l，0.02mg/l)和6-ba(1.0mg/l，1.5mg/l，2.0mg/l)的nrm培养基中，45天后统计芽苗株高，增殖系数(增殖后的芽苗数/接种总芽苗数)等生长情况。

1.2.6生根方法的筛选

将增殖的芽苗转接到如表1所示的处理中，20天后统计其生根情况。

表1不同生根方法的试验处理

1.2.7数据统计与分析

对所得数据采用spss17.0软件进行duncan式多重比较及差异性统计分析。

2结果与分析

2.1最佳的褐化抑制和消毒方法

榛子消毒后易于褐化，但本试验结果表明pvp和vc都能够明显的降低其褐化率，当pvp为7.5g/l时，褐化率达到最低，由对照的53.7％降到27.8％，vc为2.0g/l时，褐化率也降到了较低的28.2％。综上，pvp和vc防褐化效果明显，但二者之间的差异并不明显。本试验最终采用每升培养基中附加7.5g的pvp。

不同消毒剂及消毒时间对榛子的消毒效果有较大的影响(表2)。无论是naclo还是hgcl2处理，都出现了随着处理时间的延长，污染率逐渐下降，但褐化率与之负相关，呈上升趋势；这可能是由于随着消毒时间的延长对芽苗的伤害加剧造成的。另外naclo处理极显著的增高了外植体的褐化率，这可能是由于naclo的强氧化性造成的。hgcl2消毒处理8min时，成活率达到33.3％，显著高于其他处理，此时的褐化率达到了最低的26.7％，污染率也达到了较低的40.0％。综合考虑本试验最适合的消毒处理方式是0.1％hgcl2处理8min。

表2不同消毒方式对4种榛子嫩梢的污染率、褐化率、成活率的影响

注：同列不同字母表示在p＝0.05水平上差异显著。下同。

2.2最佳外植体类型

榛子组织培养中由于材料的状态不同，常导致不同的培养结果。从表3可以看出不同外植体类型的成活率显著不同；嫩枝的成活率显著高于嫩梢和半木质化绿枝的成活率，其污染率和褐化率也都达到最低，分别为18.9％和26.7％，是最佳的取材状态(见图1，a)。刚萌发的嫩梢虽然成活率也较高，但其芽苗生长不但缓慢，而且新生和长大叶片会出现畸形的现象(见图1，b)。半木质化绿枝的污染率和褐化率都最高；可能是由于外界环境变暖、杂菌快速繁殖、榛子体内多酚物质含量增加及多酚氧化酶活性增强造成的；半木质化绿枝所长的芽苗还有一个显著特点是后期叶片容易变黄脱落(见图1，c)。表3不同外植体类型对4种榛子污染率、褐化率、成活率及生长情况的影响

2.3基本培养基的选择

表4nrm、dkw、wpm和ms培养基的各成分含量比较

不同的基本培养基对榛子的生长情况有较大影响，由表5可知，四种培养基中ms处理，不论是株高还是单株芽数都显著低于其他三个处理，所以，ms培养基不适合于榛子组培；dkw处理，株高显著高于其他处理，达到2.6cm且植株向上生长明显(见图2，a)，而nrm处理的单株芽数显著高于其他处理，达到4.6个，植株易产生丛生芽(见图2，b)。综合以上各因素认为，dkw培养基适合于壮苗培养，nrm培养基适合于增殖培养。

表5不同基本培养基对4种榛子芽苗生长指标的影响

2.4糖类的确定

表6不同的糖种类对4种榛子芽苗生长的影响

糖在榛子的组织培养基中不仅为芽苗提供能源，同时也在调节培养基的渗透势。在本试验中，采用了蔗糖、葡萄糖、果糖和乳糖这四种糖做碳源进行了对榛子芽苗生长和增殖的研究。由表6可知，四种糖都能促进榛子增殖，不同的糖对榛子组培苗的株高和单株芽数有显著的影响，蔗糖对芽苗增殖的效果明显低于其它三种糖的处理，其株高和单株芽数都是最低的。葡萄糖与果糖的增殖效果比较好，其中以葡萄糖的效果最佳，其株高能达到3.7cm，单株芽数也最高为4.6个。本试验最后采用每升培养基中附加30g葡萄糖作为碳源。

2.5铁盐种类及浓度的确定

铁元素的种类和浓度对榛子芽苗的株高，叶片颜色有显著的影响，榛子在快速生长阶段对铁元素是比较敏感的。从表7中，可以看出，两种铁盐随着浓度的增加，对芽苗的增殖起到促进的作用，对叶片颜色的黄化有所改善。但是这两种铁盐相比，不论是叶片颜色还是芽苗增殖方面都是fe138(n-n′-乙基双-[2-邻羟基苯]-甘氨酸)的效果要优于feedta的。当feedta的浓度为1倍时，芽苗黄化较严重(见图3，a)，但是随着浓度的增加，芽苗黄化有所改善，但改善程度不是很大，株高方面增长显著，单株芽数也显著增加。fe138为75mg/l时，芽苗黄绿，随着fe138浓度的增加，叶片颜色明显转绿，株高和单株芽数也显著升高，150mg/l时，其叶片已经转为正常绿色了(见图3，b)，100mg/l与125mg/l主要区别在于叶片颜色的浓绿程度。综合考虑本试验采用每升培养基中附加100mg/l的fe138。

表7铁盐种类及浓度对4种榛子芽苗生长的影响

2.6增殖培养基的确定

在以nrm为基本培养基时，不同浓度的激素组合对榛子的生长有显著的影响。如表5所示，当iba浓度一定，6-ba为1.5mg/l时，普遍比其他浓度的株高高，单株芽数也最多。相反当6-ba浓度一定，iba浓度为0.01mg/l时，普遍比其他浓度的长势好。综上所述，当6-ba为1.5mg/l，iba浓度0.01mg/l，最有利于芽苗增殖(见图4，a)，平均株高和增殖系数都显著高于其他组合，分别达到5.6cm，6.7。当6-ba和iba浓度都较高或较低时，虽然不利于芽苗的增殖，平均株高和增殖倍数较低，但是茎段较粗并且叶色较绿(见图4，b、c)。

表8不同浓度激素组合对3种榛子芽苗增殖的影响

2.7最佳生根处理的确定

以84-69为试材，进行了瓶内和瓶外两种生根方式的生根处理。瓶外生根不仅生根率高(如表6)可达到70.3％，而且苗长势健壮，根粗且壮(见图5，a、b)；瓶内生根整体生根率较低(见图5，c)，并且芽苗长势不如瓶外良好；处理3的芽苗基部膨大且生长了气生根，可能是蘸取激素的浓度过大造成的，但即便浓度合适，由于操作复杂，也极易造成污染。综合考虑，榛子最佳生根处理为瓶外蘸取1g/l的naa10s后扦插到基质中。

表9不同生根处理对84-69芽苗生长指标的影响

3讨论

榛子表面绒毛密集，消毒很难彻底，同时，榛属植物组织中酚类物质含量较高，易出现外植体或培养物的褐化、枯死现象，这种褐化现象又称为酚污染，会对外植体的脱分化和营养物质的再分化产生严重的影响，甚至对其初代培养能否成功起到决定性的作用。因此榛属植物组织培养体系的建立比较困难。本发明试验中发现naclo处理的外植体，褐化率显著增高，达85.3％以上，故认为naclo不适合于榛属灭菌；最佳的消毒处理是0.1％hgcl2灭菌8min，成活率达到33.3％。试材最佳状态是嫩枝。

基本培养基中包含了许多植物生长发育所需要的营养物质，因此，基本培养基是植物组织培养的物质基础，也是植物组织培养能否获得成功的重要因素之一。但是，培养基选取的时候，既需要考虑培养基基本成分的作用，又要考虑不同培养阶段的需求和目的，涉及到了方方面面，因此是一件很复杂的工作。本发明试验对榛子在dkw、wpm、nrm和ms培养基中的生长情况进行了比较，发现dkw培养基可有效促进茎段的伸长生长，植株长势健壮，其表现要优于ms和wpm培养基。nrm培养基可有效的促进腋芽萌发，促进形态的建成，芽苗分化较多。wpm培养基是适宜木本植物组织培养的培养基。nrm培养基是针对美国野生榛与欧榛杂种榛提出来的，试验表明在促进芽苗分化方面也适用平欧杂种榛。dkw和nrm培养基都比较适合榛子的组织培养，分析各培养基的组份可以发现，发现dkw培养基中含氮化合物的量明显高于nrm和wpm培养基中的，影响了外植体对氮的吸收，另外，dkw培养基中含有较多的ca²⁺、cu²⁺、fe²⁺、k⁺，利于茎段的伸长和有机物的合成。nrm培养基中，mg²⁺、微量元素和生育酚的含量是比较高的，有利于丛生芽的产生。充分说明了，在植物组织培养过程中，基本培养基对组培成功与否是至关重要的。本试验首次发现在促进株高伸长方面，培养基的作用效力是：dkw＞wpm＞nrm＞ms，且dkw培养基上的苗健壮，但不易形成丛生芽或腋芽萌发；在促进芽分化方面，培养基的作用效力表现为nrm＞dkw＞wpm＞ms，nrm培养基上的芽苗极易产生丛生芽。所以，以增殖为目的时，适宜选择nrm作为基本培养基；而以壮苗为目的时，适宜选择dkw作为基本培养基。

糖类不仅为组培苗提供碳源，而且对维持培养基的渗透势具有重要的影响。不同的糖类对榛子芽苗的生长具有显著的差异，糖的种类和浓度不仅影响到榛子的生长速度、生长量，还会影响植株细胞的形态发生，是组培成功与否的一个关键影响因素。本发明试验的结果显示，四种糖类都能促进榛子的生长，其中以葡萄糖和果糖的效果较为理想，蔗糖和乳糖效果较差。之所以会出现这种情况，可能是由于葡糖糖分子较小，榛子对较小分子糖类的利用率较高造成的。

铁元素虽然不是叶绿素的组成成分，但是缺铁会影响到叶绿素的形成和叶绿体的结构组分，进而导致叶片黄化，光合速率降低。本发明试验使用fe138和feedta做对比，发现feedta的处理叶片黄化比fe138处理的要严重些，即便加大feedta的浓度，芽苗的增殖效果与叶片的颜色也不如使用fe138的处理，而且添加feedta的处理随着继代时间的延长，叶片黄化程度变得比较严重。添加fe138的处理，叶片颜色得到明显改善，株高也显著增大，植株比较健壮，添加fe138100mg/l时叶片颜色已经转为正常率，再继续加大用量，对芽苗增殖并无显著的影响。所以本发明试验最终选用fe138100mg/l。之所以两种铁盐对芽苗的生长效果不同，可能是因为榛子对不同的铁离子的吸收利用效率不同造成的，fe138中的铁离子易于被榛子吸收利用。

在基本培养基筛选时，我们发现，榛子既可以通过单芽增殖，又可以通过丛生芽增殖，这两种增殖途径的调节主要是由基本培养基的类型和激素影响的。一般，当生长素/细胞分裂素的比值高时，促进长根，比值低时促进长芽，中间比值较利于愈伤组织的诱导和分化。榛子组织培养时激素对芽苗的增殖和分化有重要的作用，增殖培养时要特别重视生长素与细胞分裂素的配合使用，细胞分裂素的浓度要始终高于生长素，以便不定芽的诱导。本发明试验中发现不同的激素浓度组合对芽苗的增殖有显著的影响，所筛选的1.5mg/l6-ba和0.01mg/liba组合，使试验所用的榛子试材的增殖倍数都得到了显著的提高，适宜榛子组培的增殖，对建立其他平欧杂交榛品种组培快繁体系有一定的借鉴之处。

植物组织培养过程中，木本植物的生根要比草本植物困难很多。一般植物的离体生根都来自于不定根，分两个阶段，第一个阶段是诱导根原基，第二个阶段是根的伸长及生长。生长素于第一阶段即诱导根源基阶段大量合成，在第二个阶段时就处于较低的水平了。一般低浓度的生长素会促进生根，高浓度时会抑制生根。相同浓度的iba和naa对芽苗进行处理，含naa的处理生根效果要高于iba，所以生根处理易选择naa，在相同naa浓度的溶液中浸蘸芽苗基部，接种于瓶内培养基的处理，其生根效果要显著低于接种于瓶外基质中的处理。另外，浸蘸处理后再接种于培养基中，由于操作繁琐，极易造成污染，不利于其大规模的生根处理。短时间的浸蘸处理，可能刺激了芽苗基部表层细胞的分化，从而促进长根。所以，最佳的生根方式是把芽苗基部在1.0mg/l的naa溶液中浸蘸10s，接种于瓶外的基质中，这种生根方式把芽苗的生根与驯化有机的结合起来，能实现缩短育苗周期，节约生产成本的目标，对大规模生产有实际经济效益。但是瓶外生根的芽苗，对外界的环境要求比较严格，需要适宜且稳定的湿度、温度和光照，炼苗期间，需要用心看护与观察。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。