本发明属于生物技术育种领域，涉及一种耐病毒甘薯种间渐渗系的培育方法。
背景技术：
栽培种甘薯ipomoeabatataslaml.(2n＝6x＝90)属于旋花科甘薯属，是富含淀粉的块根作物，产量高，适应性广，用途多，因其淀粉含量及酒精转化率高而成为我国燃料乙醇生产的主要原料之一，还是重要的饲用、菜用和淀粉加工用原料，并具有抗癌、防糖尿病、抗氧化等保健功能。
甘薯病毒病(sweetpotatovirusdiseases,spvd)主要由甘薯羽状花叶病毒(spfmv)和甘薯褪绿矮化病毒(spcsv)相互作用所引起的，其中，spcsv可使spfmv病毒含量呈几何级数增长。例如，当spfmv和spcsv共同侵染甘薯时，spfmv的含量比其单独侵染时增加600倍。spvd显症植株的产量比健康植株减少79-86％，比spcsv单独侵染植株的产量减少62-72％。spvd一旦爆发流行将对甘薯生产造成严重危害，spvd在非洲薯区可使甘薯减产56-98％；在南美洲秘鲁一般减产在65％以上；在中国一般减产20-50％，多则可达78％。
解决spvd对甘薯生产的危害的常用手段之一为茎尖脱毒。然而，茎尖脱毒存在一定的局限性。其中，除工作量较大外，其再生体系受基因型的影响，很多品种由于愈伤不能再生而失去了脱毒价值，获得的脱毒植株也很容易受到病毒再侵染而感病更重。
在基因工程方面，许多学者通过转化外壳蛋白基因(cp)、花椰菜花叶病毒基因(hpt)，复制酶基因(rdrp)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(cpi)等获得大量的转基因株系，其中okada获得了抗fmv转基因植株。然而，到目前为止还没有获得抗spvd的转基因株系。
最安全、根本和有效的策略是创制抗spvd新材料甚至培育抗病毒新品种。许多研究人员筛选了大量甘薯品种或种质资源，虽然找到了部分抗性材料，但是表现极不稳定。目前，还没有发现极端抗性的栽培种材料。然而，却在甘薯近缘野生种中发现了诸多抗性和极端抗性的抗源材料([1]karyeijarf等.twoserotypesofsweetpotatofeatherymottlevirusinugandaandtheirinteractionwithresistantsweetpotatocultivars.phytopathology2000,90:1250–5.；[2]曹清河等.甘薯近缘野生种的抗病性鉴定与新型种间杂种的获得.植物遗传资源学报，2009，10(2):224-229)。这为从根本上解决spvd抗源缺乏和创制抗spvd新种质提供了坚实的物质基础。
种间渐渗系(introgressionlines,ils)，即外源小片段染色体渐渗到受体染色体组中的植株个体。利用以上种间杂交和渐渗回交途径可以实现外源目标基因通过外源染色体或染色体片段向受体基因组转移，提高受体栽培品种的抗性或其它性状，实现对野生资源优异基因的利用。
渐渗系(ils)是研究qtl的理想群体。与常规平衡群体相比，利用ils群体分析基因或qtl有如下优点：(1)ils不育性大大降低,适于进行与产量、品质相关的性状分析；(2)ils中不存在两个外源片段之间产生的上位性,因此检测小效应qtl的统计功效较高；(3)ils群体是永久性群体,不同的研究者可以在不同的时间、不同的地点进行试验，所获得的数据可以在数据库中累加；(4)ils创建过程中多轮的回交使连锁基因间重组率提高，可以将qtl作图于较小的区间，降低连锁累赘的影响。由于这些明显的优点,ils被广泛应用于外源种质中抗性或优异qtl的筛选、qtl的检测和精细定位、qtl的遗传效应分析以及基因的图位克隆。到20世纪末，小麦就渐渗了30个外源基因到栽培种去；番茄利用15个独立的外源渐渗基因培育了大量商业品种；水稻拥有2000多份野生稻资源，并渐渗了大量抗病、产量相关基因或qtl，且获得的部分渐渗系已经成为了商品化栽培品种。目前为止，国内外还没有利用甘薯近缘野生种培育抗病毒渐渗材料的报道，也没有培育甘薯渐渗系的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高效的耐病毒甘薯种间渐渗系的培育方法，解决花期不遇，坐果率低，杂种不育的问题。
本发明的技术方案如下：
一种耐病毒甘薯种间渐渗系的培育方法，利用广亲和性亲本徐薯18，与抗病毒的甘薯野生种进行种间杂交，保证杂交数量和利用杂交处理液处理的基础上，获得种间杂种实生种子，然后对获得杂种f1群体进行跟踪鉴定，选择抗spvd的真杂种为母本，栽培种徐薯18为轮回亲本进行连续回交3代，构建bc3f1群体，最后对bc3f1群体进行抗性鉴定和标记分析，获得耐病毒渐渗群体bc3f1，具体步骤为：
(1)甘薯与近缘野生种种间杂种的获得：以栽培种徐薯18为母本，抗病毒甘薯野生种为父本杂交获得杂种f1，通过抗性、gish和ssr分子标记鉴定真实杂种；
(2)甘薯种间渐渗系的培育：选择真实杂种为母本，栽培种徐薯18为轮回亲本进行3代回交，获得甘薯种间渐渗系；
(3)甘薯种间渐渗系耐病毒鉴定：获得的甘薯种间渐渗系在每年3月中下旬开始育苗，5月下旬栽插，7月底和9月中旬对田间spvd发病情况进行统计，按如下公式分别计算7月底和9月中旬的病情指数：
病情指数＝∑(各级病株数×相对级值数)/(调查总数×7)×100，根据计算得到的7月和9月的病情指数，计算病情指数平均值，再根据病情指数平均值和公式：耐病指数＝100％－病情指数平均值，计算其耐病指数，病情指数平均值＜15，即耐病指数＞85的株系即为耐病毒甘薯种间渐渗系，其中，相对级值数的分级标准为：0级为：无症状，1级为：有轻微的症状包括轻微的褪绿或紫斑；3级为：有中度症状，包括褪绿、脉明、中脉褪绿、斑驳和花叶；5级为：植株没有矮化，但表现严重的明脉、斑驳、褪绿斑和花叶等症状；7级为：植株严重矮化、叶片变小畸形和严重褪绿等症状。
步骤(1)中，所述的栽培种徐薯18为5月中旬，待砧木茎基部长0.5-1cm时，选择健壮植株切除顶部进行嫁接，剪直径在0.5-1cm左右的健康高剪徐薯18苗子做接穗，以日本牵牛为砧木，利用插接法进行嫁接，1-2周嫁接成活后移入杂交盆，进行8h短日照光周期处理。
步骤(1)中，所述的抗病毒甘薯野生种在露地开花期为7-10月，嫁接后的徐薯18经过30-40天暗处理，在8月初大量现蕾，使双方现蕾时间重叠。
步骤(2)中，甘薯种间渐渗系的培育方法为对徐薯18提前去雄和套袋，混合抗病毒甘薯野生种花粉，于第二天早上8:00-10:00授粉，杂交后封闭花冠，防止昆虫传粉，授粉数量>100朵花，杂交后经过40-50天左右，杂交后果实基本成熟，当果柄变干后采收，对杂种实生种子破壳、催芽和播种，等待苗子成株后，扦插扩繁。
本发明的有益效果是：本培育方法突破了甘薯传统遗传群体构建方法，是对种间有性杂交的有益扩展，拓宽了甘薯遗传基础，可以以较小群体规模构建高密度的遗传图谱，减少应用过多标记等人力、物力的花费；可以创制耐spvd的优异渐渗株系，用于抗甘薯spvd遗传改良。
附图说明
图1为本发明培育方法的线路示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
实施例1
具有i.violacea血缘渐渗系，具体培育方法如下：
1、甘薯与近缘野生种种间杂种的获得
1)亲本材料准备：母本徐薯18种薯于春季4月初排种于日光温室，地膜覆盖。4月底，野生种i.violacea和日本牵牛i.nil(砧木)实生种子经浸种、催芽后，播种于10×10cm营养钵中。待5月中旬，待砧木茎基部长0.5-1cm时，选择健壮植株切除顶部进行嫁接，剪直径在0.5-1cm左右的健康高剪徐薯18苗子做接穗，以日本牵牛为砧木，利用插接法进行嫁接。1-2周嫁接成活后移入杂交盆，进行8h短日照光周期处理。野生种在两叶一心(两片真叶展开，一片子叶露出)时，定植于杂交盆中。
2)花期调控和杂交授粉：野生种在露地开花期为7-10月。嫁接后的徐薯18经过30-40天暗处理，在8月初即可大量现蕾。父本抗病毒甘薯野生种经催芽、播种、育苗并定植于同样大小的花盆中，施足底肥，搭架培养，促其自然开花。一般根据野生种的花期调节母本徐薯18现蕾时间，达到双方都现蕾的目标。对母本提前去雄和套袋，混合父本花粉，于第二天早上8:00-10:00授粉，杂交后封闭花冠，防止昆虫传粉，授粉数量>100朵花。为增加座果率，可施加植物生长调节剂100mg/lga3+50mg/l6-ba，用浸有上述生长调节剂的脱脂棉球对授粉后子房基部连续处理10天。
3)杂种收获及鉴定：经过40-50天左右，杂交后果实基本成熟，当果柄变干后即可采收。对获得杂种f1实生种子破壳、催芽和播种，等待苗子成株后，扦插扩繁。利用扦插苗分别进行抗病鉴定、收集根尖进行基因组原位杂交(gish)及采集叶片进行dna提取和ssr标记分析。通过抗性、gish和分子标记鉴定真实杂种。待植株成株后，剪其幼嫩枝条水培生根。
2、甘薯种间渐渗系的培育方法：
1)bc1f1群体的获得：选择经过鉴定的真杂杂种为母本，栽培种徐薯18为轮回亲本进行回交，构建bc1f1群体。回交方法同种间杂交方法。
2)bc2f1群体的获得：对bc1f1群体进行抗性、gish、分子标记分析，筛选抗性、含有野生血缘dna片段的株系作为母本，以栽培甘薯徐薯18为父本，进行回交，构建bc2f1群体。回交方法同种间杂交方法。
3)bc3f1群体(渐渗系)的获得：对bc2f1群体进行抗性、gish、分子标记分析，筛选抗性、含有野生血缘dna片段的株系作为母本，以栽培甘薯徐薯18为父本，进行回交，构建bc3f1群体。回交方法同种间杂交方法。
4)渐渗系群体特征检测：对获得群体进行抗性、gish和ssr分子标记分析，群体抗性水平呈正态分布，群体大部分单株通过gish检测，会有外源染色体荧光信号，ssr标记可以检测外源dna。
3、甘薯种间渐渗系耐病毒鉴定：本研究采用的亲本及群体单株分别种植在自然可以传播spvd的大田中。试验田按照单株的序列号依次分区组种植，亲本及每个单株重复种植至少3次。每一个区域种植20株，株距约30厘米，行距100厘米。实验条件保持一致。试验材料在每年3月中下旬开始育苗，5月下旬栽插，7月底和9月中旬对田间spvd发病情况调查。以单株为调查单位，每一个小区的全部植株都需进行调查，记录发病率和其严重程度，并计算7月和9月的病情指数(病情指数＝∑(各级病株数×相对级值数)/(调查总数×7)×100)。根据计算得到的7月底和9月中旬的病情指数，计算病情指数平均值，再根据病情指数平均值和公式：耐病指数＝100％－病情指数，再根据病情指数平均值和公式：耐病指数＝100％－病情指数平均值，计算其耐病指数，病情指数平均值＜15，即耐病指数＞85的株系即为耐病毒甘薯种间渐渗系，其中，相对级值数的分级标准为：0级为：无症状，1级为：有轻微的症状包括轻微的褪绿或紫斑；3级为：有中度症状，包括褪绿、脉明、中脉褪绿、斑驳和花叶；5级为：植株没有矮化，但表现严重的明脉、斑驳、褪绿斑和花叶等症状；7级为：植株严重矮化、叶片变小畸形和严重褪绿等症状。表1为bc3f1群体7月和9月的病情指数结果。从表中可以看出b3f1058-2，b3f1058-8，b3f1058-10，b3f1058-11，b3f1058-13，b3f1058-14等系列的甘薯种间渐渗系的耐病指数均＞85，表现出良好的耐病毒性能。本发明培育方法突破了甘薯传统遗传群体构建方法，是对种间有性杂交的有益扩展，拓宽了甘薯遗传基础，可以以较小群体规模构建高密度的遗传图谱，减少应用过多标记等人力、物力的花费；可以创制抗spvd的优异渐渗株系，用于抗甘薯spvd遗传改良。
表12014年7月和9月田间病情调查