本发明涉及一种细鳞鲑三倍体苗种的育苗方法。
背景技术：
鲑鳟鱼是世界目前主要养殖的鱼类之一，由于其自身的品质和对生活环境的特殊要求，决定了它绿色、环保营养食品的性质，因此颇受消费者的青睐。据fao统计资料，近年来全球鲑鳟鱼养殖年产量超过200万t，排在鲤科鱼类和罗非鱼之后，是世界第三大主要养殖鱼类(纪锋等.水产学杂志，2012，25(3)：63-68)。鲑鳟鱼是我国目前主要的冷水性养殖鱼类，随着我国鲑鳟鱼养殖的迅速发展，基础理论研究相对滞后、亲鱼种质退化导致苗种质量退化、生产效益下降等问题逐渐突出，从而制约了鲑鳟鱼养殖业的可持续发展(孙大江等.水产学杂志,2010，23(2):56-63)。我国目前仍需要大量进口鲑鳟鱼，进口量超过同期国内鲑鳟鱼年度养殖产量2倍以上(农业部渔业渔政管理局.中国渔业统计年鉴.2016)。利用现代生物技术，培育生长迅速、个体大、肉质好、抗病能力强的种苗，成为我国鲑鳟鱼养殖业的持续、稳定、健康发展的必由之路。
鱼类染色体组操作是遗传育种工作的重点研究领域之一。在多倍体鱼中，三倍体鱼因染色体组成不平衡，性腺不能发育成熟，避免了性腺发育时期生长停滞和鱼肉质量下降等不利影响，对控制过度繁殖、增加生长速率、延长成熟鱼的寿命以及提高养殖产量和鱼肉质量具有重要的意义。自上世纪80年代以来，国内外三倍体鱼的人工诱导工作取得了长足进展，已获得60多种三倍体鱼。我国三倍体的异育银鲫、湘云鲫已进入实用化生产阶段，在鲑鳟鱼方面尚不能达到规模化生产程度，年度进口鲑鳟鱼发眼卵约3000万粒以上，占据虹鳟全雌三倍体发眼卵市场的几乎全部份额(农业部渔业渔政管理局.中国渔业统计年鉴.2016)。国产鲑科鱼类的三倍体育种生产还是空白。
细鳞鲑(brachymystaxlenok)是我国名贵的鲑科冷水性鱼类，常见个体1kg左右，具有重要的经济价值，由于幼鱼生长速度较慢，繁殖后亲鱼死亡率较高等因素影响了规模化生产。三倍体鱼可有效解决上述问题。温度休克法是成本最低、技术最易掌握的鱼类三倍体育种方法。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供一种细鳞鲑三倍体苗种的育苗方法。
本发明采用如下技术方案：
一种细鳞鲑三倍体苗种的育苗方法，包括：受精后15-20min，将受精卵放入17-20℃(优选17℃)水浴中过渡1min；然后放入26℃水浴中热处理10-20min；再置于6-10℃孵化水温的容器中进行孵化。
进一步地，上述细鳞鲑三倍体苗种的育苗方法，包括：受精后15-20min，将受精卵放入17℃水浴中过渡1min；然后放入26℃水浴中热处理20min；再置于6-10℃孵化水温的容器中进行孵化。
较佳地，上述细鳞鲑三倍体苗种的育苗方法，包括：受精后20min，将受精卵放入17℃水浴中过渡1min；然后放入26℃水浴中热处理20min；再置于6-10℃孵化水温的容器中进行孵化。
进一步地，将性腺发育成熟的亲鱼经注射催产剂催产，采用干法受精，获得受精卵。
所述催产剂可用促黄体素释放激素类似物和马来酸地欧酮混合使用。
进一步地，受精卵孵化可采用虹鳟常规孵化方法。
进一步地，将热处理后的受精卵置于6-10℃孵化水温的容器中2-4h内，检出死卵，再进入正常孵化。
进一步地，受精卵发眼前用孵化桶孵化，发眼后移入到平列槽。
进一步地，受精卵孵化期控制水温8-10℃，溶解氧＞5mg/l；和/或，整个孵化期积温需要260-280度·日。
具体地，上述细鳞鲑三倍体苗种的育苗方法，包括如下步骤：
1)采卵与受精：
将性腺发育成熟的亲鱼经注射催产剂催产，干法受精获得受精卵；
亲鱼年龄：雌亲鱼4+龄以上，雄亲鱼3+龄以上；最小规格：雄亲鱼500g以上，雌亲鱼750g以上；催产剂为促黄体素释放激素类似物和马来酸地欧酮；受精时雌雄亲鱼尾数配比接近1：1；采卵水温6-8℃；精卵用羽毛搅拌15-20s使精卵混合均匀，加入少量清水缓慢搅拌1min，再用清水冲洗2-3遍，洗去过多精液、卵皮、血块，加入清水放置，待卵吸水膨胀；
2)热休克诱导：
受精后15-20min，将受精卵放入不锈钢漏网(例如直径15cm)中，先在17-20℃水浴锅中过渡1min；然后再放入26℃的电子恒温水槽中，轻轻上下晃动漏网，使受精卵尽快与周围水温相一致；热处理10-20min后将受精卵直接放入6-8℃孵化水温的容器中，2-4h内检出死卵，进入正常孵化；
3)受精卵孵化：
采用虹鳟常规孵化方法；受精卵发眼前用孵化桶孵化，发眼后移入到平列槽；孵化期控制水温8-10℃，溶解氧＞5mg/l；整个孵化期积温需要260-280度·日。
采用本发明方法，一般30天左右即可得到细鳞鲑三倍体仔鱼。孵化期间受精卵发眼率为80％以上，孵化率达到90％以上，得到的仔鱼经流式细胞仪检测，三倍体率达到100％。
如无特殊说明，本发明倍性检测采用pacteccyflowcube8型流式细胞仪检测鱼苗血液dna相对含量的方法确定三倍体率。鱼苗培育至5cm左右，试验组每组随机采样25-30尾，断尾抽血，每次检测3尾二倍体鱼苗作为对照。
有益效果：
1)本发明方法所用雌亲鱼4+龄以上，雄亲鱼3+龄以上，经流水刺激、药物催产，采卵水温6℃以上，催产率可达90％以上。
2)掌握采卵时机，防止卵过熟，雌雄亲鱼尾数配比接近1：1，受精率可达95％以上。
3)受精卵热休克处理前，在17-20℃水中过渡1min，可减少温差过大对卵的刺激，2-4h死亡率控制在10％以下。受精后15-20min，热处理10-20min，三倍体率可达100％。
4)孵化期用蓄水箱调节水温在8-10℃，避免水温浮动过大，定期用药物消毒，控制水霉菌滋生，孵化率可达90％以上。
实验结果表明，采用本发明方法，受精卵2-4h死亡率4.71-8.31％，发眼率78.18-92.62％，孵化率82.59-90.74％，三倍体率68.56-100％。
本发明提供的细鳞鲑三倍体苗种制备方法，缓解了由于亲鱼繁殖后死亡率高、幼鱼生长速度慢、抗病力低、稚鱼开口驯化成活率低等问题，具有成本低，易操作等优点，具有较好的市场价值。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下所用水浴锅和电子恒温水槽控制温度范围5-99℃，误差≦0.5℃，灵敏度0.1℃。
催产剂为宁波激素总厂生产的促黄体素释放激素类似物(lhrh-a2)和马来酸地欧酮(dom)。
实施例1
一种细鳞鲑三倍体苗种的制备方法，具体包括如下步骤：
1)采卵与受精：挑选4+龄以上，体质健壮，发育良好的亲鱼，雄亲鱼规格500g以上，雌亲鱼规格750g以上。雌鱼使用催产剂剂量为每千克鱼2.5uglhrh-a2+2.5mgdom，雄鱼减半，雌雄配比为1：1，干法受精。采卵水温6-8℃。精卵用羽毛搅拌15-20s使精卵混合均匀，加入少量清水缓慢搅拌1min，再用清水冲洗2-3遍，洗去过多精液、卵皮、血块，加入清水放置，待卵吸水膨胀。
2)热休克诱导：受精后15-20min，将受精卵放入直径15cm的不锈钢漏网中，先在水温17℃的水浴锅中过渡1min，再放入24-28℃的水槽中进行热处理，轻轻上下晃动漏网，使受精卵尽快与周围水温相一致。热处理10-20min后将受精卵取出直接放入6-8℃孵化水温的容器中，2-4h内检出死卵，计数，进入正常孵化。
3)受精卵孵化：在室内进行，要求光线昏暗，避免震动。受精卵发眼前用孵化桶孵化，发眼后移入到平列槽。发眼后随机取样300粒卵，胚体有明显黑色眼点为发眼卵，检出未发眼卵、白卵，计算发眼率。出膜期，统计检出死卵数，计算孵化率。孵化期水温8-10℃，溶解氧＞5mg/l，整个孵化期积温需要260-280度·日。
4)倍性检测：采用pacteccyflowcube8型流式细胞仪检测鱼苗血液dna相对含量的方法确定三倍体率。鱼苗培育至5cm左右，试验组每组随机采样25-30尾，断尾抽血，每次检测3尾二倍体鱼苗作为对照。
仅仅改变步骤2)受精卵热休克诱导起始处理时间、热处理温度及持续处理时间，设置6组实验，各组步骤2)处理方法及相关实验结果如下：
1)受精后20min，24℃处理20min，4h死亡率(12.57±0.24)％，发眼率(84.19±0.21)％，孵化率(85.56±1.15)％，三倍体率48.25％；
2)受精后15min，26℃处理10min，4h死亡率(4.71±0.15)％，发眼率(78.18±0.23)％，孵化率(88.31±0.71)％，三倍体率68.53％；
3)受精后15min，26℃处理20min，4h死亡率(5.98±0.20)％，发眼率(89.73±0.37)89.72％，孵化率(82.59±0.39)％，三倍体率90.06％；
4)受精后20min，26℃处理10min，4h死亡率(4.85±0.02)％，发眼率(85.83±0.16)％，孵化率(88.33±0.79)％，三倍体率74.17％；
5)受精后20min，26℃处理20min，4h死亡率(8.31±0.64)％，发眼率(92.62±0.74)％，孵化率(90.74±0.03)％，三倍体率100％；
6)受精后20min，28℃处理20min，4h死亡率(21.76±0.12)％，发眼率(79.22±0.30)％，孵化率(25.63±0.17)％，三倍体率57.62％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。