本发明涉及一种组培育苗技术领域，尤其是涉及一种苹果树苗组培繁育的方法。
背景技术：
脱毒苹果苗是对温度、光照、环境在严格的人工控制下，通过采用生物工程技术中的植物组织和细胞培养技术而获得的无病毒苗木。由于病毒的原因可以导致果实畸形、果园无病毒采穗园减产，甚至于可以导致绝收的致使性危害。采用扦插、嫁接、分株、压条(营养器官)繁殖的苹果苗，都可能携带一种甚至多种病毒或类病毒，对苹果苗的生产及产品质量都会产生不良影响。在植物组织培养过程中，我们利用微茎尖和热处理可脱除植物所带病毒，而获得无病毒苗。其苗木根系发达，生长健壮，肥水利用率高，抗逆性强、结果早。栽培无病毒苗木是防治苹果树病毒病的最根本、最有效的途径，不仅可以大大提高产量和改善果实品质，而且获得明显的经济和社会效益。现阶段在组培苹果苗的过程中，褐化问题严重，组培诱导出的嫩芽萌发率极低，使得苹果苗产量下降。
技术实现要素：
本发明是提供一种苹果组培扩繁的方法，其主要是解决苹果外植体组培繁育过程中褐化问题严重，致使幼苗的成活率低的问题，同时提出了一套繁育方法。
本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：
a.外植体的选取与消毒：选择生长健壮的无病虫害植株，切取嫩芽，用毛刷清理表面，随后流水下冲洗，在超净工作台上用酒精进行消毒，然后用无菌水冲洗2-3次，转入氯化汞溶液中进行消毒，再用无菌水冲洗3-4次，随后在放大镜下将嫩芽环切至其大小的1/3，后备用。
b.诱导嫩芽萌发：在超净工作台中将上一步得到的嫩芽切除多余部分，接种到诱导嫩芽萌发的培养基中，培养基组分为：ms基本培养基+6-ba
3-4mg/l+iba0.2-0.4mg/l+白糖25-35g/l+琼脂5g/l+活性炭0.3-0.5g/l，吐温20：0.5‰-0.8‰，ph调至5.8；
过5天后继续接种至以上培养基中，继续培养，以上步骤重复三次，直至不再有褐化产生。
c.增殖培养：将上一步得到的无菌萌发的嫩芽进行转入增殖培养基中继代扩繁，增殖培养基配方组分为：ms基本培养基+6-ba0.8-1.0mg/l+iba0.1-0.3mg/l+白糖25-35g/l+琼脂5g/l，ph调至5.8；
d.生根培养：将增殖得到的嫩芽进行分芽，转入生根培养基中生根培养，生根培养基配方组分为：1/2ms基本培养基+iba0.6-0.8mg/l+白糖25-35g/l+琼脂5g/l，ph调至5.8
e.驯化移栽：将上一步得到的8-10cm健壮无菌苗，根长打开瓶盖，覆上湿毛巾在通风处炼苗2-3天，期间注意保持毛巾处于湿润状态，移栽驯化前对苗床和基质进行处理和消毒，基质采用草炭土和珍珠岩，配比范围介于1∶1和2∶1之间，消毒后，苗床的厚度4-6cm；将经过通风炼苗的苹果组培苗，扦插到上述苗床中，扦插完成之后使用电磁阀对湿度进行控制，控制湿度的范围在80％左右，温度控制在23-28℃，当幼苗缓苗后适当降低湿度，并逐步过渡，最后得到苹果成品苗。
本发明对苹果外植体采用环切处理，使苹果在诱导培养过程中的萌发倍数提高了2-3倍，对诱导培养基进行的优化处理，减少褐化的产生，采用重复接种的方式，进一步减少了褐化的出现，因而提高的幼苗的成活率。
作为优选，所述的步骤a中升汞对外植体消毒，其时间为7-8min。
作为优选，所述的步骤a中在放大镜或者低倍显微镜下进行环切处理。
作为优选，所述的步骤b中培养基中活性炭0.3-0.5g/l，吐温20：0.5‰-0.8‰。
作为优选，所述的步骤e中对湿度的控制采用电磁阀定时操作。
本发明对苹果外植体采用环切处理，使苹果在诱导培养过程中的萌发倍数提高了2-3倍，对诱导培养基进行的优化处理，减少褐化的产生，采用重复接种的方式，进一步减少了褐化的出现，因而提高的幼苗的成活率。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
实施例1：本例的一种苹果组培繁育的方法，其步骤为：
a.外植体的选取与消毒：选择生长健壮的无病虫害植株，切取嫩芽，用毛刷清理表面，随后流水下冲洗，在超净工作台上用酒精进行消毒，然后用无菌水冲洗2-3次，转入氯化汞溶液中进行消毒，再用无菌水冲洗3-4次，随后在放大镜下将嫩芽环切至其大小的1/3，后备用。
b.诱导嫩芽萌发：在超净工作台中将上一步得到的嫩芽切除多余部分，接种到诱导嫩芽萌发的培养基中，培养基组分为：ms基本培养基+6-ba
3mg/l+iba0.2mg/l+白糖25g/l+琼脂5g/l+活性炭0.3-0.5g/l，吐温20：0.5‰-0.8‰，ph调至5.8；
过5天后继续接种至以上培养基中，继续培养，以上步骤重复三次，直至不再有褐化产生。
c.增殖培养：将上一步得到的无菌萌发的嫩芽进行转入增殖培养基中继代扩繁，增殖培养基配方组分为：ms基本培养基+6-ba0.8mg/l+iba0.1mg/l+白糖25g/l+琼脂5g/l，ph调至5.8；
d.生根培养：将增殖得到的嫩芽进行分芽，转入生根培养基中生根培养，生根培养基配方组分为：1/2ms基本培养基+iba0.6mg/l+白糖25g/l+琼脂5g/l，ph调至5.8
e.驯化移栽：将上一步得到的8-10cm健壮无菌苗，根长打开瓶盖，覆上湿毛巾在通风处炼苗2-3天，期间注意保持毛巾处于湿润状态，移栽驯化前对苗床和基质进行处理和消毒，基质采用草炭土和珍珠岩，配比范围介于1∶1和2∶1之间，消毒后，苗床的厚度4-6cm；将经过通风炼苗的苹果组培苗，扦插到上述苗床中，扦插完成之后使用电磁阀对湿度进行控制，控制湿度的范围在80％左右，温度控制在25℃，当幼苗缓苗后适当降低湿度，并逐步过渡，最后得到苹果成品苗，提高了成活率，且实施例1的成活率显著优于实施例2，p＜0.05。
实施例2：本例的一种苹果组培繁育的方法，其步骤为：
a.外植体的选取与消毒：选择生长健壮的无病虫害植株，切取嫩芽，用毛刷清理表面，随后流水下冲洗，在超净工作台上用酒精进行消毒，然后用无菌水冲洗2-3次，转入氯化汞溶液中进行消毒，再用无菌水冲洗3-4次，随后在放大镜下将嫩芽环切至其大小的1/3，后备用。
b.诱导嫩芽萌发：在超净工作台中将上一步得到的嫩芽切除多余部分，接种到诱导嫩芽萌发的培养基中，培养基组分为：ms基本培养基+6-ba
4mg/l+iba0.4mg/l+白糖25g/l+琼脂5g/l+活性炭0.3-0.5g/l，吐温20：0.5‰-0.8‰，ph调至5.8；
过5天后继续接种至以上培养基中，继续培养，以上步骤重复三次，直至不再有褐化产生。
c.增殖培养：将上一步得到的无菌萌发的嫩芽进行转入增殖培养基中继代扩繁，增殖培养基配方组分为：ms基本培养基+6-ba0.8mg/l+iba0.1mg/l+白糖25g/l+琼脂5g/l，ph调至5.8；
d.生根培养：将增殖得到的嫩芽进行分芽，转入生根培养基中生根培养，生根培养基配方组分为：1/2ms基本培养基+iba0.6mg/l+白糖25g/l+琼脂5g/l，ph调至5.8
e.驯化移栽：将上一步得到的8-10cm健壮无菌苗，根长打开瓶盖，覆上湿毛巾在通风处炼苗2-3天，期间注意保持毛巾处于湿润状态，移栽驯化前对苗床和基质进行处理和消毒，基质采用草炭土和珍珠岩，配比范围介于1∶1和2∶1之间，消毒后，苗床的厚度4-6cm；将经过通风炼苗的苹果组培苗，扦插到上述苗床中，扦插完成之后使用电磁阀对湿度进行控制，控制湿度的范围在80％左右，温度控制在25℃，当幼苗缓苗后适当降低湿度，并逐步过渡，最后得到苹果成品苗，提高了成活率。
以上所述仅为本发明的具体实施例，但本发明的结构特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。