本发明涉及生物防治领域，具体涉及一种生物防治消减枸杞木虱并提高生产性能的方法。
背景技术：
枸杞在生长各个时期都有病虫害发生，其中木虱是主要病虫害之一。枸杞木虱年生3-4代，以成虫在土块、树干上、枯枝落叶层、树皮或墙缝处越冬，翌春枸杞发芽时开始活动，将卵产在叶背或叶面，黄色，密集如毛，俗称黄疽，6-7月盛发，成、若虫在叶背把口器插入叶片组织内，刺吸汁液，并大量排泄白色粪便，致叶黄枝瘦，树势衰弱，浆果发育受抑，品质下降。若虫比成虫危害严重。
虽然农药能够控制木虱危害，但长期使用会使木虱产生耐药性，导致农药施用剂量加大，枸杞产品中农药残留上升，从而影响枸杞质量。
生物防治手段是有效控制虫害、保障枸杞产品质量的优选，而微生物防治是最有效、最具有可行性的选项。几丁质木虱占体壁干重的35-45％，构成了体壁和围食腔膜的主要结构，对虫体起支撑和保护作用。因此，高产几丁质酶的微生物通过降解几丁质而破坏木虱虫体结构，成为有效的生物防治途径。
枯草芽孢杆菌是公认的食品级安全微生物(generallyregardedassafety,gras)，能够在土壤、植物体表面与内部等自然界环境中广泛定殖，从而成为一种理想的生物防治微生物。本发明采用高产几丁质酶的枯草芽孢杆菌(cicc10339)(以下简称sb)对枸杞木虱进行生物防治，同时，由于sb对复杂基质的降解，还起到了解磷、解钾等作用，通过sb菌剂和sb生物肥并用，有效消减枸杞木虱危害并提高枸杞生产性能。
技术实现要素：
本发明提供了一种生物防治消减枸杞木虱并提高枸杞生产性能的方法，该方法高效、简便、环境友好。
为达到以上目的，本发明采用以下技术方案：通过制备高产几丁质酶的sb菌液和sb菌剂，sb菌液用于制备生物肥，sb菌剂喷施枸杞植株，并且在sb菌液、sb菌剂以及生物肥的制备过程中，充分发挥辅料的增效作用及sb的促生作用，从而有效消减枸杞木虱，并提高枸杞生产性能。
一种生物防治消减枸杞木虱并提高枸杞生产性能的方法，包括以下步骤：
1)枯草芽孢杆菌cicc10339简称sb，将sb进行培养，制成密度109～1010cfu/ml的sb菌液；
2)将玉米粉用生淀粉酶酶解，制备成微孔玉米粉；
3)将步骤1)制备的sb菌液中加入步骤2)制备的微孔玉米粉，振荡包埋，制成微孔玉米粉sb菌液；
4)以糯米粉为壁材，添加茉莉叶粉末和透明质酸，将步骤3)制备的微孔玉米粉sb菌液通过喷雾干燥制成sb菌剂；
5)将秸秆、豆粕、麸皮、草木灰和虾粉各组分搅拌均匀形成堆肥，喷施步骤1)所制备的sb菌液，避雨避阳光直晒，堆肥6d～10d，得到sb生物肥；
6)将步骤4)制备的sb菌剂喷施于枸杞植株表面，将步骤5)制备的sb生物肥施于枸杞植株根部，有效消减枸杞木虱。
以下作为本发明的优选技术方案：
步骤1)中，将sb进行培养，包括：sb出发密度为106～107个/ml，接种至液体培养基中，接种量为2％～4％，36℃～38℃振荡培养22～26hr，至菌液密度为109～1010cfu/ml的sb菌液。接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例，即sb移入的体积与液体培养基的体积之比。
进一步优选，将sb进行培养，包括：sb出发密度为106～107个/ml，接种至液体培养基中，接种量为3％，37℃振荡培养24hr，至菌液密度为109～1010cfu/ml的sb菌液。
将sb进行培养时，所述的液体培养基，以1l计，包括以下组分：
调节ph＝6.5～7.5，121℃灭菌20min。
进一步优选，将sb进行培养时，所述的液体培养基，以1l计，包括以下组分：
调节ph＝7.0，121℃灭菌20min。
步骤1)中，枯草芽孢杆菌cicc10339采用市售产品，可向中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)购买，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼；菌种保持编号为cicc10339。
步骤2)中，将玉米粉用生淀粉酶酶解，制备成微孔玉米粉，包括：玉米粉加水搅拌调成玉米乳，加入由α-淀粉酶(ec.3.2.1.1)和糖化酶(ec.3.2.1.3)组成的生淀粉酶，振荡培养，玉米粉颗粒中的淀粉被部分水解形成孔洞，离心烘干后成为微孔玉米粉。
所述的玉米粉的质量与水的质量为50：40～60。进一步优选，玉米乳浓度为50％，即所述的玉米粉的质量与水的质量为50：50。
α-淀粉酶加入到玉米乳中的酶用量为5u/l，糖化酶加入到玉米乳中的酶用量为500u/l。α-淀粉酶和糖化酶采用现有技术，符合食品安全国家标准-食品添加剂-食品工业用酶(gb1886.174-2016)。酶活力单位u：37℃、ph6.5条件下，1min水解底物释放1μmol产物(以还原糖计)的酶量为1u。
所述的振荡培养的条件为：35℃～39℃振荡培养20h～28h，37℃振荡培养24h。
步骤3)中，所述的sb菌液的体积与微孔玉米粉的重量比为100l：3～10kg。进一步优选，所述的sb菌液的体积与微孔玉米粉的重量比为100l：5kg。
所述的振荡包埋的条件为：18℃～22℃振荡包埋0.5h～2h，进一步优选，20℃振荡包埋1hr。hr和h均是指小时。
步骤4)中，以糯米粉为壁材，添加茉莉叶粉末和透明质酸，将微孔玉米粉sb菌液通过喷雾干燥制成sb菌剂，配方与工艺如下：将有关组分按比例配成浆料后，喷雾干燥制成sb菌剂。
所述的sb菌剂采用以下重量份的组分：
所述的喷雾干燥的条件为：进口温度160℃～180℃，出口温度70℃～90℃。
进一步优选，以糯米粉为壁材，添加茉莉叶粉末和透明质酸，将微孔玉米粉sb菌液通过喷雾干燥制成sb菌剂，配方与工艺如下：将有关组分按比例配成浆料后，制成sb菌剂。
有关组分如下：
所述的喷雾干燥的条件为：进口温度170℃，出口温度80℃。
步骤5)中，sb生物肥制备采用堆肥工艺，步骤5)中，以sb菌液为发酵剂，制成sb生物肥。
所述的堆肥采用如下重量份的组分：
进一步优选，所述的堆肥采用如下重量份的组分：
所述的sb菌液的体积与堆肥的质量之比为0.5l～2l：100kg，所述的sb菌液的体积与堆肥的质量之比为1l：100kg，即喷施量为1％(sb菌液体积/堆肥重量)。
步骤6)中，sb菌剂喷施于枸杞植株表面，包括：
sb菌剂按照重量比1:100～200用水稀释后，喷施枸杞植株表面，喷施量为每株枸杞1000ml，每周喷施一次，连续4周。
所述的sb生物肥按照1～3kg的量施于每株枸杞。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
sb产几丁质酶，强力破坏昆虫体壁和围食膜，对昆虫有显著杀灭作用，是一种绿色生物防治策略。
本发明中，将sb制成菌液，继而制成菌剂和发酵成生物肥，菌剂喷施于枸杞植株，生物肥施于枸杞植株根部，均可以有效消减枸杞木虱，并起到植物促生作用以提高枸杞生产性能。
将sb制成菌液以及sb生物肥制备过程中，发酵底物中均有富含甲壳素即几丁质的虾粉，诱导sb高产几丁质酶。
将sb菌液通过喷雾干燥制成sb菌剂时，先将sb包埋入多孔玉米粉中，有助于提高其在喷雾干燥时的存活率。喷雾干燥以糯米粉为壁材，添加茉莉叶粉末和透明质酸。糯米粉增加菌剂在喷施时的粘着度。透明质酸抑制昆虫消化酶。茉莉叶富含茉莉酸及其甲酯等衍生物，诱导蛋白酶抑制剂蛋白合成，从而抑制昆虫消化能力。
将sb堆肥发酵成生物肥时，堆肥配方为：秸秆、豆粕、麸皮、草木灰、虾粉。草木灰有助于sb高密度发酵。豆粕不仅供氮，而且含胰蛋白酶抑制剂，可以抑制昆虫消化能力。虾粉富含甲壳素即几丁质，诱导sb高产几丁质酶。虾粉还富含磷、钾、氮等肥质。生物肥中的sb还兼具解磷、解钾、生防功效。
综上所述，本发明用产几丁质酶的sb开展绿色生物防治，并且采用了多种综合性的补充手段，例如发酵底物组分虾粉富含几丁质从而诱导sb高产几丁质酶、草木灰有助于sb高密度发酵、将sb包埋入多孔玉米粉中以提高其在喷雾干燥时的存活率、用于制备sb菌剂的组分具有消减害虫的辅助性功效、sb生物肥组分具有植物促生功效、sb菌剂与sb生物肥并用则协同增效，从而有效地消减枸杞木虱并提高枸杞生产性能。
具体实施方式
实施例1
1)产几丁质酶的sb的高密度培养，sb的出发密度为2.75×106个/ml，接种至液体培养基(以1l计，葡萄糖11g，豆粉20g，虾粉1g，余量为水，调节ph＝6.5，121℃灭菌20min)中，接种量为2％，36℃振荡培养22h，菌液密度为3.30×109cfu/ml，得到高密度sb菌液。
2)玉米粉加水搅拌调成玉米乳，玉米乳浓度为50％，加入由α-淀粉酶(ec.3.2.1.1)和糖化酶(ec.3.2.1.3)组成的生淀粉酶(酶用量分别为5u/l和500u/l)，37℃振荡培养24hr，玉米粉颗粒中的淀粉被部分水解形成孔洞，离心后120℃烘干，成为微孔玉米粉。
3)在sb菌液中，添加微孔玉米粉至浓度为5％(w/v)(即sb菌液的体积与微孔玉米粉的重量比为100l：5kg)，20℃振荡包埋1hr，成为微孔玉米粉sb菌液。
4)以糯米粉为壁材，添加茉莉叶粉末和透明质酸，将微孔玉米粉sb菌液通过喷雾干燥制成sb菌剂。将有关组分(微孔玉米粉sb菌液10份，糯米粉1份，茉莉叶粉末0.1份，透明质酸0.1份)配成浆料后，喷雾干燥(进口温度170℃，出口温度80℃)制成sb菌剂。
5)堆肥制备sb生物肥：将堆肥各组分(秸秆50份，豆粕20份，麸皮18份，草木灰10份，虾粉2份)搅拌均匀，喷施所制备的sb菌液，喷施量为1％(sb菌液体积l/堆肥重量kg)，避雨避阳光直晒，堆肥6d，即得到sb生物肥。
6)sb菌剂按照重量比1:100用水稀释后，喷施枸杞植株表面，喷施量(以菌剂重量计)为每株枸杞1000ml，每周喷施一次，连续4周。
7)sb生物肥按照1kg的量施于每株枸杞。
实施例2
1)产几丁质酶的sb的高密度培养，sb的出发密度为3.14×106个/ml，接种至液体培养基(以1l计，葡萄糖17g，豆粉30g，虾粉3g，余量为水，调节ph＝7.5，121℃灭菌20min)中，接种量为4％，38℃振荡培养26h，菌液密度为6.58×109cfu/ml，得到高密度sb菌液。
2)玉米粉加水搅拌调成玉米乳，玉米乳浓度为50％，加入由α-淀粉酶(ec.3.2.1.1)和糖化酶(ec.3.2.1.3)组成的生淀粉酶(酶用量分别为5u/l和500u/l)，37℃振荡培养24hr，玉米粉颗粒中的淀粉被部分水解形成孔洞，离心后120℃烘干，成为微孔玉米粉。
3)在sb菌液中添加微孔玉米粉至浓度为5％(w/v)，20℃振荡包埋1hr，成为微孔玉米粉sb菌液。
4)以糯米粉为壁材，添加茉莉叶粉末和透明质酸，将微孔玉米粉sb菌液通过喷雾干燥制成sb菌剂。将有关组分(微孔玉米粉sb菌液10份，糯米粉1份，茉莉叶粉末0.1份，透明质酸0.1份)配成浆料后，喷雾干燥(进口温度170℃，出口温度80℃)制成sb菌剂。
5)堆肥制备sb生物肥：将堆肥各组分(秸秆50份，豆粕20份，麸皮18份，草木灰10份，虾粉2份)搅拌均匀，喷施所制备的sb菌液，喷施量为1％(sb菌液体积/堆肥重量)，避雨避阳光直晒，堆肥10d，即得到sb生物肥。
6)sb菌剂按照重量比1:200用水稀释后，喷施枸杞植株表面，喷施量(以菌剂重量计)为每株枸杞1000ml，每周喷施一次，连续4周。
7)sb生物肥按照3kg的量施于每株枸杞。
实施例3
1)产几丁质酶的sb的高密度培养，sb的出发密度为2.18×106个/ml，接种至液体培养基(以1l计，葡萄糖14g，豆粉25g，虾粉2g，余量为水，调节ph＝7.0，121℃灭菌20min)中，接种量为3％，37℃振荡培养24h，菌液密度为6.32×109cfu/ml，得到高密度sb菌液。
2)玉米粉加水搅拌调成玉米乳，玉米乳浓度为50％，加入由α-淀粉酶(ec.3.2.1.1)和糖化酶(ec.3.2.1.3)组成的生淀粉酶(酶用量分别为5u/l和500u/l)，37℃振荡培养24hr，玉米粉颗粒中的淀粉被部分水解形成孔洞，离心后120℃烘干，成为微孔玉米粉。
3)在sb菌液中添加微孔玉米粉至浓度为5％(w/v)，20℃振荡包埋1hr，成为微孔玉米粉sb菌液。
4)以糯米粉为壁材，添加茉莉叶粉末和透明质酸，将微孔玉米粉sb菌液通过喷雾干燥制成sb菌剂。将有关组分(微孔玉米粉sb菌液10份，糯米粉1份，茉莉叶粉末0.1份，透明质酸0.1份)配成浆料后，喷雾干燥(进口温度170℃，出口温度80℃)制成sb菌剂。
5)堆肥制备sb生物肥：将堆肥各组分(秸秆50份，豆粕20份，麸皮18份，草木灰10份，虾粉2份)搅拌均匀，喷施所制备的sb菌液，喷施量为1％(sb菌液体积/堆肥重量)，避雨避阳光直晒，堆肥8d，即得到sb生物肥。
6)sb菌剂按照重量比1:150用水稀释后，喷施枸杞植株表面，喷施量(以菌剂重量计)为每株枸杞1000ml，每周喷施一次，连续4周。
7)sb生物肥按照2kg的量施于每株枸杞。
对照例1
1)玉米粉加水搅拌调成玉米乳，玉米乳浓度为50％，加入由α-淀粉酶(ec.3.2.1.1)和糖化酶(ec.3.2.1.3)组成的生淀粉酶(酶用量分别为5u/l和500u/l)，37℃振荡培养24hr，玉米粉颗粒中的淀粉被部分水解形成孔洞，离心后120℃烘干，成为微孔玉米粉。
2)将有关组分(微孔玉米粉10份，糯米粉1份，茉莉叶粉末0.1份，透明质酸0.1份，水20份)配成浆料后，喷雾干燥(进口温度170℃，出口温度80℃)制成对照剂-i。
3)非sb生物肥制备采用堆肥工艺：将堆肥各组分(秸秆50份，豆粕20份，麸皮18份，草木灰10份，虾粉2份)搅拌均匀，避雨避阳光直晒，堆肥8d，即得到非sb生物肥。
4)对照剂-i按照重量比1:150用水稀释后，喷施枸杞植株表面，喷施量(以菌剂重量计)为每株枸杞1000ml，每周喷施一次，连续4周。
5)非sb生物肥按照2kg的量施于每株枸杞。
对照例2
1)玉米粉加水搅拌调成玉米乳，玉米乳浓度为50％，加入由α-淀粉酶(ec.3.2.1.1)和糖化酶(ec.3.2.1.3)组成的生淀粉酶(酶用量分别为5u/l和500u/l)，37℃振荡培养24hr，玉米粉颗粒中的淀粉被部分水解形成孔洞，离心后120℃烘干，成为微孔玉米粉。
2)将有关组分(微孔玉米粉10份，水20份)配成浆料后，喷雾干燥(进口温度170℃，出口温度80℃)制成对照剂-ii。
3)非sb生物肥制备采用堆肥工艺：将堆肥各组分(秸秆50份，豆粕20份，麸皮18份，草木灰10份，虾粉2份)搅拌均匀，避雨避阳光直晒，堆肥8d，即得到非sb生物肥。
4)对照剂-ii按照重量比1:150用水稀释后，喷施枸杞植株表面，喷施量(以菌剂重量计)为每株枸杞1000ml，每周喷施一次，连续4周。
5)非sb生物肥按照2kg的量施于每株枸杞。
实施例与对照例结果对比
如表1所示，实施例菌液中具有几丁质酶高活力，菌剂中具有sb高密度，所制备的sb生物肥中也具有几丁质酶高活力和sb高密度，而对照例的菌剂及所制备的生物肥中均基本无sb和几丁质酶活力，显示高密度sb与高几丁质酶活力之间密切相关。实施例的枸杞木虱虫情明显低于对照例，而枸杞生产性能单株产量明显高于对照例，说明富含sb的菌剂和生物肥具有消减枸杞木虱并提高枸杞生产性能的功效。
对照例1的枸杞木虱虫情明显低于对照例2，而枸杞生产性能单株产量明显高于对照例2，说明虽然菌剂和生物肥中无sb，但菌剂中的透明质酸和茉莉叶粉末所含的茉莉酸对消减枸杞木虱并提高枸杞生产性能仍有一定作用，前者抑制昆虫消化酶，后者诱导蛋白酶抑制剂蛋白合成，从而抑制昆虫消化能力。
几丁质酶活力测定：参照“吴志刚.几丁质/壳聚糖酶产生菌的分离及发酵条件、酶学性质研究[d].杭州:浙江大学,2003.”进行。取5mlsb菌液，5000rpm离心10min；取0.5ml上清液，加入1mlmcllvaine缓冲液、0.5ml3％胶体几丁质，37℃水浴30min，然后沸水浴10min，取1ml，5000rpm离心5min，加0.5mldns试剂终止反应；沸水浴5min后立刻冷却，加入4ml去离子水后，测od540nm值；以n-乙酰葡萄糖含量为横坐标，od540nm值为纵坐标，绘制标准曲线，空白管作零点。在37℃、ph7.0条件下，每分钟产生相当于lμmoln-乙酰氨基葡萄糖还原糖所需的酶量定义为1个酶活单位(u)。
sb密度测定：按照“gb/t26428-2010饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测”进行。
枸杞木虱虫情评价：木虱若虫的危害超过成虫，而且成虫频繁迁飞，难以计数，故木虱虫情通过若虫计数进行评价。在枸杞林中，每个实施例或对照例设8个小区(每小区4株枸杞植株)，并假设空白对照8个小区，共48个小区。每株枸杞植株按东、南、西、北、中5个方位随机调查5个枝条，分别于试验前和试验后3d记录每枝木虱若虫量。根据以下公式评价虫情：
防治效果＝(1-ck0×pt1/ck1×pt0)×100％
ck0：空白对照区试验前活虫数。
ck1：空白对照区试验后活虫数。
pt0：实施例或对照例试验前活虫数。
pt1：实施例或对照例试验后活虫数。
枸杞单株产量测定：在枸杞林中，每个实施例或对照例设8个小区(每小区4株枸杞植株)，鲜果采摘后，每个小区分别称重。
每个实施例或对照例的枸杞木虱虫情和单株产量的检测样本数均为8。
表1实施例与对照例所制备菌液、菌剂、生物肥及作用效果对比