本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种快速创制无融合生殖亚麻种子的方法。
背景技术：
近50年来，全球主要农作物增产潜力明显发挥于杂种优势的充分利用，无融合生殖具有固定杂种优势、加速育种进程、积累优良基因的优势，因此可利用无融合生殖快速固定作物杂种优势、达到提质增产增效良好效果，在农业生产及遗传育种上将具有重要的意义和潜力(吴曼等，2010)。无融合生殖由于其具有固定杂种优势、加速育种进程、积累优良基因的优势,因此在农业生产及遗传育种上具有重要的意义和潜力[吴曼等，2010]。尽管目前已在被子植物52个科的400多种植物中发现了无融合生殖植物，但作物中普遍缺乏无融合生殖特性[郝建华等，2009]。自然界中植物无融合生殖常伴随着有性生殖发生，在一定条件下，即使专性无融合生殖后代中也偶尔出现有性生殖后代[nogler，1984]，兼性无融合生殖体的有性胚与无性胚的比率也会受到外界环境因素如光周期、温度、无机盐以及营养水平的影响[郝建华等，2009]。开展可以达到人工诱导、调节和控制无融合生殖发生的工作，获得由无融合生殖产生的种子，可以简化育种中长期艰难的选择过程。
亚麻是自花授粉作物，育种周期较长，采用常规杂交方法育成一个品种需10～15年的时间。在亚麻的栽培种(linumusitatissimuml.)内存在极少部分的多胚种质[康庆华，2004；康庆华等，2011]。这种多胚种质一般表现为双胚的发生，并且其中的一个胚通常是通过无融合生殖途径产生，即胚囊的配子体细胞不经受精而发育成胚胎个体，多数为单倍体，少数为纯合二倍体或镶嵌体。目前在已经检测过的材料中还没有发现通过珠被细胞经无性生殖产生的母体体细胞克隆。因此，在亚麻育种上，可利用无融合生殖进行单倍体育种，其产生的非受精胚经筛选后进行表型选择。由于栽培种亚麻(linumusitatissimuml.)内无融合生殖频率极低，为提高无融合生殖率，获得仅由无融合生殖产生的后代对育种十分有利。
在亚麻的栽培种(linumusitatissimuml.)内存在极少部分的多胚种质(康庆华，2004；康庆华等，2011)。多胚是无融合生殖的一个重要标志，但亚麻的多胚种质一般表现为双胚或三胚的发生，一个胚是经受精的有性胚，另一个或两个胚通常是通过无融合生殖途径产生(secorandrussell,1998)，即胚囊的配子体细胞不经受精而发育成胚胎个体，多数为单倍体，少数为纯合二倍体或镶嵌体。目前在已经检测过的亚麻材料中还没有发现通过珠被细胞经无性生殖产生的母体体细胞克隆,也就是亚麻的无融合生殖目前已经发现的属于雌配子体参与的，可以通过对其产生的非受精胚经选择培育后获得种子，对其后代可直接进行表型选择，能缩短育种年限，提高育种效率。已有方法证明利用多胚亚麻种质可以获得无融合生殖的种子(康庆华，2014；专利：zl201310355880.x)，但该方法需要采用2.4-d和灭活花粉蒙导去雄花蕾的方法诱发多胚亚麻获得无融合生殖种子(“生长调节剂对亚麻无融合生殖诱导的初步研究”中国麻业科学，康庆华，2013)，方法繁琐，去雄工作繁重，对诱导药剂浓度要求严格，成功率较低。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种创制无融合生殖亚麻种子的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)用具有无融合生殖特性的多胚亚麻种质为父本，与雄性核不育亚麻种质为母本进行杂交，收获杂交果；
2)将所述杂交果的种子进行播种，选取不育株套袋不授粉，所收获的果实中的种子，得到无融合生殖亚麻种子。
上述方法中，步骤2)中，选取不育株为选取所开放的花朵内花药无花粉或开花后无蒴果产生的植株。
上述方法中，所述雄性核不育亚麻种质的不育株为雄性核不育亚麻种质m1401的不育株或其为雄性核不育亚麻种质m1401的雄性不育后代；
所述具有无融合生殖特性的多胚亚麻种质为多胚亚麻种质dh08007(1)。
上述方法中，所述雄性核不育亚麻种质m1401的雄性不育后代按照如下方法制备：先将具有无融合生殖特性的多胚亚麻种质dh08007(1)为父本，与雄性核不育亚麻种质m1401的雄性不育株为母本进行杂交，收获杂交果；再将所述杂交果的种子进行播种，选取不育株和可育株进行授粉，所收获的果实中的种子，得到雄性核不育亚麻种质m1401的雄性不育后代。
雄性核不育亚麻种质在创制无融合生殖亚麻种子中的应用也是本发明保护的范围内。
上述应用中，所述雄性核不育亚麻种质的不育株为雄性核不育亚麻种质m1401的不育株或其为雄性核不育亚麻种质m1401的雄性不育后代；
上述中，雄性核不育亚麻种质m1401的不育株按照如下方法制备：以雄性核不育组合m8711不育株为母本，viking(宋宪友，2004,26(2):53-55，中国麻业“纤维亚麻新品种黑亚15号的选育报告)为父本杂交获得的不育株再为母本，viking再为父本连续26代回交获得的核不育杂交组合。
上述雄性核不育组合m8711是以雄性核不育亚麻品系1745a(宋宪友，2004,26(2):53-55，中国麻业“纤维亚麻新品种黑亚15号的选育报告，”)为母本，以viking为父本的雄性不育的杂交组合。
上述应用中，所述雄性核不育亚麻种质m1401的雄性不育后代按照如下方法制备：先将具有无融合生殖特性的多胚亚麻种质dh08007(1)为父本，与雄性核不育亚麻种质m1401为母本进行杂交，收获杂交果；再将所述杂交果的种子进行播种，选取不育株和可育株进行授粉，所收获的果实中的种子，得到雄性核不育亚麻种质m1401的雄性不育后代。
上述应用为如下1)和2)
1)用具有无融合生殖特性的多胚亚麻种质为父本，与雄性核不育亚麻种质的不育株为母本进行杂交，收获杂交果；
2)将所述杂交果的种子进行播种，选取不育株套袋不授粉，所收获的果实中的种子，得到无融合生殖亚麻种子。
本发明快速获得无融合生殖种子方法的方法为采用具有无融合生殖特性的多胚亚麻种质和雄性核不育种质为试验材料，筛选不育株配制杂交组合，观察鉴定杂交果结籽情况，并进行不育株花蕾套袋不经授粉处理可否自行结籽的现象的观察记载，如果在雄性不育株上有部分蒴果可以自行结籽，初步鉴定为是由无融合生殖(孤雌生殖)而产生的亚麻种子。通过本发明的方法可以简化获得无融合生殖种子方法中的去雄和激素诱导及失活花粉刺激等工作，提高获得无融合生殖亚麻种子的工作效率和准确性。因此，本发明在利用多胚亚麻种质的基础上，采用导入雄性核不育基因的方法，可以简化操作程序，快速准确获得无融合生殖的亚麻种子。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
雄性核不育亚麻种质2016kdz188来自雄性核不育组合mh1503的雄性核不育植株，具体按照如下方法制备：
以m1401不育株为母本，以多胚亚麻材料dh08007(1)(马廷芬等，中国麻业科学，2014,36(5)：234-238，多胚亚麻利用获得的品系评价及其多胚性分析)为父本的杂交组合材料。
上述m1401不育株按照如下方法制备：以雄性核不育组合m8711不育株为母本，viking(宋宪友，2004,26(2):53-55，中国麻业“纤维亚麻新品种黑亚15号的选育报告)为父本杂交获得的不育株再为母本，viking再为父本连续26代回交获得的核不育杂交组合。
上述雄性核不育组合m8711是以雄性核不育亚麻品系1745a(宋宪友，2004,26(2):53-55，中国麻业“纤维亚麻新品种黑亚15号的选育报告，”)为母本，以viking(维金)为父本的雄性不育的杂交组合。
亚麻2016kdz188可育株来自雄性核不育组合mh1503的可育植株，mh1503来源同上。
m1501为雄性核不育亚麻种质m1401的不育株和viking的杂交后代，viking不具有多胚特性，m1501仅为雄性核不育种质。
多胚亚麻种质h2010050是以2008dh004(“多胚亚麻dh种质筛选与评价”康庆华，2014，36(6):265-269，中国麻业科学)为母本，以h09052(“多胚种质的研究与利用”康庆华等，2011,33(4):179-181，中国麻业科学)为父本的杂交组合后代材料，已经鉴定具有多胚特性；
多胚亚麻种质h2010010是以2008dh007(1)为母本，以new父本(“多胚亚麻dh种质筛选与评价”康庆华，2014，36(6):265-269，中国麻业科学)杂交后代的材料，已经鉴定具有多胚特性。
实施例1、利用多胚资源和核不育材料创制无融合生殖亚麻种子的方法
1、获得杂交果的m0代种子
2015年7月雄性核不育亚麻种质m1401不育株作为母本，多胚亚麻种质dh08007(1)作为父本，杂交授粉，获得多胚雄性核不育杂交组合m1503；于2016年4月将m1503的种子种植田间，记做2016kdz188，该材料花期观察发现6株不育株(无花粉或花药呈白色干瘪状态)，可育株种子当年发芽检测多胚率达0.1％。所得到的雄性核不育亚麻种质2016kdz188具备多胚和不育双重基因特性。
2016年6月在雄性核不育亚麻种质2016kdz188始花期，开始观察，对所有雄性不育株进行拴牌，套袋，7月，收种子，命名为m0代种子。
2、播种收获无融合生殖来源亚麻种子
1)m1代植株的获得
2017年4月将上述1获得的所有m0代种子播种，得到m1代植株；
根据是否有花粉判断m1代植株的育性，若2016kdz188的m1代植株上所开放的花朵内的花药上有花粉散出，则为可育植株；若无花粉或花药呈白色干瘪状态，则为不育植株。
2017年2016kdz188的m1代植株共17株，其中7株2016kdz188的m1代雄性不育植株，10株2016kdz188的m1代可育株。
2)无融合生殖亚麻种子和新的多胚雄性核不育杂交种子的获得
2017年7月在母本2016kdz188的m1代亚麻植株的始花期，开始观察，对所有雄性不育株进行拴牌，套袋，每天早上6点到7点选下述表1不同父本花粉分别对雄性核不育亚麻植株的花进行授粉处理，然后再套袋；
无融合生殖鉴定组仅套袋不进行授粉处理；
对照选雄性核不育杂交组合m1501(非多胚种质做父本)的不育株始花期套袋不授粉；
以2016kdz188的m1代可育株为参考对照，不套袋不进行杂交授粉处理。
7月，收获种子；具体如下：
(1)无融合生殖亚麻种子
2017年7月，选1株已套袋的2016kdz188的m1代雄性不育株2016kdz188-1上的花朵不进行涂抹授粉处理，得到的杂交果及种子，命名为多胚雄性核不育mh2017023的m0代种子，该种子即为无融合生殖产生的亚麻种子，若无种子产生说明不育植株2016kdz188-1不具备无融合生殖特性。
2017年7月，选1株已套袋的2016kdz188的m1代雄性不育株2016kdz188-2上的花朵不进行涂抹花粉处理，得到的杂交果及种子，命名为多胚雄性核不育mh2017024的m0代种子，该种子即为无融合生殖产生的亚麻种子，若无种子产生说明不育植株2016kdz188-2不具备无融合生殖特性。
(2)新的多胚雄性核不育杂交种子
2017年7月，选1株已套袋的2016kdz188的m1代雄性不育株上当天开放的花朵(无花粉或花粉败育)为母本，取多胚亚麻种质2016kdz188可育株-1花朵上的花粉对母本花朵的柱头进行涂抹授粉处理，得到杂交果及种子，命名为多胚雄性核不育mh2017011的m0代种子，其父本为多胚亚麻种质2016kdz188可育株-1。
2017年7月，选1株已套袋的2016kdz188的m1代雄性不育株上当天开放的花朵(无花粉或花粉败育)为母本，采摘多胚亚麻种质2016kdz188可育株-2的花朵取花粉对母本花朵的柱头进行涂抹授粉处理，得到杂交果及种子，命名为多胚雄性核不育组合mh2017012的m0代种子，其父本为多胚亚麻种质2016kdz188可育株-2。
2017年7月，选1株已套袋的2016kdz188的m1代雄性不育株上当天开放的花朵(无花粉或花粉败育)为母本，采摘多胚亚麻种质2016kdz188可育株-3的花朵取花粉对母本花朵的柱头进行涂抹授粉处理，得到杂交果及种子，命名为多胚雄性核不育mh2017020的m0代种子，其父本为多胚亚麻种质2016kdz188可育株-3。
2017年7月，选1株已套袋的2016kdz188的m1代雄性不育株上当天开放的花朵(无花粉或花粉败育)为母本，采摘多胚亚麻种质h2010050的花朵取花粉对母本花朵的柱头进行涂抹授粉处理，得到杂交果及种子，命名为多胚雄性核不育mh2017021的m0代种子，其父本为多胚亚麻种质h2010050。
2017年7月，选1株已套袋的2016kdz188的m1代雄性不育株上当天开放的花朵(无花粉或花粉败育)为母本，采摘多胚亚麻种质h2010010的花朵取花粉对母本花朵的柱头进行涂抹授粉处理，所获得的杂交果及种子，命名为多胚雄性核不育mh2017022的m0代种子，其父本为多胚亚麻种质h2010010。
2017年7月，选m1501的2株不育株在始花期分别套袋，不授粉，观察蒴果膨大和结籽情况。
结果如表1所示:
在未授花粉的2016kdz188的m1代雄性不育株2016kdz188-1上有2个成活杂交果，每个杂交果内8粒种子，种皮黄色籽粒饱满成熟。
在未授花粉的2016kdz188的m1代雄性不育株2016kdz188-2上有1个成活杂交果，杂交果内3粒种子，种皮黄色籽粒饱满成熟。
在授2016kdz188可育株-1花粉的2016kdz188的m1代雄性不育株上获得4个成活杂交果，每个杂交果内4粒种子，种皮黄色籽粒饱满成熟。
在授2016kdz188可育株-2花粉的2016kdz188的m1代雄性不育株上获得4个成活杂交果，每个杂交果内8粒种子，种皮黄色籽粒饱满成熟。
在授2016kdz188可育株-3花粉的2016kdz188的m1代雄性不育株上获得3个成活杂交果，每个杂交果内8粒种子，种皮黄色籽粒饱满成熟。
在授h2010050花粉的2016kdz188的m1代雄性不育株上获得4个成活杂交果，每个杂交果内8粒种子，种皮黄色籽粒饱满成熟。
在授h2010010花粉的2016kdz188的m1代雄性不育株上获得3个成活杂交果，每个杂交果内8粒种子，种皮黄色籽粒饱满成熟。
以上对2016kdz188的m1代雄性不育株上的花朵授粉，目的是为了创制新的多胚雄性不育组合，以快速大量获得无融合生殖的亚麻种子。
对照m1501为未与多胚种质杂交的雄性不育组合，2株不育植株套袋未授粉，无膨大蒴果，无种子产生。
参考对照2016kdz188的m1代可育株即mh1503上皆有10个以上成活蒴果，每个蒴果内8粒种子，种皮褐色籽粒饱满成熟。
表1为2017年利用多胚诱导不育株产生无融合生殖种子的试验
上述表1中可以看出，多胚不育杂交组合2016kdz188的m1代不育株套袋经授粉处理，可产生雄性核不育的亚麻种子(种皮黄色，区别于对照组可育植株上的褐色种皮的种子)；2016kdz188的m1代多胚不育株套袋不授粉处理，产生种子；而雄性核不育组合m1501的不育株套袋不授粉，不能结籽，说明多胚不育组合2016kdz188的m1代套袋不授粉的不育株所结的种子源于无融合生殖(孤雌生殖)。本试验所获得的mh2017023的2个蒴果共8粒种子和mh2017024的1个蒴果3粒种子为采用本方法获得的无融合生殖亚麻种子。