本发明涉及一种白芨组培苗菌根化的方法，属于种苗培育技术领域。
背景技术：
在自然条件下，兰科植物必须与菌根真菌建立共生关系，形成菌根后，才能完成其正常的生长发育，菌根的形成对兰花来说是必不可少的，菌根真菌向兰科植物提供碳水化合物及其它可能的次生代谢产物，如维生素和激素等物质，因此，从某种意义上讲兰科植物是寄生在真菌上的。白芨为多年生草本兰科植物，其根系结构为典型的菌根结构，其种子无胚乳，在自然条件下需要与之相适应的真菌共生才能萌发，由于组培快繁技术的兴起，解决了种子萌发的难题，现白芨种苗组培快繁已成为其栽培用苗的主要途径之一，但组培苗由于其根系没有相应的菌根真菌与之共生，致使其在驯化移栽过程中，种苗成活率、发芽率低，抗逆性差，因此，一种能够为白芨大田栽培提供优质驯化苗的白芨组培苗的组培方法的开发很有必要。
技术实现要素：
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种白芨组培苗菌根化的方法，该方法通过在白芨组培苗移栽前，利用一株白芨菌根真菌制备成液体菌剂，施用于白芨组培苗培养基中，使白芨组培苗菌根化，白芨组培苗菌根化再进行移栽驯化，菌根化的组培苗在驯化移栽过程中，具有种苗成活率高、发芽率高和抗逆性好的优点。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术手段为：
一种白芨组培苗菌根化的方法，包括如下步骤：
步骤1，利用白芨的菌根真菌jsnlbj-001制备液体菌剂；
步骤2，在白芨组培苗移栽前的练苗阶段往白芨组培苗的培养基中加入适宜浓度的液体菌剂，进行菌根化培养；
步骤3，待组培苗的茎基部长满菌丝并能观察到其根部有菌丝附着后，将白芨菌根化组培苗从组培瓶里取出，并去除其根部和茎基部的培养基，然后将白芨菌根化组培苗移栽到白芨育苗基质中进行驯化。
其中，步骤1中，菌根真菌为淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物，保藏编号为cgmccno：13690。
其中，步骤1中，液体菌剂的制作方法为：将菌根真菌jsnlbj-001菌株自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接种于pda培养皿中，于24～30℃恒温培养5～10d，然后在菌落边缘打孔成菌饼，将菌饼接入液体培养基中，液体震荡培养7～10d，培养温度26～28℃，转速120～160rpm；待球状菌丝长满液体培养基后，将其放入搅拌机中打碎成悬浮状的液体菌剂。
其中，本发明方法中用于菌根化的白芨组培苗，为可出组培瓶移栽的成品组培苗。
其中，所述液体培养基的组成为：燕麦20～30g/l+葡萄糖25～30g/l+二水氯化钙2.5g/l+马铃薯80～120g/l，培养基ph值为5.8～6.5；其中，马铃薯为其浸出液。液体培养基配制后分装到真菌用三角瓶或培养瓶中，分装量为80～100ml/瓶，然后放入高压灭菌锅内高压灭菌，冷却后接入菌饼。
其中，步骤2中，所述液体菌剂添加量为10～15ml/瓶。
其中，步骤2中，液体菌剂接入白芨组培苗后，在温室大棚内敞开瓶盖放置培养10～15d，待菌丝长满组培苗茎基部，观察到白芨组培苗根部有菌丝附着后，进行出苗移栽。
其中，步骤3中，白芨育苗基质组成为：珍珠岩20～30份，稻壳30～40份，泥炭土100～150份，腐殖土50～80份，磷酸钙15～30份；将上述基质组分按配方体积比混合后，进行白芨菌根化组培苗的移栽。
其中，步骤2中，在白芨组培苗移出组培瓶前，将组培苗从培养室移至温室大棚中，组培苗移至温室大棚中时，需在温室大棚上方放置遮阴网进行遮阴，遮阴率为50～80％，避免光照太强灼伤组培苗，大棚内温度控制在25～30℃。
有益效果：本发明方法能够为白芨大田栽培提供优质的驯化苗，该方法通过在白芨组培苗移栽前，加入白芨菌根真菌制得的液体菌剂使其组培苗根系菌根化，菌根化的组培苗移栽后，成活率可达99％以上，生长量大，新芽分蘖多且长势旺盛，抗逆性强。与不接菌根真菌的白芨组培苗相比，白芨组培苗菌根化后其发芽率、成活率和抗逆性都有显著提高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。
实施例1
菌株的分离与鉴定
菌株jsnlbj-001是2015年5月在江苏省句容市江苏茅山道地药材有限公司白芨种植区内生长状况较好的植株上分离获得的。
分离方法为：取野生新鲜的白芨根，将根段表面的基质土壤用流动的自来水冲洗干净后，在超净工作台上用滤纸吸干表面的水分。再用灭菌的去离子水冲洗干净，然后分次浸入质量浓度为75％酒精45s，质量浓度为2％次氯酸钠溶液浸泡消毒5min。消毒完成后，用灭菌的去离子水冲洗5～6次以彻底去除次氯酸钠，再用灭菌的滤纸吸干根表面的残留水滴，然后用灭菌的解剖刀将根段切成0.5mm左右的组织段。将组织段转移到加有硫酸链霉素(100μg/ml)的pda培养基平板上，每个平板上接种5个组织段，每种培养基接15个平板。将分离获得的内生真菌进行回接试验，得到本发明所用菌株，将该菌株定名为jsnlbj-001，该菌株能明显促进白芨幼苗的生长，提高幼苗的成活率。
菌株jsnlbj-001的菌落特征如下：
形态学特征观察表明：在pda培养基上培养7d，菌落直径3.5cm，生长较慢。菌落墨绿色，毛毡状，革质，边缘整齐，有1mm左右透明外圈。
扩增its区全序列并进行测序，pcr扩增得到的16srna全序列如下所示。
pcr扩增得到的全序列(seqidno.1)：
ctaagaaagttgggcgttttacggcgtgaccgcctccgcgctccggtgcgaggtgtgtgctactacgcaggggaggctgcggcggggtcgccactgcatttcgggggcggctggtgtgccgtcccccaacaccgaggcccccgggggggctcgagggttgaaatgacgctcgaacaggcatgcccgccagaatgctggcgggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttttgattcatttgtttttgcttgtgcaactcagagaagaaattccgcccgctgggcgtaatgcaagagagtttggggtccctgcggcgggcgcctgggtccggcgccggcgcgggggcaggcggccggggcgttcccgccgaggcaactgaggtaaggttcacagtgggtttgggagttgtataactcggtaatgatccctccgcaggtcacccctacggaa
经形态学及分子生物学鉴定表明，该菌株为淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)，其分类地位为子囊菌门粪壳菌纲肉座菌目蛇形虫草科紫孢属，菌株号为jsnlbj-001，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno：13690，保藏日期为2017年3月10日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
本发明方法中所使用的白芨菌根真菌jsnlbj-001已在公开号为cn107629966a的专利中有详细记载。
实施例2
本发明白芨组培苗菌根化的方法，包括如下步骤：
步骤1，将淡紫紫孢菌jsnlbj-001菌株自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接种于pda培养皿中，于28℃恒温培养6～8d，然后在菌落边缘打孔成菌饼，备用；按照以下组分配制液体培养基：燕麦30g/l+葡萄糖30g/l+二水氯化钙2.5g/l+马铃薯120g/l，培养基ph值6.0；其中，马铃薯使用其浸出液；液体培养基配制后分装到真菌用三角瓶或者培养瓶中，分装量为100ml/瓶，然后放入高压灭菌锅内高压灭菌，冷却后接入菌饼；灭菌后的液体培养基接入菌根真菌菌饼后放入恒温震荡培养箱内培养10d，培养条件为：培养温度28℃，转速130rpm；待球状菌丝长满液体培养基后，将其放入搅拌机中打碎成悬浮状的液体菌剂；
步骤2，在白芨组培苗移出组培瓶前，将组培苗从培养室移至遮阴率为60％的温室大棚中并揭开瓶盖培养，将步骤1制得的液体菌剂加入到组培苗中，进行白芨组培苗菌根化培养，液体菌剂添加量为15ml/瓶；
步骤3，液体菌剂接入白芨组培苗后，在温室大棚内敞开瓶盖放置培养15d，待菌丝长满组培苗茎基部，并能观察到白芨组培苗根部有菌丝附着后，将白芨菌根化组培苗从组培瓶里取出，并去除其根部和茎基部的培养基，进行出苗移栽，即将白芨菌根化组培苗移栽到白芨育苗基质中进行驯化；按照以下组份配制白芨育苗基质：珍珠岩30份，稻壳40份，泥炭土100份，腐殖土80份，磷酸钙30份；将上述基质组份按体积比进行混合后即得白芨育苗基质。
实施例3
本发明白芨组培苗菌根化的方法，包括如下步骤：
步骤1，将淡紫紫孢菌jsnlbj-001菌株自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接种于pda培养皿中，于28℃恒温培养6～8d，然后在菌落边缘打孔成菌饼，备用；按照以下组分配制液体培养基：燕麦20g/l+葡萄糖15g/l+二水氯化钙2.5g/l+马铃薯80g/l，培养基ph值6.0；其中，马铃薯使用其浸出液；液体培养基配制后分装到真菌用三角瓶或者培养瓶中，分装量为100ml/瓶，然后放入高压灭菌锅内高压灭菌，冷却后接入菌饼；灭菌后的液体培养基接入菌根真菌菌饼后放入恒温震荡培养箱内培养10d，培养条件为：培养温度28℃，转速130rpm：待球状菌丝长满液体培养基后，将其放入搅拌机中打碎成悬浮状的液体菌剂；
步骤2，在白芨组培苗移出组培瓶前，将组培苗从培养室移至遮阴率为60％的温室大棚中并揭开瓶盖培养，将步骤1制得的液体菌剂加入到组培苗中，进行白芨组培苗菌根化培养，液体菌剂添加量为10ml/瓶；
步骤3，液体菌剂接入白芨组培苗后，在温室大棚内敞开瓶盖放置培养15d，待菌丝长满组培苗茎基部，并能观察到白芨组培苗根部有菌丝附着后，将白芨菌根化组培苗从组培瓶里取出，并去除其根部和茎基部的培养基，进行出苗移栽，即将白芨菌根化组培苗移栽到白芨育苗基质中进行驯化；按照以下组份配制白芨育苗基质：珍珠岩30份，稻壳40份，泥炭土100份，腐殖土80份，磷酸钙30份；将上述基质组份按体积比进行混合后即得白芨育苗基质。
对比实施例1
(1)在白芨组培苗出瓶前，将组培苗从培养室移至遮阴率为60％的温室大棚中并揭开瓶盖，进行练苗10d；
(2)按照以下组份配制白芨育苗基质：珍珠岩30份，稻壳40份，泥炭土100份，腐殖土80份，磷酸钙30份；将上述基质组份按体积比进行混合后即得白芨育苗基质；
(3)洗净白芨组培苗茎基部和根上的培养基，种植于上述的白芨育苗基质中。
将实施例2～3以及对比实施例1中的白芨组培苗种植于白芨育苗基质中，每个实施例为200株/组，行间距10*10cm，接种于种植的苗中，90d后，观察各实施例培育出的白芨组培苗的成活率、发芽率、株高、球茎大小，如表1所示。
表1
由表1可知，采用本发明方法得到的白芨组培苗能使移栽驯化的成活率、发芽率都大大提高，与不接菌根真菌的白芨组培苗相比，本发明白芨组培苗菌根化后其发芽率、成活率、抗逆性都显著提高。