本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法。
背景技术：
雪莲果（smallanthussonchifolius）中文学名为菊薯，又名雪莲薯、晶薯、地参果等，是一种菊科菊薯属多年生草本植物。其茎杆直立生长，叶片为阔叶心形，对生；花顶生，黄色，形如葵花，蒴果，但不结籽；食用部分为地下块根，形似红薯。雪莲果皮薄汁多，果肉如雪梨，晶莹剔透，香甜脆爽，既可作蔬菜也可作水果食用。雪莲果含有丰富的果糖、葡萄糖、蔗糖、寡聚果糖以及淀粉、菊糖、少量的纤维素、维生素等，其中菊糖和寡聚果糖占其干物质的67%，而菊糖和寡聚果糖不能被人体直接吸收，因此雪莲果属于低热量食品。此外雪莲果还含有20多种人体必需的氨基酸、多酚及镁、钙、锌、铁、钾等微量元素，经常食用可提高人体的免疫力，有强身健体的功效。雪莲果还可以清肝解毒、降血压、降血脂、调理肠胃、养颜美容，对糖尿病、高血压、心脑血管疾病、消化系统疾病等都有不同程度的辅助治疗和预防作用，雪莲果集果、菜、药于一体，是一种新兴的神奇保健植物，在今后必定能创造更高的经济效益，具有更广阔的发展前景。
雪莲果原产于南美洲安第斯山脉，在当地有500多年的栽培历史。我国雪莲果引种栽培始于2002年，目前已在云南、福建、海南、贵州、湖南、湖北、山东等多地栽培成功。雪莲果在生产上常以块根进行无性繁殖，然而连续多代的无性繁殖，容易造成病毒在植物体内积累，患上病毒病，从而造成雪莲果品种退化，进而导致产量和品质下降。而且植物体一旦染病，终生携带，传统的化学农药也无法治愈。近年来雪莲果的栽培面积正快速增加，但果农对病毒病害的发生发展缺乏认知和防治经验，从而存在病毒病害快速传播而后严重暴发的巨大潜在危险，因此保存雪莲果的优质种源，培育雪莲果脱毒种苗已成为我国雪莲果产业可持续发展的重要保证。
由于雪莲果进入我国的时间还不长，关于雪莲果基础研究方面的报道还较少，仅限于营养价值和药用价值分析以及引种扩繁与栽培技术的研究，对雪莲果种质保存和脱毒纯化方面的研究还鲜有报道。随着雪莲果产业日益蓬勃的发展，雪莲果基础性研究的必要性也越来越大，雪莲果优良种质资源的保存技术也越发突显出重要性。目前雪莲果种质资源的保存方法即为生产上的田间栽培，但用此种方法保存种质存在以下局限性：自然环境及病虫害控制较难，易造成种质资源丧失；占地面积多，耗费人力、物力、财力巨大；雪莲果仍然是进行无性繁殖，仍然会因感染病毒而造成种性退化。随着生物技术的发展，利用植物组织培养技术，在人工控制的环境条件下对雪莲果种质资源进行离体保存是能有效解决上述问题的方法。
植物种质离体保存方法按照保存温度可分为常温、低温和超低温保存三类。常温和低温保存适于中短期种质保存，而且在保存过程中都需要继代培养才能延长保存期，因而存在继代引起的体细胞无性系变异的风险。超低温保存技术在一定程度上克服了上述缺点，而且设备要求简单，不需要大量的基本建设投资，在长期保持遗传的稳定性上具有明显的优势，是目前公认的长期而稳定的保存植物种质资源的理想方法。
基于超低温技术的种质保存通常是将植物种质材料保存在-196℃的液氮中，在这种条件下植物的物质代谢、生命活动几乎完全停止，而细胞活力和形态发生的潜能得以保存，采取一定的解冻方法使其恢复常温后，种质材料可以通过组织培养再生成完整植株。当采用植物茎尖作为保存材料时，一方面由于茎尖的分生组织细胞的分化程度较小，在超低温保存后的再生过程中遗传物质相对于其他材料稳定，能够有效保持植物的遗传性状；另一方面茎尖经超低温冻存后，其最顶端结构由于细胞核与细胞质体积比例大，内含物质浓度高，细胞内空泡少且维管组织发育不全，因此能够经受住低温而存活下来，而这部分组织病原物含量较少甚至不含病原物，通过再生培养分裂分化形成脱毒植株。因此将茎尖结合超低温保存技术就能实现种质资源的长期保存和脱毒纯化，是一种极具推广价值的新技术。
目前基于超低温技术的雪莲果种质保存和纯化方法尚未建立，因此加强相关方面的研究，开发出适用于雪莲果的超低温种质保存方法对雪莲果产业发展具有重要的推动价值。
技术实现要素：
本发明填补了雪莲果茎尖超低温保存技术的空白，首次建立了基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化的技术流程，为雪莲果优良种质资源的保存与种质脱毒纯化提供了新途径。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法，其特征在于，该方法的技术方案由以下步骤组成：
s1获得雪莲果无性繁殖系
剪取雪莲果苗的腋芽先用0.1%洗衣粉水浸泡15-20min，接着用自来水冲洗干净，将腋芽剥取至生长点后进行消毒处理，然后接种于附加kt2.0mg/l、iaa0.5mg/l、水解蛋白35mg/l、聚乙烯醇0.2mg/l的ms培养基上诱导出不定芽；将不定芽转接到附加康多酚1.0mg/l、三十烷醇0.3mg/l、柠檬酸钛3.5mg/l的ms培养基上进行继代增殖，每30天继代1次；培养条件均控制为温度23-27℃、光照强度2000-2400lx、光照时间11-13h/d；
s2低温锻炼
选择继代1次又培养10天左右的雪莲果试管苗，置于2-8℃暗处低温锻炼3-4周；
s3渗透包埋
从上述低温锻炼后的试管苗上切取茎尖作为种质保存材料，将茎尖经过渗透包埋处理后，可形成直径约为4mm的包埋珠，每个包埋珠包含1个茎尖；
s4预培养与装载
将上述包埋珠接入预培养基中，置于4℃黑暗条件下培养2-4d；然后在室温下，将经预培养的包埋珠转入附加2.0mol/l甘油和0.4mol/l蔗糖的液体ms培养基中装载处理40-60min；
s5脱水与液氮保存
将装载处理后的包埋珠放入冷冻保护液中，在0℃冰浴条件下脱水60-90min；然后将包埋珠装入10ml冷冻离心管中，并添加2.5ml左右的新鲜冷冻保护液，迅速投入液氮中进行冷冻保存，每个冷冻离心管中放6-10个包埋珠；
s6化冻与洗涤
种质保存期结束后，迅速将冷冻离心管取出并置于36-40℃水浴化冻1-2min，之后在室温下化冻20min，然后从包埋珠中取出茎尖用附加1.1mol/l山梨糖醇的液体ms培养基洗涤10min，再接种至再生培养基上；
s7植株再生
将接种后的茎尖，先在0-4℃条件下暗培养1周，然后在温度23-27℃、光照强度2000-2500lx、光照时间12-14h/d的条件下培养4-5周，获得再生植株。
所述s1中消毒处理的方法为：先用70%酒精表面消毒30s，再用无菌水冲洗2-3次，然后置于加入了数滴吐温20的0.1%升汞中处理10min，再用无菌水冲洗4-5次，滤纸吸干水分。
所述s3中茎尖的要求为长约2-3mm，含有1-3个叶原基。
所述s3中茎尖的渗透包埋方法为：将茎尖悬浮于包埋液①中形成混合物，然后用小滴管将茎尖混合物逐个滴加入包埋液②中，在常温下固定20-40min。
所述s4中预培养基的配方为：1/2ms+丁酰肼0.22~0.30mg/l+天门冬酰胺10~14mg/l+石榴籽粉36~40mg/l+甜菜碱1.3~1.5mg/l+水杨酸8.2~8.8mg/l+油菜素内酯0.01~0.03mg/l+蔗糖0.4~0.6mol/l+丙二醇51~55g/l，ph值为5.6~6.0。
所述s4中冷冻保护液的成分为为：ms（不含琼脂）+35%（w/v）甘油+10%（w/v）乙二醇+5%（w/v）dmso+0.3mol/l蔗糖+海藻糖41~47g/l+左旋肉碱4.4~5.0mg/l+谷胱甘肽30~40mg/l+水溶性碳纳米管0.8~1.0g/l+螺旋藻粉3.5~4.1g/l。
所述s6中再生培养基的成分为：ms+dcpta（增产胺）1.0~1.4mg/l+二苯基脲磺酸钙0.7~0.9mg/l+复肽核酸8~12mg/l+β-胡萝卜素0.7~1.1mg/l+雪莲果汁36~40ml/l+烟酰胺0.3~0.5mg/l+叶黄素0.6~0.8mg/l+硅藻土0.1~0.2g/l，ph值为5.6~6.0。
所述包埋液①的成分为ms+2%（w/v）海藻酸钠+0.4mol/l蔗糖，包埋液②的成分为ms+0.4mol/l蔗糖+0.1mol/lcacl2。
本发明的有益效果为：
1）本发明的种质保存方法与田间栽培保存相比，具有节约资源、便于人工控制、避免病害及自然灾害、减少自然变异和种质退化的优点；与常温和低温种质离体保存方法相比，具有保存时间长、无需特殊设备环境、无需继代、遗传性状稳定的优点，利于推广。
2）与传统的植物超低温保存方法相比，本发明的技术方案中超低温保存茎尖的存活率和再生率更高，化冻后的茎尖在再生培养阶段生长更为迅速，获得的再生的植株生长状况良好。
3）本发明的方法还可以用于种质的脱毒纯化，并且与常规的茎尖脱毒法相比，脱毒率更高，获得脱毒种苗的时间更短，而且对剥取茎尖的技术要求更低。
综上所述，本发明首次建立了基于超低温技术的雪莲果种质保存方法，使雪莲果种质资源得到长期稳定的保存；同时本发明的方法还可以对雪莲果种质资源进行脱毒纯化，从而为生产提供优质脱毒种苗，是一项很有推广价值的雪莲果种质保存与纯化新技术。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一种基于超低温技术的雪莲果种质保存与纯化方法，该方法的技术方案由以下步骤组成：
s1获得雪莲果无性繁殖系
2013年，以湖南祁东高山雪莲果研发基地提供的雪莲果种苗为试验材料，剪取雪莲果苗的腋芽先用0.1%洗衣粉水浸泡15-20min，接着用自来水冲洗干净，将腋芽剥取至生长点后先用70%酒精表面消毒30s，再用无菌水冲洗2-3次，然后置于加入了数滴吐温20的0.1%升汞中处理10min，再用无菌水冲洗4-5次，滤纸吸干水分，然后接种于附加kt2.0mg/l、iaa0.5mg/l、水解蛋白35mg/l、聚乙烯醇0.2mg/l的ms培养基上诱导出不定芽；将不定芽转接到附加康多酚1.0mg/l、三十烷醇0.3mg/l、柠檬酸钛3.5mg/l的ms培养基上进行继代增殖，每30天继代1次；培养条件均控制为温度25℃、光照强度2200lx、光照时间12h/d；
s2低温锻炼
选择继代1次又培养10天左右的雪莲果试管苗，置于2-8℃暗处低温锻炼3-4周；
s3渗透包埋
从上述低温锻炼后的试管苗上切取长约2-3mm，含有1-3个叶原基的茎尖作为种质保存材料；将茎尖悬浮于ms+2%（w/v）海藻酸钠+0.4mol/l蔗糖的包埋液①中形成混合物，然后用小滴管将茎尖混合物逐个滴加入ms+0.1mol/lcacl2的包埋液②中，在常温下固定30min，可形成直径约为4mm的包埋珠，每个包埋珠包含1个茎尖；
s4预培养与装载
将上述包埋珠接入预培养基中（预培养基的配方为：1/2ms+丁酰肼0.26mg/l+天门冬酰胺12mg/l+石榴籽粉38mg/l+甜菜碱1.4mg/l+水杨酸8.5mg/l+油菜素内酯0.02mg/l+蔗糖0.5mol/l+丙二醇53g/l，ph值为5.8），置于4℃黑暗条件下培养2-4d；然后在室温下，将经预培养的包埋珠转入附加2.0mol/l甘油和0.4mol/l蔗糖的液体ms培养基中装载处理50min；
s5脱水与液氮保存
将装载处理后的包埋珠放入冷冻保护液中，冷冻保护液的成分为为：ms（不含琼脂）+35%（w/v）甘油+10%（w/v）乙二醇+5%（w/v）dmso+0.3mol/l蔗糖+海藻糖44g/l+左旋肉碱4.7mg/l+谷胱甘肽35mg/l+水溶性碳纳米管0.9g/l+螺旋藻粉3.8g/l，在0℃冰浴条件下脱水75min；然后将包埋珠装入10ml冷冻离心管中，并添加2.5ml左右的新鲜冷冻保护液，迅速投入液氮中进行冷冻保存，每个冷冻离心管中放6-10个包埋珠；
s6化冻与洗涤
种质保存材料保存3年后，迅速将冷冻离心管取出并置于36-40℃水浴化冻1-2min，之后在室温下化冻20min，然后从包埋珠中取出茎尖用附加1.1mol/l山梨糖醇的液体ms培养基洗涤10min，用ttc法检测茎尖的存活率，再将存活的茎尖接种至再生培养基上（ms+dcpta（增产胺）1.2mg/l+二苯基脲磺酸钙0.8mg/l+复肽核酸10mg/l+β-胡萝卜素0.9mg/l+雪莲果汁38ml/l+烟酰胺0.4mg/l+叶黄素0.7mg/l+硅藻土0.15g/l，ph值为5.8）；
s7植株再生
将接种后的茎尖，先在0-4℃条件下暗培养1周，以茎尖然后在温度25℃、光照强度2300lx、光照时间13h/d的条件下培养5周后统计植株的再生率（再生率=再生成苗的茎尖数/接种茎尖数×100%）。
实施例2
测试本发明的预培养基对雪莲果茎尖超低温保存效果的影响：仅改变实施例1步骤s1中的预培养基（其余2种预培养基是超低温保存中常用的预培养基），其他步骤与实施例1相同，统计茎尖存活率和再生率，结果见下表1。
上述结果表明，使用本发明的预培养基，雪莲果茎尖超低温保存3年后存活率和再生率最高；本发明的预培养基降低了营养成分并添加了丁酰肼能够降低雪莲果茎尖的生长速度；添加的石榴籽粉、甜菜碱、水杨和酸油菜素内酯能够提高茎尖的抗逆性，增强其对低温的忍耐能力；加入高浓度的蔗糖和丙二醇以降低茎尖细胞内自由水含量，从而增强植物的抗冻性，总体提高了茎尖存活率和再生率。
实施例3
测试本发明的冷冻保护液对雪莲果茎尖超低温保存效果的影响：仅改变实施例1步骤s4中的冷冻保护液（其余2种冷冻保护液是超低温保存中常用的保护液），其他步骤与实施例1相同，统计植株再生率，结果见下表2。
上述结果表明，使用本发明的冷冻保护液，雪莲果茎尖超低温保存3年后存活率和再生率最高；本发明的冷冻保护液额外添加了海藻糖、左旋肉碱、谷胱甘肽、螺旋藻粉，有助于保持细胞结构完整性，水溶性碳纳米管能够改变冷冻保护液的性状，减少冻结过程对细胞的机械损伤和溶质损伤，从而综合提高了茎尖存活率和再生率。
实施例4
测试本发明的再生培养基对雪莲果茎尖超低温保存后再生效果的影响：仅改变实施例1步骤s5中的再生培养基（其余2个培养基配方来源于雪莲果组织培养的相关文献），其他步骤与实施例1相同，统计植株再生率，结果见下表3。
上述结果表明，使用本发明的再生培养基，雪莲果茎尖超低温保存3年后再生率最高；本发明的再生培养基添加了高效植物生长调节剂dcpta与二苯基脲磺酸钙以及多种营养物质，能促进细胞快速分裂生长，显著提高叶绿素含量，增强光合作用，提高茎尖再生能力。
实施例5
测试本发明对感染病毒的种质的脱毒纯化效果：选择感染cmv（黄瓜花叶病毒）的雪莲果苗，按照实施例1的步骤进行操作，其中步骤s4的液氮保存时间分别设置为10min、30min、60min、120min，将获得的再生植株采用rt-pcr技术检测cmv的脱除率，结果见下表4。
上述结果表明，本发明对感染病毒的雪莲果种质的脱毒效果良好，并且液氮保存时间对脱毒效果没有显著影响，本发明的方法只需在较短的时间内就能完成种质的脱毒纯化。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。