一种沙打旺组织培养再生方法与流程

本发明涉及组织培养技术领域，尤其是一种沙打旺组织培养再生方法。

背景技术：

沙打旺(astragalusadsurgenspall.)，别名直立黄芪，为豆科(leguminosae)黄芪属多年生草本植物，又名直立黄芪、麻豆秧。沙打旺作饲料的营养价值较高，可直接作马、牛、羊、骆驼、猪、兔子等大小牲畜青饲料，也可制成青贮、干草和发酵饲料。沙打旺还可直接压青作基肥，异地压青作追肥，或以其秸秆制作堆、沤肥。此外，沙打旺防风固沙能力强，在黄河故道等风沙危害严重的地区，种植沙打旺可减少风沙危害、保护果林、防止水土流失和改良土壤。沙打旺是我国特有的栽培牧草、绿肥，其适应性强，具有抗旱、耐贫瘠、固沙等特点，是水土保持、恢复沙地荒地的重要物种。

近年来，内蒙古乃至全国的生态环境建设及畜草业发展对沙打旺的需求不断增大，但由于沙达旺的生育期长且兼有白花授粉和异花授粉的习性，导致其花期不集中，最终造成种子的质量很差，产量较低，直接影响了其推广与应用。传统的组培模式中愈伤组织生长速度较慢，易褐化，分化率较低。

因此，有必要对现有的沙达旺组织培养模式提出改进方案，建立以沙达旺种子为外植体，利用针-板高压电场辅助进行快繁分化的沙打旺组培再生体系。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种以种子为外植体，利用针-板高压电场辅助进行快繁分化的沙打旺组织培养再生方法，为提高沙打旺组织的繁殖速度和产量、促进其在全国生态环境建设及畜草业发展发挥更大作用提供了技术支持。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种沙打旺组织培养再生方法，它包括以下步骤：

1)外植体的选取：选取无虫眼成熟饱满的种子为外植体；

2)外植体的消毒：用水冲洗后置于经过消毒的的三角瓶中，在三角瓶中加入酒精进行低速振荡消毒10s以上，随后滤干酒精，接着加入升汞溶液低速振荡消毒5min以上，随后滤掉升汞溶液，再用无菌水冲洗3-5遍；

3)初始诱导培养：初始培养基为：含有0.5-2.0mg/l2，4-d、0.5-2.0mg/l6-ba和0.1-0.5mg/lnaa的ms培养基，将初始培养基消毒后放置48小时以上，随后消毒后的初始培养基放置于三角瓶中，再将刚消毒后的种子接种于初始培养基中，三角瓶的瓶口均用防菌透气膜进行封闭，培养温度25-28摄氏度，采用暗培养，直至种子萌发出新芽；

4)愈伤组织的快速繁殖：将愈伤组织切块并移入培养皿中，培养皿去盖后放入高压电场中，高压电场的平均场强为0.9-1.1kv/cm，处理时间为30min以上；

经高压电场处理后转入愈伤组织培养基上进行继代培养，培养温度25-28摄氏度，采用光/暗交互培养，光照周期为12-16h/d，光照强度为2500-3000lx，愈伤组织培养基为：含有0.3-1.0mg/l2，4-d、0.5-1.5mg/l6-ba和0.1-0.5mg/lnaa的ms培养基。

优选地，所述初始培养基为：含有1.0mg/l2,4-d、1.0mg/l6-ba和0.2mg/lnaa的ms培养基。

优选地，所述愈伤组织培养基为：含有0.5mg/l2,4-d、1.0mg/l6-ba和0.2mg/lnaa的ms培养基。

优选地，所述步骤4)中的高压电场为针-板高压电场，所述针-板高压电场采用上极为接交流高压的高压针极且下极为接地平板。

优选地，它还包括步骤5)叶的诱导分化培养：将上述继代培养的愈伤组织放入高压电场中处理，平均场强为1.4-1.6kv/cm，处理时间为30min以上；经高压电场处理后转入生叶培养基上培养，培养温度25-28摄氏度，采用光/暗交互培养，光照周期为12-16h/d，光照强度为2500-3000lx，生叶培养基为：含有1.5-2.5mg/l6-ba、0.5-1.0mg/lnaa、0.5-1.5mg/lkt和0.1-0.5mg/liba的ms培养基。

优选地，所述生叶培养基为：含有2.0mg/l6-ba、0.5mg/lnaa、1.0mg/lkt和0.2mg/liba的ms培养基，所述步骤5)中的高压电场为针-板高压电场。

优选地，它还包括步骤6)根的诱导分化培养：将上述经叶的诱导分化培养后的愈伤组织放入针-板高压电场中，平均场强为1.4-1.6kv/cm，处理时间为30min以上；经高压电场处理后转入生根培养基培养，培养温度25-28摄氏度，采用光/暗交互培养，光照周期为12-16h/d，光照强度为2500-3000lx，生根培养基为：含有0.5-1.0mg/lnaa和0.5-1.5mg/lbat的ms培养基。

优选地，所述生根培养基为：含有0.5mg/lnaa和1.0mg/lbat的ms培养基。

优选地，它还包括步骤7)炼苗及移栽：待根的诱导分化培养后形成的组培苗生长至6-8cm时，打开三角瓶上的无菌透气膜炼苗7天以上，炼苗后移栽到花卉营养土中正常培养，在移栽后每6-7天浇水一次。

优选地，它包括一超净工作台，所述高压针极包括上极板和设置在上极板的下表面且呈间隔分布的放电针体，所述上极板和接地平板均设置于超净工作台内且呈上下对位分布，所述上极板连接有一交流高压模块，所述交流高压模块受控于一中央控制模块，所述中央控制模块用于控制交流高压模块向上极板输送交流高压以在放电针体和接地平板之间形成针-板高压电场。

由于采用了上述方案，本发明以沙打旺种子为外植体，通过在沙打旺组织培养的不同阶段，选配具有不同配方和比例的培养基，利用针-板高压电场进行辅助配合，使沙打旺愈伤组织进行快速繁殖分化，同时提高沙打旺愈伤组织的叶分化率及根分化率，从而最终提高沙打旺组织再生培养的成活率，形成以沙达旺种子为外植体，利用针-板高压电场辅助进行快速繁殖分化的沙打旺组培再生体系，提高沙打旺的繁殖速度和产量，具有很强的实用价值和市场推广价值。

附图说明

图1是本发明实施例的针-板高压电场的结构示意图；

图2是本发明实施例的不同电场处理下沙打旺愈伤组织的生长速率；

图3是本发明实施例的不同电场处理下沙打旺愈伤组织的叶分化率；

图4是本发明实施例的不同电场处理下沙打旺愈伤组织的根分化率。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

如图1至图4所示，本发明实施例提供的一种沙打旺组织培养再生方法，它包括以下步骤：

1)外植体的选取：选取无虫眼成熟饱满的种子(约100粒)为外植体。

2)外植体的消毒：用自来水冲洗3次，冲洗后置于超净工作台3中的经过消毒的50ml的三角瓶中，在三角瓶中加入70％的酒精，并在小型涡旋混匀器上低速振荡消毒10s以上，用纱网滤干酒精，接着加入0.1％的升汞溶液，并在小型涡旋混匀器上低速振荡消毒5min以上，这种低速振荡消毒可以彻底消灭种子表皮的细菌等影响组培的物质，并可以缩短消毒时间，减少种子吸收水分；后滤掉升汞溶液，并用无菌水在小型涡旋混匀器上低速振荡冲洗3-5遍；对于沙打旺种子，一定不能用无菌水去离子水浸泡吸胀，否则会抑制种子发芽，导致愈伤的诱导率为0。

3)初始诱导培养：将刚消毒后的种子接种于消毒后放置48h以上的初始培养基中，培养温度25-28摄氏度，采用暗培养，直至种子萌发出新芽；初始培养基为：含有0.5-2.0mg/l的2,4-d、0.5-2.0mg/l的6-ba和0.1-0.5mg/l的naa的ms培养基，作为优选，初始培养基为：含有1.0mg/l的2,4-d、1.0mg/l的6-ba和0.2mg/l的naa的ms培养基；

消毒后初始培养基放置于50ml三角瓶中，每个三角瓶中接种3-5粒种子，一批次接种约20瓶，每个三角瓶的瓶口均用防菌透气膜进行封闭，防菌透气膜可保证在无菌通风条件下利于种子的萌发，种子萌发后，下胚轴开始逐渐膨大，14d可形成愈伤组织，出愈率为97％，并可用于继代培养；

其中初始培养基消毒后放置48h以上，可使消毒后的初始培养基中水分有所蒸发，若初始培养基的表面还有多余水分，可直接在接种时倒掉，初始培养基水分含量高可抑制沙打旺种子发芽；2,4-d(即2,4-二氯苯氧乙酸)属生长素类植物生长调节剂类物质，6-ba(即6-苄氨基腺嘌呤)属细胞分裂素类物质，naa(α-萘乙酸)属生长素植物生长调节剂类物质，2,4-d有利于胚性愈伤组织的诱导，但单独使用高浓度2,4-d会促使愈伤组织褐化，而且造成愈伤组织不能正常生长和分化，本发明利用2,4-d、6-ba、naa3种生长素类和细胞分裂素类物质不同浓度配合使用，出现淡黄色、颗粒状愈伤组织的比例(90％以上)比单独使用2,4-d的比例(48％)高出许多。

4)愈伤组织的快速繁殖：将愈伤组织切块，大小约为0.8cm×0.8cm×0.8cm的小块，移入直径为9cm的一次性塑料无菌培养皿中，每个培养皿可平放约30块愈伤组织，培养皿去盖后放入高压电场中，平均场强为1kv/cm，处理时间为30min；

经高压电场处理后转入愈伤组织培养基上进行继代培养，愈伤组织培养基为：含有0.3-1.0mg/l的2,4-d、0.5-1.5mg/l的6-ba和0.1-0.5mg/l的naa的ms培养基，作为优选，愈伤组织培养基为：含有0.5mg/l的2，4-d、1.0mg/l的6-ba和0.2mg/l的naa的ms培养基；培养温度26摄氏度，采用光/暗交互培养，光照周期为14h/d，光照强度为2500-3000lx，以促进愈伤组织快速分化繁殖；

高压电场包括普通高压电场和针-板高压电场，其中针-板高压电场采用上极为接交流高压的高压针极、下极为接地平板、极距为2cm、平均场强为1kv/cm的交流高压电场，如图2所示，经过高压电场的处理，可明显增加愈伤组织的生长速率，经普通高压电场处理后生长速率比不加电场处理的对照组提高20％，经针-板高压电场处理后生长速率比不加电场处理的对照组提高48％，比普通高压电场处理的对照组提高26％，而且高压电场处理可减轻愈伤组织褐化程度。

5)叶的诱导分化培养：

将上述继代培养的愈伤组织放入高压电场中处理，平均场强为1.5kv/cm，处理时间为30min以上；经高压电场处理后转入生叶培养基上进行生叶分化培养，生叶培养基为：含有1.5-2.5mg/l的6-ba、0.5-1.0mg/l的naa、0.5-1.5mg/l的kt和0.1-0.5mg/l的iba的ms培养基，作为优选，生叶培养基为：含有2.0mg/l的6-ba、0.5mg/l的naa、1.0mg/l的kt和0.2mg/l的iba的ms培养基上，培养温度26摄氏度，采用光/暗交互培养，光照周期为14h/d，光照强度为2500-3000lx，以进行诱导愈伤组织出芽，促进叶的分化生长，约20d后可长出沙打旺叶片；其中，kt(激动素，6-糠基腺嘌呤)属细胞分裂素类物质，iba(吲哚丁酸)属生长素植物生长调节剂类物质，如图3所示，经过高压电场的处理，可促进叶的分化生长提高叶的分化率，经普通高压电场处理后叶的分化率比不加电场处理的对照组相比提高约15％，经针-板高压电场处理后叶的分化率比不加电场处理的对照组提高约40％，比普通高压电场处理的对照组提高约22％。

6)根的诱导分化培养：

上述经叶的诱导分化培养后的愈伤组织放入针-板高压电场，平均场强为1.5kv/cm，处理时间为30min以上；经高压电场处理后转入生根培养基进行生根分化培养，生根培养基为：含有0.5-1.0mg/l的naa和0.5-1.5mg/l的bat(生根粉)的ms培养基，作为优选，生根培养基为：含有0.5mg/l的naa和1.0mg/l的bat的ms培养基，培养温度26摄氏度，采用光/暗交互培养，光照周期为14h/d，光照强度为2500-3000lx，以促进根的分化生长；如图4所示，经普通高压电场处理后根的分化率反而比不加电场处理的对照组降低了约7％，经针-板高压电场处理后根的分化率比不加电场处理的对照组提高50％，比普通高压电场处理的对照组提高约57％。

7)炼苗及移栽

待根的诱导分化培养后形成的组培苗生长至6-8cm时，打开三角瓶上的无菌透气膜炼苗7天以上，炼苗后移栽到花卉营养土中正常培养，在移栽时每6-7天浇水一次，注意浇水时不能浇透，移栽后成活率可达95％。

进一步地，如图1所示，本实施例的沙打旺组织培养再生方法还包括一超净工作台3，高压针极包括上极板1和设置在上极板1的下表面且呈间隔分布的放电针体11，上极板1和接地平板2均设置于超净工作台3内且呈上下对位分布，上极板1连接有一交流高压模块4，接地平板2通过一电流表6接地，交流高压模块4受控于一中央控制模块5，中央控制模块5用于控制交流高压模块4向上极板1输送交流高压以在放电针体11和接地平板2之间形成针-板高压电场。针-板高压电场中高压电极为针，针间距可调，本实施例中针间距为4cm，接地极为平面铜板，极距连续可调，本实施例中极距为2cm，高压电源输出50hz交流电，电压0-50kv连续可调。本实施例所用的针-板高压电场并非传统的尖端放电电场，传统的尖端放电电场指一种能产生局部电晕放电的非均匀电场，在非均匀电场中，电极的尖端处电力线最集中，电场强度也最大，当加上高压后，由于空气游离会在电极附近产生局部电晕放电，本实施例所用的针-板高压电场是通过非均匀高压电场、电晕放电、等离子体注入、二次电子发射等多种物理因素协同作用对愈伤组织的生长和分化产生促进作用。本实施例中所用的针-板高压电场与普通高压电场不同，普通高压电场上下极板2为互相平行的平板，且高压电源为直流高压电源。这种普通的高压电场装置产生的电场为均匀电场，而且不会电晕放电，不会有等离子体活性物质，为电场单一因素作用。所以在促进沙打旺愈伤组织生长和分化方面不如针板高压电场效果明显。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。