相关申请的交叉引用本申请要求于2017年10月30日提交的美国临时申请第62/578,959号的优先权，所述美国临时申请的内容以其全文并入本文。本公开涉及动物养殖和育种领域。具体地，本公开包含用于与射出精液和精子细胞样品一起使用以及在受精过程中使用的改善的培养基调配物。此类培养基调配物提供了改善的精子细胞活力、增强的精子细胞功能(包含活动力和生育力)和增强的受精卵形成(即，受精)。
背景技术：
：：动物养殖，特别是农业中动物养殖的一个重要方面是收集和使用精子细胞(spermcell)(精子(spermatozoa))。通常，以来自雄性动物的原始射出精液的形式收集精子细胞。对精子细胞的后续使用和操作要求维持细胞的活力和功能数小时或甚至数天。体外操作生殖细胞的实质性问题可能是生殖细胞特性的显著丧失，如脂质双层的改变、细胞器的改变、细胞凋亡或细胞坏死以及精子细胞活动力的降低。生殖细胞特性的丧失可以导致生殖细胞的生育力降低或活力降低或两者。生殖细胞的活力或生育力下降可以是以下情形中的显著不利条件：制备、冷却、冷冻、冷却或冷冻储存、融化或融化储存人工授精吸管(或其它容器或器皿)中包含的精子细胞、动物的人工授精、卵母细胞的制备、操作、冷却、冷冻、冷却或冷冻储存、融化或融化储存、卵母细胞的体外受精等。在对精子细胞进行流动分析或流动分选以获得按性别选择的精子细胞群体(主要带有x染色体或y染色体的精子细胞的群体)的最新进展的上下文中，此问题会进一步加剧。因为经过流动分析或流动分选的精子细胞经历增加数量的操作，包含对核dna进行染色、流动分析、流动分选以及收集所需数量的精子细胞，所以收集到的所得的经过流动分选的精子细胞显著丧失体内生殖细胞特性的可能性增加。性别鉴定过程使精子受到细胞损害(alvarz和storey,1992)。这些应力减少了活细胞群体，并且快速损失预计出现在至少两个步骤期间：在染色之前进行温育(在约19℃下)以及性别鉴定；以及在冷冻期间以进行长期储存。精子中的诱导性氧化dna损伤会降低受精率，而高损伤水平会导致胚胎转录激活后发育停滞(aitken等人,2009；fatehi等人,2006)。辅助生殖技术(art)包含如体外受精(ivf)、人工授精(ai)、胞质内精子注射(icsi)(以及使用去核细胞的其它技术)以及超数排卵和胚胎移植(moet)(以及其它胚胎移植技术)等技术、用于整个动物界，包含人类和其它动物。考虑到配子和胚胎在其自然环境之外时固有的易碎性，art方法通常是昂贵、费时且不一定成功的。此外，由于遗传上合意的配子和受精卵的可获得性有限，因此以商业上可行的方式在动物育种业内使用art具有另外的挑战性。降低art成本并提高其商业可行性的一种方法是通过改善配子和受精卵的活力和整体质量来提高所涉及过程的效率。尽管在过去十年左右的时间里对此领域的关注不断增长，但仍然强烈需要提高配子和受精卵的总体质量以供在art中使用，尤其是当育种聚焦于产前性别选择时，包含改善其活力(在配子和受精卵的情况下)、其活动力和生育力(在精子细胞的情况下)以及其它寿命特性。例如，在ivf中，使用现有技术发育成胚胎的受精卵的百分比相对较低；此高损失率显著地增加了胚胎和为最终用户提供相关服务的成本并且降低了高质量胚胎的有效可用性。随后通过冷冻保存以及非冷冻运输进行胚后处理会进一步加剧这些成本和可用性问题。胚胎的冷冻保存受到胚胎生产成功率以及体外胚泡生长的限制。目前，仅微小百分比的ivf胚胎适合于冷冻保存，这增加了art程序的持续存在的高成本。尤其是当加工常规的和经过性别分选的配子(如经过冲洗的卵母细胞或精子细胞)时，在其用于art中之前，对配子细胞增加了巨大的应力，并对其细胞完整性和膜结构产生了负面影响，这进而反映在活力、活动力和生育力下降方面。在将配子用于art中之前对其进行加工的实例是基于性别对精子细胞进行分选(称为“性别富集”或“性别分选”)，这是用于将错误性别的无效出生最小化以便在畜牧业中进行选择性育种的高度期望的程序，但通常成本过高并且对具有较小育种群的那些而言可能有风险。流行的基于流式细胞术的性别分选过程严重胁迫和破坏细胞并产生低百分比的有用精子，尽管所述精子能够使成熟的卵母细胞受精，但在性别分选过程后活力、活动力和生育力有所降低。通常，性别分选涉及许多艰巨的步骤，包含但不限于最初收集和处理在收集时自然开始迅速恶化的精子射出精液；对精子细胞进行染色，这涉及可激发的染料与dna的结合或有害的膜选择程序、使用物理上对与dna结合的染料增能的高能荧光对精子细胞进行物理分选、通过狭窄的孔口强制定向以及向细胞施加电荷；将细胞物理收集到通常会在接触时使易碎细胞震荡的容器中；与精子液滴在收集培养基中的稀释有关的渗透应力；以及通常通过众所周知会引起细胞的膜系统遭到破坏的冷冻来储存经过分选的精子。每个步骤都将经过加工的精子置于异常应力下，这降低了精子的总体活动力、活力和/或生育力。结果可能导致效率较低的样品用于ivf和ai等art中以及其它类型的后续或进一步加工。即使未经过分选的经过加工的精子在不冷冻的情况下进行收集、处理和运输时也展现出生育力、活力和活动力的显著损失，并且在与冷冻保护剂混合并冷冻融化时明显承受巨大的应力。本领域中的许多人试图改善用于未经过分选的常规精液的将在与精液样品的体外处理、保存和使用相关的处理过程中的损失最小化的方法。无论经过何种加工，精子在暴露于以下时都会失去其受精的潜能：升高的温度、异常的缓冲剂、染色剂、改变的ph系统、当通过喷嘴强制或在流式细胞仪中振荡形成液滴时的物理加压定向、用于照射dna结合染料的辐射、与分离和收集技术相关的物理应激物、冷冻保护剂、通过处理器进行冷冻、融化和显微操作。当与精子细胞一起使用时，其它可商购获得的培养基不提供必要的性能特性。商业培养基可能不允许充分维持精子的活力和/或活性。另外，可商购获得的培养基还可能干扰精子的下游使用，如在性别分选期间或在ivf或ai中。最小化细胞应激物增加了在性别鉴定过程(或其它操作)中存活的精子数量并且因此增加了农民对经过性别鉴定的精液的可用性。最小化这些应力的一种方法是在原始射出精液中添加精液扩展剂以保持活力和活动力，这进而可以改善对性别鉴定过程的应力的细胞耐受性。保存有资格进行性别鉴定的活的、活动的精子群体的扩展剂可以通过以几种方式提高产量来大大降低农民在经过性别鉴定的精液方面的成本。目前，在冷冻保存期间，有很大一部分(大约50％)活细胞包装在授精吸管中，但扩展剂可以通过最小化上游应激物来增加在冷冻下存活的细胞数量。迄今为止，仍然非常需要改善在体外加工期间，尤其是在与精子的性别分选相关的严酷加工期间常规处理易碎配子时涉及的组合物和方法，由此结果是可复制性地改善了精子细胞和胚胎的活力、活动力和生育力。仍然持续需要改善当前art方法以降低成本并使程序对预算很紧的那些育种者而言，尤其是将性别选择育种视为高风险且昂贵选择的那些小型育种者而言更加可靠且商业上可行。理想的扩展剂调配物必须维持较高的活动精子群体并且不得干扰使用荧光dna染色剂分离x和y群体的能力，这是在性别鉴定细胞仪仪器上分离两个细胞群体所需要的。技术实现要素：下面总结了所要求保护的发明的某些实施例。这些实施例不旨在限制所要求保护的发明的范围，而是充当对本发明的可能形式的简要描述。本发明可以涵盖不同于这些总结的各种形式。本公开的一方面涉及一种培养基调配物，所述培养基调配物包括碱性盐培养基。在另一方面，所述碱性盐培养基包括选自由以下组成的组的至少一种组分：氯化钠(nacl)、氯化钾(kcl)、二水合氯化钙(cacl2·2h2o)、六水合氯化镁(mgcl2·6h2o)、碳酸氢钠(nahco3)、二水合磷酸二氢钠(nah2po4·2h2o)、磷酸二氢钾(kh2po4)、果糖、山梨糖醇、牛血清白蛋白(bsa)、tris碱、柠檬酸以及其组合。在另一方面，所述培养基调配物包括添加剂。在又另一方面，所述添加剂选自由以下组成的组：磷脂酰丝氨酸(ps)、紫花前胡素、氯化锌、辅酶q10、香豆素化合物、吡喃香豆素化合物、nsaid、亚麻酸、脂肪酸、d-天冬氨酸、氟化钠以及其组合。在又另一方面，所述nsaid为乙酰水杨酸。在又另一方面，所述吡喃香豆素化合物为紫花前胡素。在又另一方面，所述培养基调配物包括碱性盐培养基和添加剂。在本公开的另一方面，所述培养基调配物增强了哺乳动物生殖细胞的活性、增强了从生殖细胞形成受精卵/胚泡(即，受精增加)、增强了精子细胞的活力、移动性和/或生育力、将精子维持在有受精能力的状态或缓解了由于冻融过程造成的细胞损失或dna损伤。受精能力是暴露于本发明的所述培养基调配物中的精子细胞在体外以及在体内通过人工授精和受精、卵裂或胚泡转化产生妊娠的能力。在另一方面，所述培养基调配物将细胞活力扩展至少24小时。在又另外的方面，所述哺乳动物生殖细胞选自由以下组成的组：配子、单倍体细胞、胚细胞、性细胞、精子细胞和卵细胞。在又另一方面，所述培养基调配物在用于增强精子细胞的活力或生育力的方法中使用。在又另一方面，所述哺乳动物生殖细胞可以源自来自雄性哺乳动物的射出精液。本公开的一方面涉及一种组合物，所述组合物包括所述培养基调配物和来自雄性哺乳动物的射出精液。在另一方面，所述培养基调配物包括所述碱性盐培养基。在另一方面，所述培养基调配物包括添加剂。在又另一方面，所述培养基调配物包括碱性盐培养基和添加剂。在又另一方面，所述组合物被冷冻保存。本公开的一方面涉及一种加工哺乳动物生殖细胞的方法，所述方法包括以下步骤：提供哺乳动物生殖细胞样品、加工所述哺乳动物生殖细胞样品以及添加本发明的所述培养基调配物。在另一方面，所述培养基调配物包括所述碱性盐培养基。在另一方面，所述培养基调配物包括添加剂。在又另一方面，所述培养基调配物包括碱性盐培养基和添加剂。在又另一方面，所述加工包括选自由以下组成的组的至少一个步骤：收集精液样品、进行性别鉴定、分选、分离、冷冻、人工授精、体外受精、冷却、运输以及相关过程。在又另外的方面，通过液滴分选、机械分选、微流体加工、微芯片加工、喷射和空气加工、流式细胞术加工以及激光消融来完成所述性别鉴定。在又另一方面，所述雄性哺乳动物为公牛或公猪。在又另外的方面，将经过加工的哺乳动物生殖细胞聚集在容器、试管或吸管中。在另外的方面，所述哺乳动物生殖细胞选自由以下组成的组：配子、单倍体细胞、胚细胞、性细胞、精子细胞和卵细胞。在又另一方面，通过此加工方法来生产精子细胞组合物。本公开的一方面涉及一种加工精子样品的方法。在一些方面，此方法包括从雄性哺乳动物获得射出精液以及将所述射出精液与所述培养基调配物组合。在另一方面，所述培养基调配物包括所述碱性盐培养基。在另一方面，所述培养基调配物包括添加剂。在又另一方面，所述培养基调配物包括碱性盐培养基和添加剂。本公开的一方面涉及一种使一个或多个卵子受精的方法，所述方法包括以下步骤：提供从雌性哺乳动物获得的卵子、从与所述雌性哺乳动物相同物种的雄性哺乳动物提供所述精子细胞组合物以及将一个或多个卵子与所述精子组合物混合。在某个方面，通过所公开的加工方法来生产所述精子细胞组合物。在又另一方面，将所述精子细胞组合物与所述培养基调配物混合。在另一方面，所述培养基调配物包括所述碱性盐培养基。在另一方面，所述培养基调配物包括添加剂。在又另一方面，所述培养基调配物包括碱性盐培养基和添加剂。在又另一方面，所述雄性哺乳动物为公牛或公猪。本公开的一方面涉及一种生产胚胎的方法，所述方法包括将来自雄性哺乳动物的精子细胞组合物用于辅助生殖技术。在某个方面，通过所公开的加工方法来生产所述精子细胞组合物。在又另一方面，将所述精子细胞组合物与所述培养基调配物混合。在另一方面，所述培养基调配物包括所述碱性盐培养基。在另一方面，所述培养基调配物包括添加剂。在又另一方面，所述培养基调配物包括碱性盐培养基和添加剂。在又另一方面，所述雄性哺乳动物为公牛或公猪。在一些方面，所述辅助生殖技术选自由以下组成的组：体外受精(ivf)、人工授精(ai)、胞质内精子注射(icsi)、超数排卵和胚胎移植(moet)以及其它胚胎移植技术。在另外的方面，所述方法进一步包括对所述精子样品进行性别鉴定。本公开的一方面涉及一种对精子细胞群体进行性别鉴定的方法，所述方法包括以下步骤：提供精子细胞样品、将所述精子细胞样品性别鉴定成至少一个亚群以及将选自由以下组成的组的至少一种添加剂添加到所述精子细胞样品：抗氧化剂、磷脂酰丝氨酸(ps)、紫花前胡素、氯化锌、辅酶q10、乙酰水杨酸、亚麻酸、脂肪酸、d-天冬氨酸、氟化钠以及其组合。在另外的方面，所述精子细胞群体进一步包括精液流体组分和/或原始射出精液。在又另一方面，经过性别鉴定的亚群包括至少一种性别富集的带有x染色体或带有y染色体的精子细胞群体。在另外的方面，所述方法包括将经过性别鉴定的精子样品与所述培养基调配物组合。在另一方面，所述培养基调配物包括所述碱性盐培养基。在另一方面，所述培养基调配物包括添加剂。在又另一方面，所述培养基调配物包括碱性盐培养基和添加剂。在又另一方面，通过此方法来生产精子细胞组合物。在另外的方面，收集精子细胞群体的亚群包含通常在容器、试管或吸管中将选定的和未选定的亚群聚集在一起。这可以进一步限定为在消融精子细胞亚群之前和之后，物理上不细分精子细胞群体的流，并且两个亚群一起退出并聚集。本公开的一方面涉及一种使一个或多个卵子受精的方法，所述方法包括以下步骤：提供从雌性哺乳动物获得的卵子、从与所述雌性哺乳动物相同物种的雄性哺乳动物提供根据权利要求所述的经过性别鉴定的精子细胞组合物以及将一个或多个卵子与所述精子组合物混合。又另一方面为一种生产胚胎的方法，所述方法包括将来自雄性哺乳动物的经过性别鉴定的精子细胞组合物用于辅助生殖技术。在一些方面，通过所公开的加工方法来生产所述经过性别鉴定的精子细胞组合物。在又另一方面，将所述精子细胞组合物与所述培养基调配物混合。在另一方面，所述培养基调配物包括所述碱性盐培养基。在另一方面，所述培养基调配物包括添加剂。在又另一方面，所述培养基调配物包括碱性盐培养基和添加剂。在又另一方面，所述雄性哺乳动物为公牛或公猪。在一些方面，所述辅助生殖技术选自由以下组成的组：体外受精(ivf)、人工授精(ai)、胞质内精子注射(icsi)、超数排卵和胚胎移植(moet)以及其它胚胎移植技术。本公开的一方面涉及一种受精的方法，所述方法包括提供从雌性哺乳动物获得的卵子；提供从与所述雌性哺乳动物相同物种的雄性哺乳动物获得的精子样品，所述精子样品包括精子细胞和选自由以下组成的组的至少一种添加剂：磷脂酰丝氨酸(ps)、一种或多种香豆素化合物或吡喃香豆素化合物、氯化锌、辅酶q10、一种或多种nsaid、亚麻酸、脂肪酸、d-天冬氨酸、氟化钠以及其组合；以及用所述精子样品使所述卵子受精。在另外的方面，所述受精包括体外受精。在另一方面，所述受精包括人工授精(ai)。在另一方面，所述精子细胞组合物进一步包括精液流体组分和/或原始射出精液。在又另外的方面，可以对所述精子样品进行性别选择，并且所述精子样品可以包括增加比例的带有x染色体或带有y染色体的精子细胞。本公开的一方面涉及一种用于增强哺乳动物生殖细胞的活力的培养基调配物，其中所述培养基包括磷脂酰丝氨酸(ps)。在另外的方面，所述培养基调配物进一步包括氟化钠。在又另一方面，所述培养基调配物进一步包括紫花前胡素、氯化锌、辅酶q10、乙酰水杨酸、亚麻酸、脂肪酸、d-天冬氨酸或其组合。本公开的一方面涉及一种保存精子样品的方法，所述方法包括从雄性哺乳动物获得射出精液以及将所述射出精液与包括磷脂酰丝氨酸(ps)的培养基调配物组合。在另一方面，所述培养基调配物进一步包括氟化钠。在又另一方面，所述培养基调配物进一步包括紫花前胡素、氯化锌、辅酶q10、乙酰水杨酸、亚麻酸、脂肪酸、d-天冬氨酸或其组合。在另一方面，所述碱性盐培养基的调配类似于cep2(附睾尾血浆)培养基(verberckmoes,2004)。在另一方面，此碱性盐培养基补充有另外的调配物，在本文中称为精子活力和生育力增强培养基(svfem)。在svfem中扩展≥24小时的细胞展现了在收集后立即评估的配对的非扩展射出精液样品的十个百分点内的活动群体。在svfem中扩展的细胞产生了符合传出质量控制标准的经过性别鉴定的冷冻保存的精液产品。与在同一天进行性别鉴定并且在冷冻前以相同细胞浓度包装的非扩展对照物相比，经过svfem扩展的分裂射出精液中融化后每个吸管的活动细胞数量(授精剂量)有所增加，从而表明对冷冻保存的耐受性提高。对上文详细描述的对svfem扩展剂的精子响应的初步分析证实，在24小时温育后，精子是活的且活动的。在一些方面，培养基调配物的组分被分组为浓缩溶液并且被储存。这些储备溶液可以以液体、冷冻或冻干的形式储存。在一些方面，所述培养基调配物由储备溶液制备。在另外的方面，所述培养基调配物由多组分储备溶液制备或制成，所述多组分储备溶液包含但不限于两组分储备溶液和可替代地三组分储备溶液。本公开的其它方面包括一种用于补充培养基的试剂盒。在一些方面，所述试剂盒包括选自由以下组成的组的至少一种添加剂：抗氧化剂、磷脂酰丝氨酸(ps)、紫花前胡素、氯化锌、辅酶q10、香豆素化合物、吡喃香豆素化合物、nsaid、亚麻酸、脂肪酸、d-天冬氨酸、氟化钠以及其组合。试剂盒可以进一步包括包含一种或多种组分、添加剂、盐碱或培养基调配物的试管或容器。试剂盒可以进一步包括包含另外的组分、添加剂、盐碱或培养基调配物的另外的试管或容器。试剂盒还可以包括使用说明书，如用于制备培养基、加工哺乳动物生殖细胞、使一个或多个卵子受精或生产胚胎的说明书。在回顾了说明书以及随后的示例性方面和实施例之后，其它方面对于本领域技术人员将是显而易见的。附图说明为了展示本公开，在附图中描绘了本公开的各方面和实施例的某些特征。然而，本公开不限于在附图中描绘的各方面的精确布置和手段。图1是量化在19℃下储存0或24小时的精液中存在的前向活动细胞的百分比并且展现了svfem扩展将活动细胞群体保存在测量的进入值的十个百分点内的绘图。使用casa系统确定前向活动％。n＝10份配对的射出精液。图2示出了，与没有氟化钠(naf)的基础svfem培养基调配物相比，氟化钠补充的培养基在时间24染色后示出前向活动细胞％略有下降。曲线图示出了来自相对于具有0mmnaf的svfem归一化的补充有3mmnaf的svfem培养基的数据。在时间0处，大多数值与对照svfem组保持相同，但是到24小时时，它们都降到低于配对的svfem组中的值至少20％。n＝8份独特公畜的射出精液。将值相对于0mmnaf对照物归一化。此减少表明，在svfem配方中补充有naf不是最佳调配。图3展现了对在2天中在六个不同时间点进行性别鉴定的经过svfem处理的射出精液中冻融后每个授精剂量的前向活动细胞浓度的数量的量化。灰线表示前向细胞的失效阈值1m/ml。在性别鉴定过程开始之前，经过svfem处理的射出精液在长达32小时的温育后仍在冻融过程中存活下来。将每个吸管的前向细胞绘制为平均值+/-se。n＝来自15个不同的荷斯坦牛(holstein)(11)和娟姗牛(jersey)(4)公畜的24份独特射出精液。图4示出了三次配对的射出精液的平均胚泡转化表明与配对的经过性别鉴定的对照样品相比，用svfem扩展剂温育不会影响胚泡转化。无统计学上显著的差异。n＝来自3个独特公畜的3份配对的射出精液。图5示出了ivf程序的图解概况。图6示出了每种经过评估的受精效率类别的代表性图像：a-单精子，如由两个去缩合的原核和两个缩合的极体表示的；b-多精子，如由3个或更多个去缩合的原核分类的；c-未受精，没有现成的原核；d-其它，卵丘细胞的模糊荧光妨碍了充分进行评分。成像的所有受精卵均来自一个处理组，即经过性别鉴定的对照精液。图7示出了，从经过评分的推测受精卵总数中计算出的多精子受精百分比在t24svfem中示出了显著增加。值表示来自所述组的所有经过评估的受精卵的平均值。如通过对经过自然对数转换的数据进行单向anova所测量的，各组之间没有显著差异，总p值为0.279。与对照物相比，t0的p值为0.450，并且与对照物相比，t24的p值为0.483。n＝50份独特的射出精液。图8示出了，从经过评分的推测受精卵总数中计算出的单精子受精百分比并未示出有显著差异。值未归一化并且表示来自所述组的所有经过评估的受精卵的平均值。对经过反正弦转换的数据进行的总体单向anova得出p＝0.197。n＝50份独特的射出精液。图9示出了，从经过评分的推测受精卵总数中计算出的未受精卵母细胞百分比在两个svfem处理组中均示出了显著降低。值未归一化并且表示来自所述组的所有经过评估的受精卵的平均值。总体而言，如通过单向anova所测量的，存在显著差异，p＝0.002。bonferroni测试指定了对照物与svfemt0之间p＝0.004以及对照物与t24之间p＝0.013的具体差异。n＝50份独特的射出精液。图10示出了，卵裂百分比示出在两个svfem处理组中卵裂的受精卵的百分比显著增加。在对经过反正弦转换的数据的单向anova中看到显著差异p＝0.0004。bonferroni测试鉴别了组中的两个显著差异；对照物不同于t0p＝0.002，并且对照物不同于t24p＝0.001。n＝60份独特的射出精液。图11示出了，第7天的胚泡平均百分比示出在两个svfem组中每个卵母细胞的胚泡百分比显著增加。在对经过反正弦转换的数据的单向anova中看到总体显著差异p＝0.0008。bonferroni分析鉴别了处理与对照物之间的差异。t0相比于对照物给出了p＝0.008，并且t24相比于对照物给出了p＝0.002。n＝60份独特的射出精液。图12示出了，第8天的胚泡平均百分比示出在t0svfem组中每个卵母细胞的胚泡百分比增加。在单向anova中看到总体显著差异p＝0.031。bonferroni分析鉴别了t0svfem与对照物之间的差异给出了p值为0.037，并且t24与对照物之间没有差异，p＝0.143。n＝60份独特的射出精液。图13示出了，第7天与第8天之间的平均胚泡发育的差异示出各组之间没有显著差异，总体anovap值为0.723。n＝60份独特的射出精液。图14示出了，第8天的胚泡平均数量示出每个品种跨所有三个处理组的结果；在这些曲线图中一致的趋势不明显。a是对照物，l是t0svfem，s是t24svfem。在用anova分析时没有标记一致趋势。n＝20头独特的公牛。图15示出了由公牛的星级排名分离的第8天的平均胚泡；曲线图上一致的趋势不明显。a是对照物，l是t0svfem，s是t24svfem。在用anova分析时没有计算一致趋势。n＝20头独特的公牛。图16示出了由年龄组划分的第8天的平均胚泡；曲线图中一致的趋势不明显。a是对照物，l是t0svfem，s是t24svfem。在anova分析时没有计算一致趋势。n＝20头独特的公牛。图17示出了，相对于常规的未经过性别鉴定的对照精液归一化的平均卵裂百分比示出svfem组和非扩展对照卵裂两者均显著低于常规对照物。曲线图上的平均值表示与常规精液样品中的平均值的百分比差异。在单向anova中，处理组和经过性别鉴定的精液对照物两者均显著不同，p<0.001。n＝29份独特的射出精液。图18示出了，相对于常规的未经过性别鉴定的对照精液归一化的第7天平均胚泡百分比示出svfem组和非扩展的精液均在第7天显著低于常规对照精液地转化为胚泡。曲线图上的平均值表示与常规精液样品中的平均值的百分比差异。在单向anova中，处理组和经过性别鉴定的精液对照物两者均显著不同，p<0.001。n＝29份独特的射出精液。图19示出了，相对于常规的未经过性别鉴定的对照精液归一化的第8天平均胚泡百分比示出svfem组和非扩展对照物两者均在第8天显著低于常规对照精液地转化为胚泡。曲线图上的平均值表示与常规精液样品中的平均值的百分比差异。在单向anova中，处理组和经过性别鉴定的精液对照物两者均显著不同，p<0.001。n＝29份独特的射出精液。图20展现了示出了缺乏从代表性彗星测定图像dna去缩合和迁移的图像。a和c为经过200μmh2o2处理的细胞，并且b和d为经过对照diffo处理的细胞。c和d在凝胶嵌入之前被机械均质化，而a和b没有。在a和b中，明场示出了dna紧固致密在内的精子头部形状，c和d不具有在明场图像中可见的结构，但是dna仍然紧固致密地呈卵形。c和d处的荧光较暗，并且在明场会聚图像中被洗掉。图21示出了svfem与对照物之间在储存24小时后的活动力比较。图22示出了svfem(f-1)中的naf浓度对活动细胞数量的影响。图23示出了对于经过常规加工的样品，使用svfem(f-1)提高了活动细胞的产量。图24示出了在svfem(f-1)中储存精子样品24小时的效果。图25示出了24小时储存使用svfem(f-1)的精子样品相对于使用对照培养基的样品的效果。比较加工前与染色后的样品。图26示出了24小时储存使用svfem(f-1)的精子样品相对于使用对照培养基的样品的效果。样品是经过后处理的精子的吸管。图27示出了利用含有svfem(f-1)的样品的ivf数据。将使用对照培养基的经过性别鉴定的样品与svfem(f-1)以及与经过常规加工的样品(未经过性别鉴定)进行比较。图28示出了利用含有svfem(f-l)的样品的更多ivf数据。将使用对照培养基的经过性别鉴定的样品与svfem(f-1)进行比较。图29示出了24小时后消除svfem(f-1)的组分对细胞活动力的影响。图30示出了由三组分储备溶液制成的svfem(f-1)的有效性。具体实施方式在继续进一步详细描述各个方面和实施例之前，应当理解的是，本公开并不限于具体的组合物或方法步骤并且可以变化。除非上下文中另外规定，否则如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指代物。本文表达的范围包含在内。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所涉及的领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。例如，《生物医学与分子生物学简明词典(theconcisedictionaryofbiomedicineandmolecularbiology)》,jui,pei-show,第2版,2002,crc出版社；《细胞与分子生物学词典(thedictionaryofcellandmolecularbiology)》,第3版,1999,学术出版社(academicpress)；以及《生物化学与分子生物学牛津词典(theoxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology)》,修订版,2000,牛津大学出版社(oxforduniversitypress)为技术人员提供了在本发明中使用的许多术语的常用词典。本公开涉及改善生殖细胞活力和活性的组合物和方法。具体地，本说明书以一种形式提供并包含了赋予生殖细胞，特别是精子细胞增加的活性和活力的培养基调制物。本说明书以另一种形式提供并包含了用于加工生殖细胞样品的方法，其中所述方法和过程产生了其中精子细胞具有增加的活力和活性的样品。本说明书以另一种形式还提供并包含了通过这些方法生产的生殖细胞样品，其中样品中的生殖细胞具有增加的活力和活性。以另一种形式，本说明书提供并包含了使用具有增加的活力和活性的这些生殖细胞样品的方法，包含性别鉴定(选择带有x染色体或带有y染色体的细胞)、分选、分离、冷冻、人工授精、体外受精、冷却和运输以及相关过程。如本文所用，术语“性别鉴定”是指从包括带有x染色体和y染色体两者的精子细胞的混合物的群体中选择带有x染色体或带有y染色体的精子细胞的任何过程。精子细胞群体可以是原始射出精液或任何其它混合物或精子细胞。可以使用多种不同的技术来完成性别鉴定过程，包含液滴分选(在美国专利第[]号中描述)、机械分选和激光消融。如本文所提及的，术语“生殖细胞”被限定为精子、卵子以及形成的胚胎/胚泡，还被限定为配子；单倍体细胞；胚细胞；性细胞；精子细胞和卵细胞。如本文所用，术语“培养基(medium或media)”是指可以含有营养物、盐和其它物质或成分的基本上液态的组合物。如本文所用，术语“射出精液”是指由雄性哺乳动物产生的(如通过射精释放的)精液和精子的组合。如本文所提及的，术语“精液流体组分”是组成哺乳动物精液和/或通常在哺乳动物精液中发现的物质。精液流体组分包含但不限于氨基酸、前列腺特异性抗原、蛋白水解酶、柠檬酸、柠檬酸盐、唾液酸、维生素c、酸性磷酸酶、溶纤维蛋白溶酶、脂质、果糖、前列腺素、磷酸胆碱、甘油磷酰胆碱、黄素、如腐胺、精胺、亚精胺和尸胺等碱性胺、锌、半乳糖、粘液以及其它有机和无机成分。可以实施所公开的性别鉴定程序以便与新鲜的未扩展的射出精液一起使用。然而，使用未补充有扩展剂的新鲜射出精液存在固有问题，因为收集后射出精液的质量不断下降。进行性别鉴定的精子暴露于多种损害，包含温度波动、高稀释度以及细胞加工期间的ph值变化。性别鉴定期间的损害包含剪切应力、高流体压力以及由性别鉴定过程对细胞仪造成的高作用力(gamer和seidel,2003；garner,2006)。这些损害导致加工后回收的细胞数量减少。加工期间的所述细胞损失虽然不利，但并不是预计的产品损失的主要来源。主要的损失是由于新鲜射出精液在收集后随时间推移在死细胞群体方面有稳定增加。其主要因素是新鲜射出精液必须在接近室温下储存，因为性别鉴定过程是在室温下发生的。将射出精液保持在室温下，而不是在更好地保存细胞存活性的更冷温度下，防止了将时间花费在平衡到更冷温度上，并且允许不断地对射出精液进行性别鉴定。这也增加了在性别鉴定过程开始之前活细胞损失的速度。这种持续的活力丧失，与执行性别鉴定和包装步骤所需的时间相匹配时，导致了在不迟于收集后12小时冷冻经过性别鉴定的射出精液的标准策略。这种必须在不迟于收集后12个小时包装好射出精液的策略由于过剩的射出精液体积而留下许多射出精液体积。这些过量的体积不能被利用，因为更新鲜的射出精液被收集之后才被完全使用。一天24小时每6小时收集一次射出精液，以防止由于样品不足而导致仪器运行时间流逝。这意味着从清晨收集的射出精液经常在第二个每日收集到达时仍留有可行的体积供运行，但仍被去除并替换以更新鲜的射出精液，因为较旧的样品不太可能在仪器上另外运行6小时。偏好选择新鲜的射出精液导致第二主要损失来源：性别鉴定仪器的停机时间。每天在同一时间去除和替换给定时间点的所有射出精液，这意味着每天要关闭、清洁和重新启动仪器四次。这意味着每台仪器每天四次至少要损失40分钟的运行时间。以细胞数量计算的这些数字为每天每台仪器未收集的46.9×10个偏斜细胞；这转变为每天损失大约一千个授精剂量。调配用于在精子性别鉴定设施中使用的扩展剂可以帮助减轻损失。首先，扩展剂可以减缓性别鉴定前保持在室温下的精子细胞的下降，从而允许在单个时间点收集更多的射出精液并减少每天收集射出精液的次数。在此模型中，仅按公牛根据需要关闭仪器以更换为新的射出精液，而不是立即关闭整个生产车间。这将会减少更换为新公牛所花费的时间，因为这增加了每个仪器的可用人员。维持细胞活力还意味着射出精液可以一直运行到精疲力尽，从而将每份射出精液获得的经过性别鉴定的精子数量最大化并减少每天每台仪器将会执行的公牛更换的总次数。通过减轻细胞损失的这些原因，产生的授精剂量数量将会增加，从而使优质产品更加可供全球农民使用。另外，在冻融过程期间观察到大量细胞损失。通常将常规的(即，非性别鉴定的)精液和经过性别鉴定的精液两者都冷冻在吸管中以进行储存和分配。吸管必须先融化后再用于授精或受精。此冷冻和融化过程导致吸管中大部分细胞死亡。本文所公开的培养基调配物和方法可以用于减轻由于冻融过程引起的细胞损失。增强的扩展培养基调配物本发明的增强的扩展培养基调配物提供了多种重要的益处：增强的扩展培养基调配物将细胞活力扩展至少24小时，其中前向活动细胞的损失不超过十个百分点；增强的扩展培养基调配物不干扰对细胞的hoechst33342(或替代性方案)染色和红色染料活力复染，这是在细胞仪上进行正确性别鉴定所必需的；并且增强的扩展培养基调配物不对受精能力或胚胎发育产生负面干扰。与可商购获得的扩展剂(minitube(微型试管)，美国威斯康星州的德拉文公司(delavan,wiusa))和optixell(美国明尼苏达州枫叶林市的imv科技公司(imvtechnologies,maplegrove,mnusa))相比，根据本发明的实施例的调配物—具有另外的补充剂(svfem)的cep2调配物—展现出增强的精子细胞存活性和活动力，并且先前描述的培养基调配物cep2(verberckmoes等人,2004)和初步数据证明，在24小时温育后，可商购获得的扩展剂维持了比未扩展的射出精液更高的存活性，但是专有培养基svfem是在传入射出精液值的十个百分点以内的专门维持的活动细胞群体(图1)。然后将用三种培养基选择中的每种选择进行扩展的射出精液染色，并且在性别鉴定细胞仪上运行。干扰了区分50％以上样品中x和y精子群体的能力，然而optixell却没有维持足够高的活群体(数据未示出)。svfem处理组具有足够大小的细胞群体分离，从而允许在性别鉴定仪器上进行正确的性别鉴定。在一方面，本发明的培养基调配物包含缓冲剂。对于细胞存活性和/或货架期非常重要的应用，缓冲剂可以是tris或hepes。tris是精子细胞样品生产中常用的其它培养基的组分，但hepes的稳定ph范围更接近cep2的ph。在某些实施例中，可以使用tris，因为如通过ph稳定性测量的，tris在调配物中的货架期更长。在其它方面，还测试了可以补充有naf的本发明的培养基调配物，经过测试的naf剂量的范围为约0mm到约6mm。naf可以作为精子固定剂被包含在内，其可以节省细胞能量，并且其细胞活动力效果可以通过稀释来挽救。然而，在与其它经过测试的扩展剂组相等的前向活动细胞浓度下包装和冷冻后，naf可以减少在生产程序的应力下存活下来的活动细胞的数量(图2)。根据本发明的一方面的增强的培养基调配物在进行性别鉴定之前扩展了细胞存活性的窗口，而在性别鉴定过程之后仍维持所测量细胞是活的且活动的。如图3所示，即使在进行性别鉴定前在svfem扩展剂中温育24小时后，冻融后经过svfem处理的精子细胞中前向活动细胞的数量也通过了活动细胞浓度的质量控制指标(100万个前向活动细胞/毫升)。在三个组中比较了量化的活动力结果：在同一天进行性别鉴定的非扩展精液；在同一天进行性别鉴定的经过svfem扩展的精液(t0svfem)；以及在19℃下温育24小时后进行性别鉴定的经过svfem扩展的精液(t24svfem)。对于多精子受精，根据本发明的一方面的增强的培养基调配物导致在t24svfem中评分的推测受精卵显著增加(图7)。此外，如图9所示，从经过评分的推测受精卵总数中计算出的未受精卵母细胞百分比示出了在两个svfem处理组中均显著降低。根据本发明的一方面的增强的培养基调配物导致每个卵母细胞的胚泡百分比增加。如图11所示，第7天的胚泡平均百分比示出了在两种svfem中每个卵母细胞的胚泡百分比显著增加，并且如图12所示，第8天的胚泡平均百分比示出了在t0svfem组中每个卵母细胞的胚泡百分比增加。两个svfem组在第7天和第8天的胚泡转化均显著低于常规对照精液(图18和图19)。根据本发明的一方面的增强的培养基调配物导致较少卵裂。如图17所示，两个svfem组的卵裂均显著低于常规对照物。svfem扩展剂在进行性别鉴定前成功地维持活动的活精子群体24小时，并且产生了符合质量控制标准的冻融的经过性别鉴定的精液，其中与当前的标准操作程序相比，批次失效的风险没有增加(例如，如图23到26所示)。因此，使用调配物有可能增加对总射出精液体积的利用率并且同时增加每份射出精液产生的授精剂量的数量，从而增加农民使用经过性别鉴定的精液的可用性。根据本发明的培养基调配物将精子维持在有受精能力的状态。受精能力包含但不限于，暴露于根据本发明的培养基调配物的精子细胞在体外以及在体内通过人工授精和受精、卵裂或胚泡转化产生妊娠的能力。在用来自20头公牛的分裂的射出精液执行的ivf试验中，经过svfem处理的射出精液展现出受精能力，在试验期间每头公牛收集了三次。如图4所示，这最终证明了svfem扩展显著影响经过性别鉴定的精液的胚泡形成。活动细胞数量指示冷冻后细胞存活率与经过性别鉴定的对照精液相比没有差异，并且对3份配对射出精液的ivf评估表明，对照物与svfem扩展的射出精液之间的胚泡转化类似。在一个实施例中，根据本发明的培养基调配物包含抗氧化剂，所述抗氧化剂是专门添加的以减少性别鉴定过程期间细胞所承受的应力的量。所有精子在性别鉴定过程期间暴露于uv光，这通常会对dna造成氧化损伤(而不是直接的链断裂)，并且精子在冷冻保护步骤中可能承受升高的活性氧类(ros)(aitken等人,2015；farber,1994)。ros也会造成dna损伤，如单链和双链断裂以及碱基对修饰(richter等人,1988)。fatehi等人(2006)报道，用dna受损的牛精子受精的卵母细胞展现出与对照物类似的卵裂速率，但在受损的实验组中，进一步的发育停止。通过本发明的培养基调配物来减轻dna损伤，如由与经过性别鉴定的对照精液产生的胚胎相比，用svfem处理的精子细胞以更高的胚泡转化通过类似的卵裂速率所示。这指示在非扩展的精液组中有更高程度的dna损伤。鉴于平行观察，svfem扩展剂减轻了由性别鉴定造成的dna损伤。与非扩展的配对对照物相比，用本发明的培养基调配物处理的精子细胞的每个卵母细胞产生更多胚泡。在同一天扩展(t0)并进行性别鉴定的svfem和在进行性别鉴定之前扩展24小时(t24)的svfem(总共60份射出精液表示了来自3个品种的20头公牛)符合用于经过性别鉴定的精液质量的商业要求。测试每份射出精液每次处理后冻融的精子渗透卵母细胞、卵裂并产生胚泡作为配对的样品的能力。通过荧光显微镜来量化单精子和多精子受精卵母细胞。目测评估胚胎发育，并且在处理组之间进行比较，以鉴别由svfem扩展造成的任何差异。用根据本发明的培养基处理的精子展现出比非扩展的对照物更少的dna损伤。使用专门检测氧化碱基对的经过修饰的彗星测定，在来自三个处理组svfemt0、svfemt24和对照物的冻融的经过性别鉴定的精液中量化dna损伤。本发明的培养基调配物对ivf结果提供有益的效果，所述结果被测量为在受精后第7天和第8天测量的卵裂和胚泡转化率。这些有益效果可能至少部分是由于减轻了由性别鉴定造成的dna损伤。本发明的培养基调配物还允许增加每份射出精液的运行时间，并且由此增加每体积所收集的射出精液的冷冻的经过性别鉴定的精液产品并降低每个授精剂量的成本。这使得经过性别鉴定的精液产品对将会从在其养牛场使用经过性别鉴定的精液中获利的农民是更加广泛可用的。进一步地，扩展剂不仅适用于冷冻的经过性别鉴定的牛精液，而且还可以应用于在需要扩展运输时间或特别是用于保存质量受损的射出精液的环境中扩展新鲜射出精液的寿命。精子细胞的收集和使用是动物养殖和育种的核心部分。精子细胞是从雄性动物以原始射出精液的形式收集的，并且在进一步使用前必须将其储存。储存可以包括数小时或甚至数天。另外，通常在使用前以一种或多种方式操作细胞样品。因此，重要的是在整个过程中维持细胞的活力和功能。发明人已经开发出使功能性的有受精能力的精子的回收和包装最大化的培养基。这可以通过耗尽精子、优化公牛更换并且减少对备用射出精液的需求来提高生产的灵活性和效率。另外的优点是增加了加工后(例如，性别鉴定)回收的活动细胞。当使用本发明的培养基加工精液样品时，看到活性增加。活性增加可以是活力增加、活动力增加或两者。而且，使用本发明的培养基允许在加工后具有更大的精液样品产量。通过使用本发明的培养基实现的其它优点是减少了对多次收集射出精液或将动物移动到加工现场的需求。另外，由于本发明的培养基维持了生殖细胞的活力和活动力，因此本发明的培养基可以允许运输射出精液以进行进一步加工(例如，性别鉴定)。这消除了移动和隔离动物的需要。对原始射出精液的加工可以包含许多下游应用，包含但不限于分选、性别鉴定(选择带有x染色体或带有y染色体的细胞)、冷冻、人工授精和ivf(在有性别鉴定的情况下和在无性别鉴定的情况下)。在一些实施例中，这可以包含冷却和运输样品、将精子细胞浓缩以及在染色/性别鉴定之前悬浮。生殖细胞样品的来源通常来自通过本领域通常已知的方法获得的射出精液。射出精液样品可以是单一来源或者是合并的。在一些实施例中，考虑了体外产生或扩增的精子细胞群体。样品获自动物，优选地哺乳动物；更优选地牲畜；样品最优选地获自猪或牛。在一些实施例中，组合物被用作“保持培养基”以储存原始射出精液并最小化生殖细胞组分的损失。在其它实施例中，组合物用作用于加工用于进一步加工(如例如，性别鉴定)的生殖细胞样品的培养基。在另外的实施例中，组合物被用作“保持培养基”以在加工之后并且在用于育种程序之前储存分离的精子细胞。这也可以称为“扩展剂培养基”，因为当使用本发明的培养基时，样品保持活力的时间更长。在某些实施例中，包括生殖细胞和本发明的“保持培养基”的组合物维持持可接受的活力和/或活动力数小时；在特定实施例中，扩展持续24小时。在其它实施例中，本发明的组合物在整个细胞加工过程中维持可接受的活细胞水平；在特定实施例中，在整个加工的性别鉴定持续时间中，死细胞的百分比≤25％。可以以多种方式将样品与改善的培养基组合。可以在收集原始射出精液后的设定时间量内，在收集原始射出精液样品后直接添加培养基；或将原始射出精液直接收集到培养基中。与暴露于现有的常用保持培养基的精子相比，暴露于本发明的培养基的精子细胞随时间推移展现出增强的活动力、活力和功能性(包含使卵子受精的能力)。因此，这些培养基可以提高常规精液生产和经过性别鉴定的精液生产两者的产量。本发明的培养基使功能性的有受精能力的精子的回收和包装最大化。本公开涉及在整个储存和加工过程中改善生殖细胞活力和活性的组合物。在一方面，组合物包括具有至少一种添加剂的碱盐培养基，所述至少一种添加剂选自由以下组成的组：抗氧化剂、磷脂酰丝氨酸(ps)、香豆素化合物或吡喃香豆素化合物、氯化锌、辅酶q10、非甾体抗炎药(nsaid)、亚麻酸、脂肪酸、d-天冬氨酸以及其组合。在一些方面，组合物含有氟化钠。这些组合物充当用于储存和加工生殖细胞的改善的培养基。在一些方面，组合物包括非甾体抗炎药(nsaid)，所述nsaid是能够主要通过抑制环氧合酶(cox-1和/或cox-2)来减轻炎症的一类药物和化合物。组合物可以包含一种或多种nsaid，所述一种或多种nsaid包含但不限于：水杨酸盐，包含阿司匹林(乙酰水杨酸)、二氟尼柳(多洛比德(dolobid))、水杨酸和其它水杨酸盐以及双水杨酯(disalcid(双水杨酯制剂))；丙酸衍生物，包含布洛芬、右旋布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、右酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪和洛索洛芬；乙酸衍生物，包含消炎痛、托美汀、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、醋氯芬酸和萘丁美酮；烯醇酸(昔康类)衍生物，包含吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈恶昔康、氯诺昔康、伊索昔康和苯基丁氮酮(保泰松(bute))；邻氨基苯甲酸衍生物(芬那酯类)，包含甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸和托芬那酸；选择性cox-2抑制剂(昔布类)，包含塞来昔布、罗非昔布、伐地昔布、帕瑞昔布、罗美昔布、依托昔布和非罗昔布；磺酰苯胺，包含尼美舒利；以及其它nsaid，包含氯尼辛、利克飞龙(licofelone)和h-哈巴苷(h-harpagide)(在玄参或南非钩麻中)。在一些实施例中，组合物包括香豆素化合物或吡喃香豆素化合物。在某些实施例中，香豆素化合物或吡喃香豆素化合物包括紫花前胡素。在一些实施例中，碱盐培养基是合成的附睾尾血浆(cep2)，所述cep2在文献(1)中进行了描述。此制剂含有氯化钠(nacl)、氯化钾(kcl)、二水合氯化钙(cac12(h2o)2)、六水合氯化镁(mgc12(h2o)6)、碳酸氢钠(nahco3)、二水合磷酸二氢钠(nah2po4(h2o)2))、磷酸钾(kh2po4)、果糖、山梨糖醇、牛血清白蛋白(bsa)、tris碱和柠檬酸。在一个实施例中，本发明的培养基含有cep2作为碱盐培养基以及添加剂磷脂酰丝氨酸(ps)、紫花前胡素、氯化锌、辅酶q10、乙酰水杨酸(阿司匹林)、亚麻酸、脂肪酸、d-天冬氨酸和氟化钠。考虑将其它碱盐培养基用于产生本发明的培养基。在一个实施例中，考虑了蒂罗德氏白蛋白乳酸丙酮酸盐(tyrode'salbuminlactatepyruvate)(talp)。蒂罗德氏是含有氯化钠(nacl)、氯化钾(kc1)、磷酸二钠(na2hpo4)、碳酸氢钠(nahco3)和六水合氯化镁(mgcl2(h2o)6)的等渗溶液制剂。在一个实施例中，ph为约6.6到6.8。碱盐培养基在其中具有添加剂以带来所需的性质并产生本发明的培养基。在一方面，添加剂包括磷脂酰丝氨酸(ps)、紫花前胡素、氯化锌、辅酶q10、乙酰水杨酸(阿司匹林)、亚麻酸、脂肪酸、d-天冬氨酸、氟化钠以及其组合中的一种或多种。在一些实施例中，所有添加剂均包含在调配物中。在其它实施例中，紫花前胡素、氯化锌、辅酶q10、乙酰水杨酸(阿司匹林)、亚麻酸、脂肪酸、d-天冬氨酸或氟化钠中的一种或多种被省略。添加剂成分的浓度范围示于表1中。表1：添加剂成分的浓度范围组分大致浓度范围磷脂酰丝氨酸0-5mm(2mg/ml)紫花前胡素0-10um氯化锌0-10ug/ml辅酶q100-50ug/ml阿司匹林0-1mm亚麻酸0-5ng/ml脂肪酸补充剂0-1ul/mld-天冬氨酸0-500ug/mlnaf0-6mm具体地，发明人发现磷脂酰丝氨酸(ps)是关键成分(图9)，磷脂酰丝氨酸替换了常用保持培养基中的其它磷脂(例如，磷脂酰胆碱)。尽管考虑了其它磷脂，但已证明ps优于其它磷脂。这是令人惊讶且意外的发现。含磷脂酰丝氨酸的培养基可能难以调配，并且在本领域中普遍接受的是不需要磷脂酰丝氨酸或磷脂酰丝氨酸的替代品就足够了。在一些方面，考虑的以下组合物是精子细胞组合物，所述精子细胞组合物包括精子细胞和以下中的一种或多种：磷脂酰丝氨酸(ps)、紫花前胡素、氯化锌、辅酶q10、乙酰水杨酸(阿司匹林)、亚麻酸、脂肪酸、d-天冬氨酸、氟化钠以及其组合。组合物可以包含精液流体组分。在一些方面，考虑了精子细胞的容器，所述容器包括多个精子细胞、碱盐培养基和以下中的一种或多种：磷脂酰丝氨酸(ps)、紫花前胡素、氯化锌、辅酶q10、乙酰水杨酸(阿司匹林)、亚麻酸、脂肪酸、d-天冬氨酸、氟化钠以及其组合。容器可以进一步包括精液流体组分。此类容器可以用于储存或用于如ivf或ai等另外的程序。在其它方面，考虑了产生从生殖细胞形成的增强的受精卵/胚泡的组合物(即，生殖细胞的受精增加或活性增加)。在一方面，组合物包括具有磷脂酰丝氨酸(ps)、紫花前胡素、氯化锌、辅酶q10、乙酰水杨酸(阿司匹林)、亚麻酸、脂肪酸、d-天冬氨酸以及其组合中的一种或多种的碱盐培养基。在一些方面，组合物还含有氟化钠。在此类组合物中，通过活动力、受精或两者的量度来维持或甚至增加所储存和/或操作的样品的生殖细胞活性。可以通过胚泡形成来测量受精。发明人已经发现，本发明的培养基提高了ivf和/或ai中的经过性别鉴定的精液受精率。可以通过本领域已知的方法和程序执行体外受精。影响ivf成功的因素很多，包含但不限于卵子的来源；精子样品和另外的加工/操作；受精、受精步骤期间培养基组分/精子细胞的存在度/浓度；以及胚泡形成/胚胎发育期间培养基组分的存在度/浓度。培养基可以以多种方式与细胞组合，例如通过使用设定体积的培养基；培养基与样品的设定比率或相对于样品的测量方面(即，精子细胞浓度)以设定体积提供的培养基。在某些方面，将培养基添加到样品，在其它实施例中，将样品添加到培养基。在其它实施例中，将样品和培养基两者都添加到第三容器/储器。通过以下实例说明本公开的一些方面和实施例。提供这些实例以描述技术的具体实施例，并且这些实例不限制本公开的范围。本领域的技术人员将理解，本公开的全部范围由附加在本说明书后面的权利要求以及这些权利要求的任何变更、修改或等同物来限定。实例1性别鉴定程序要求精子幸免于大量损害，而初步数据证明，svfem扩展剂促进在收集后长达36小时内成功进行性别鉴定，但尚未评估已扩展精子的受精能力。尽管科学家们试图将体外精子特性与受精结果关联，但是还没有这样的测定方法成为黄金标准。对质膜、细胞内结构进行的细胞评估以及用casa系统或用牛宫颈粘液渗透测试(bcmpt)对速度参数进行的测试在其与ivf或ai生育力的关系方面往往存在相互矛盾的结果。例如，质膜pi染色完整性对于januskauskas等人(2003)来说与野外生育力相关，而对于oliveira等人(2012)来说则无关。此外，在bcmpt中行进的距离呈现出与nrr相关(tas等人,2007；bacinoglu等人,2007)，但此测定方法并不与ivf结果密切关联(keel和schalue,2009)。这些相互矛盾的结果阻止了将精子活力或活动力测量结果与在ivf或ai中的性能关联。因此，准确评估精子的生育力需要执行ivf或ai。虽然将svfem扩展应用于商业产品需要进行ai试验，但是ivf试验量化了卵裂和胚泡转化率，从而提供了对生产的胚胎数量发生明显变化的潜在机制的见解(bermejo-alvarez等人,2010；blondin等人,2009；greve和madison,1991)。此ivf试验中的量化结果将包含第7天和第8天的受精百分率、卵裂转化率和胚泡转化率。用于量化胚泡发育的这两个时间点基于使用经过性别鉴定的精液示出ivf发育延迟的文献(lu等人,1999)并且将指示svfem扩展是否会改变胚胎发育率。尽管尚未确认ivf与ai性能之间的相关性(holden等人,2016)，但是ivf试验也是对早期胚胎时间点的较低风险评估，因为它不涉及使动物妊娠，如果没有产生可行的妊娠，那么使动物妊娠可能对动物的健康有害或者可能对农场的财务产生影响。如果此试验成功，那么还将会通过ai现场试验对实际妊娠和产犊率进行进一步的解释或ivf胚胎移植产生胚泡。基于在用svfem温育后冷冻之后测得的速度数据以及图4中用三份配对的射出精液进行的初步ivf评估，猜测用svfem培养基进行延伸将表现得与未扩展的射出精液一样。经过svfem扩展的射出精液与非扩展射出精液在ivf中表现得一样的能力将会验证，svfem扩展剂可以用于经过性别鉴定的精液产品中并且仍然允许受精和早期胚胎发育。这增加了可用于对射出精液体积进行性别鉴定的时间，并且将会允许每体积收集的射出精液产生的经过性别鉴定的授精剂量的数量增加。此产量增加将会使农民更容易获得这些经过基因验证的具性别偏斜的授精剂量。材料和方法：下面概述了培养基配方。ivf可测试单位生成设计：此研究利用了来自荷斯坦牛、娟姗牛和安格斯牛(angus)这三个品种的公畜。所述研究设计包含从20头独特公畜进行三次射出精液收集以产生经过性别鉴定的精液单位，以防止单头公牛的变异显著地使数据偏斜。使用初步数据进行的前瞻性功效计算指示，对于从分裂的射出精液设计(包括两个svfem处理组和成对的对照组)得出的胚泡转化结果，从20头公牛获得的三份收集将会提供0.9或更高的统计功效。收集的最终品种合计为16头荷斯坦牛、2头娟姗牛和3头安格斯牛公畜。在单位收集期间，这些公牛的年龄范围在1.5到9.5岁之间。美国育种服务社(americanbreedersservice)提供了排名为1到5星的野外生育力(自然交配)星级，使得最佳计算的生育力被呈现为排名为5星公牛。在此试验期间收集的射出精液来自整个星级排名范围(从无排名到5星)的公畜。这允许调查svfem扩展剂如何影响野外生育力排名从高到低的公畜的射出精液，以及所述扩展剂是否以不同方式影响不同年龄或品种的公畜。按照下面详细概述的标准生产程序来加工被选择用于此试验中的射出精液。在传入质量检查期间，对授精剂量、冷冻棒(freezecane)和所有相关文件进行盲标。这是为了防止技术人员在冻融之后以及在ivf结果量化评估期间对质量控制评估产生偏见。在加工后，将经过性别鉴定的精液包装起来并按照标准sop在定期计划生产冷冻期间冷冻。在一周的单位生成内，由受过训练的qc技术人员执行传出质量控制测量。填写融化后活动浓度和细菌污染的存在/不存在。授精剂量必须通过标准生产传出质量控制参数才能用于ivf试验。ivf试验：ivf由两个不同的设施执行。为了防止ivf期间的设施间差异，每个设施都并行测试了它们各自的ivf方案，因为所述方案有所不同。在多孔板中和在矿物油液滴中测试了受精和成熟之后，鉴别出最佳方案。按照相同的方案，在两个设施处针对ivf使用来自相同射出精液的授精剂量，并且比较卵裂和胚泡转化率。一旦在两个设施处验证了方案并且实现了设施之间公平的胚泡转化率，就对由svfemivf产生的授精剂量进展进行测试。在图5中直观地概述了方案。每个设施针对每份单独的射出精液接受三个治疗组。每份分裂的射出精液的三个处理组同时用于使来自同一批合并的屠宰场卵母细胞的卵母细胞受精。同时运行先前已验证受精能力的常规非性别鉴定对照吸管，以验证卵母细胞的活力。为了确保没有因卵母细胞质量差而引起假性发育失败，如果常规对照组在约15％的胚泡转化率下也未能发育(这指示卵母细胞质量存在问题)，则对射出精液重复进行ivf反应。在这两个设施处，受过训练的ivf技术人员执行概述的受精。受精后第7天和第8天对胚泡进行评分，然后收集并固定胚泡。为了防止由于高差异而导致结论不足，如果技术复制之间的差异大于20％，则重复射出精液。射出精液收集：所有的射出精液收集都是由经验丰富的技术人员按照标准收集程序在现场执行的。射出精液扩展和传入质量评估：使用血清学移液管来确定射出精液的体积，并将其均匀地分到两个试管中。立即在15分钟内以1:1的比率将svfem扩展剂添加到经过svfem扩展一半的分裂的射出精液。然后在隔热的冷却器中运输它们，以防止第二设施发生温度波动。到达后，向射出精液添加2％v/v的gtls抗生素溶液。在最初射出精液收集后45分钟内，收集细胞浓度和传入活动力参数。使用带有试剂s100和sp100盒的nucleocountersp-100tm(丹麦阿勒罗得市的chemometec公司(chemometecallerod,denmark))来确定浓度。通过以下操作来计算活动力特性：将10μl样品稀释在990μl活动力稀释剂中，并且用htcasaii软件以60hz的框捕获速度在具有zeiss10x物镜的37℃封闭台中在hamiltonthomeivosii上每次在具有已知腔深度的leja4腔室毛细管玻片的2个腔室中读取7个框。如果细胞浓度大于5亿/ml并且样品中前向活动细胞的百分比≥65％，则利用射出精液。用于精子性别鉴定的样品制备：在染色talp中在室温下制备经过染色的样品，所述样品在稀释到最终体积的0.06mg/mlhoechst33342中包含200m/ml精子细胞。然后将样品在37℃水浴中温育45分钟。45分钟后，以2:1v/v的比率将红色染色talp添加到经过染色的样品中。然后倒置将样品+红色talp彻底混合、使用20μmpartec滤网(partec#04-0042-2315)进行过滤并等分到5ml圆底试管中。性别鉴定细胞仪指标：然后使染色的经过过滤的样品在专有的性别鉴定细胞仪上运行。将样品吞吐量调整为17,500个细胞/秒，并且聚焦检测和击杀激光。为了确认正确的激光聚焦，在收集性别偏斜样品之前执行击杀计数评估。成功的击杀计数具有这样的群体：死亡数≥75％，并且切片数≥95％，其中至少200个细胞被计数。如果仪器无法达到上述指标，则不用仪器收集性别偏斜精液。在成功的击杀计数后，放置门以收集x染色体细胞，所述细胞是具有如用355nm波长激发激光测得的较亮的hoechst33342荧光的细胞群体。在设置仪器后15分钟并且在放置最后一个样品收集试管后15分钟收集细胞仪性能指标，所述细胞仪性能指标包含每发射荧光强度的事件的直方图中的y峰的高度、x峰的高度、波谷的高度、门控％和死亡％。性别偏斜样品收集和加工：运行样品以收集300ml和400ml性别偏斜样品，所述性别偏斜样品的组成为约17％trisa缓冲液、80％鞘液和2％细胞样品。将样品收集在包含5mltrisa的50ml锥形试管中，并且在替换之前将每个试管填充至最大体积30ml。在收集到所需的总体积后，在室温下以2400xg将经过性别鉴定的精子离心10分钟。抽吸上清液并丢弃以达到1ml的团块体积。在重新悬浮后，将17μlgtls抗生素溶液添加到每个团块中。然后将试管放入装有150ml室温水的烧杯中以防止冷冲击，并且然后将其转移到4℃冷室中。在4℃下平衡90分钟后，通过间隔15分钟3次单独添加trisb(含有甘油)至样品最终浓度为20％v/v来对样品进行冷冻保护。使用hamiltonthorneivosii来确定前向活动细胞的浓度，其中将htcasaanimalbreedersii软件设置为与上文列出的相同的捕获设置，但使用氙气光源和olympusl0xuplansapo物镜。将冷冻保护的样品在包装扩展剂(packagingextender)中稀释到最终活的活动细胞浓度为2.5m/ml，并使用mx4吸管灌封机(美国明尼苏达州枫树林市的imv科技公司)将其置于保持0.25ml体积的微型吸管(ministraws)(美国明尼苏达州枫树林市的imv科技公司)中。在储存于液氮中之前，将装满的吸管用冷冻隧道快速冷却。传出质量控制评估：为了评估在冷冻过程中存活下来的活动力细胞的数量，将单个吸管在37℃水浴中融化45秒。然后将吸管插入预热的eppendorf试管中。然后将样品轻轻涡旋10秒以匀化样品。在这之后，将20μl样品添加到20μlqc稀释剂中、轻轻涡旋5秒并且在上述casa荧光设置下读取。将其余的吸管体积分散在血琼脂板上并且在37℃下放置24小时，之后对细菌菌落进行计数。体外受精和评估：卵母细胞制备：通过以下来制备四孔受精板：用400μlbo-ivf(威斯康星州维罗纳的mofa公司(mofaverona,wi))填充所有4个孔，并在37℃的5％co2中平衡至少1小时。同时，制作填充有450μlbo-ivc(威斯康星州维罗纳的mofa公司)的四孔胚胎培养板，并在37℃的5％co2、5％o2下平衡。将在这些受精期间使用的每批bo-ivc的样品等分，并储存在-80℃下作为对照培养基，以用于评估条件胚胎培养基。卵母细胞和受精卵的所有处理均使用热拉制玻璃移液管完成。通过抽吸从屠宰场卵巢中收集卵丘卵母细胞复合体(coc)。将coc在卵母细胞成熟培养基(威斯康星州维罗纳的mofa公司)中保持温暖，并在37℃加热台上进行处理。将coc分组并且分到4孔板中的3个孔中、每个处理组60个卵母细胞。精液制备：将每个处理组的三个授精吸管在37℃下融化45秒。然后将它们分层放置在80％bovipuretm密度梯度(瑞典的尼达康国际公司(nidaconinternationalab.sweden))上。将样品在500xg下离心15分钟、靠近团块进行抽吸并且然后重新悬浮于温tlhepes(威斯康星州维罗纳的mofa公司)中。将它们在300xg下离心5分钟、抽吸至100μl，并且将团块重新悬浮于所述小体积中。将5μl样品等分试样添加到95μl4％nacl中以固定细胞，并且使用血球计量化细胞浓度。具有可见膜损伤的细胞不计入细胞密度计算。将精子悬浮液以每孔120万个精子(20,000个精子/卵母细胞)添加到包含coc的孔中。卵丘卵母细胞复合体去除：在添加精子后24小时，将来自同一处理组的coc合并在包含0.5mltlhepes和1mg/ml透明质酸酶的15ml锥形试管中。将coc涡旋1分钟、放回37℃加热块中1分钟并且再次涡旋1分钟。将推测受精卵在tlhepes板中洗涤，并且然后放置在包含成熟培养基(威斯康星州维罗纳的mofa公司)的胚胎培养板中，所述胚胎培养板在使用前已平衡24小时(上文的卵母细胞制备)。然后将包含推测受精卵的板放置在37℃的5％co2、5％o2下以进行ivf试验的其余部分。发育评估：在8天的受精后温育期间执行三次发育评估。在初始受精后48小时，量化卵裂事件。胚泡根据其发育阶段以是/否胚泡的二进制标度进行评分。如果胚胎至少达到了早期胚泡阶段，则将其评分为胚泡。没有记录早期的、扩张的和孵化的胚泡之间的差异，也没有对胚泡进行评分，但是固定了胚泡以方便将来进行表征。在初始受精后第7天和第8天均目测确定每个卵母细胞的胚泡转化。发育阶段的所有确定均由受过训练的ivf技术人员使用解剖镜在设定为37℃的加热台上完成。对早期受精事件的评估：在初始受精后24小时并且在从推测受精卵中剥离其coc后，使用专有试剂盒对20到30个受精卵的子组进行固定和染色，所述专有试剂盒被创建以评估单精子/多精子事件。dna染色剂为hoechst33342。所有推测受精卵均以以下4个类别中的1个进行评分：单精子受精、多精子受精、未受精或其他。另一类别包括受精卵存在，但是由于来自未完全去除的coc的模糊荧光或者因为受精卵碎裂而无法进行评分。呈现有两个原核的那些受精卵被认为是单精子的，而呈现有3个或更多个原核的那些受精卵被认为是多精子的(yang等人,1993)。图6中示出了示出每个得分的代表图像的图像。对受精后第8天的样品的固定：在对第8天的胚泡转化进行最终评估后，将样品固定在invitrogentmrnalatertm(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔公司(thermofisherwaltham,mausa))中。将胚泡分为两组并放入两个试管中，以允许对基因评估进行重复测量。将退化的受精卵添加到第三试管中。将每个胚泡或退化受精卵以40μlrnalatertm添加到每个试管中，如赛默飞世尔公司所建议的以10:1v/v添加。将这些样品在4℃下放置至少24小时，但不超过1周，之后根据赛默飞世尔公司提供的操作说明将其转移到-20℃以进行长期储存。还收集来自液滴的条件成熟培养基，并将其储存在-80℃下以保存rna(vaught和henderson,2011)。统计分析：所有统计分析均使用originpro201764位软件执行。显著性阈值设置为a＝0.05。执行原始数据的变换以将数据归一化，从而允许anova分析。反正弦变换足以将所有数据归一化，除了以下两个：多精子百分比和未受精百分比，这两个数据反而使用自然对数变换来变换。结果：在此实验期间评估的最早受精卵时间点是处理组之间的受精功效。受精事件被量化为从每个处理孔中取样的经过评估的受精卵(初始卵母细胞)的总数的百分比。为了实现报告的原始数据的正态分布，对所有数据集执行反正弦变换，除了以下两种：多精子事件和未受精事件，这两种需要自然对数变换来实现常态。在originpro(未示出)中执行常态测试。各组之间的单精子事件无显著差异，其中t0svfem处理组为55.7％单精子受精，对照物为45.3％(bonferroni平均值比较t0相对于对照物p＝0.240)，并且t24svfem为54.3％，相对于对照物p＝0.651(图8)。与对照物相比，svfem处理组中未受精卵母细胞的发生率显著较低；对照物＝45.2％，t0svfem＝26.0％，并且t24svfem＝23.7％未受精卵母细胞，(图9，anovap＝0.002，bonferroni平均值比较t0svfem相对于对照物p＝0.004，并且t24svfem相对于对照物p＝0.014)。多精子事件的百分比在经过svfem处理的样品中呈现为升高，其中对照物为8.7％多精子受精，t0svfem为17.1％，并且t24svfem为20.0％，但经过对自然对数变换数据的单向anova，在各组之间无显著差异，总体p值为0.279(图7)。这些数据指示，svfem处理组展现出更多的总受精事件，在这些具体的ivf条件下有增加多精子受精的潜在风险。通过量化受精后第2天的卵裂事件来评估胚胎发育。每个受精卵母细胞的卵裂受精卵百分比在对照物种为65.5％、在t0svfem中为74.4％并且在t24svfem中为76.0％(图10)。在两个处理组中卵裂胚胎的百分比均显著更高，其中t0相对于对照物的bonferronip值为0.002并且t24相对于对照物的bonferronip值为0.001，这指示svfem处理组、t0和t24增加了每个受精卵母细胞的卵裂胚胎百分比。还对在受精后第7天量化的每个卵母细胞的胚泡百分比进行反正弦变换，以促进anova分析。对于对照物、t0svfem和t24svfem，第7天的平均胚泡百分比分别为9.0％、12.4％和11.7％(图11)。两个处理组均与对照物有显著差异，其中bonferroni平均比较为t0svfem相对于对照物p＝0.008，并且t24svfem相对于对照物p＝0.002。这些数据证明，与未扩展的经过性别鉴定的对照精液相比，在受精后第7天，通过经过svfem处理的精子受精的每个卵母细胞的胚泡转化增加。对胚胎发育的最终评估在受精后第8天执行。对于对照物、t0svfem和t24svfem，每个受精卵母细胞的平均胚泡百分比分别为12.7％、16.1％和15.0％(图12，n＝46)，其中经过性别鉴定的对照物与t0svfem之间存在显著差异(p＝0.037，bonferroni平均值比较)。对于t24svfem相比于对照物，p＝0.143。在同一天进行性别鉴定的经过svfem扩展的精子的受精将每个受精卵母细胞的胚泡数增加了3个百分点，或增加了25％，如在第8天对分裂的射精的经过性别鉴定的对照物测量的，并且在24小时温育后进行性别鉴定的经过svfem扩展的射出精液展现出的胚泡转化率与非扩展的经过性别鉴定的对照精液无统计学差异。由于单精子事件可能增加，执行pearson相关分析以确定单精子受精百分比是否与第8天的胚泡数量相关。在pearson相关中计算的p值<0.001，这表明这两个结果之间存在正相关。执行另外的分析以确定在第8天测量的胚泡转化差异是否可以归因于品种、星级排名或公牛年龄。在此试验期间，通过对用ivf评估的所有收集的射出精液的结果取平均来计算每个公牛在第8天的每个受精卵母细胞的平均胚泡百分比。基于图14中的品种、图15中的星级排名和图16中的年龄范围将公牛分开而生成的散点图没有揭示任何必然趋势。分到这些类别中的情况并不均匀，并且通常至少一个类别仅由一个公畜表示，这限制了从此分析得出统计结论的能力。第二组分析比较了经过svfem处理和性别鉴定的精液对照物与用作卵母细胞质量对照物的常规非性别鉴定精液。对于在ivf试验期间测量的所有参数；卵裂、第7天每个卵母细胞的胚泡以及第8天每个卵母细胞的胚泡，常规非性别鉴定对照精液显著大于两个处理组和经过性别鉴定的精液对照物(anova，p<0.001，图17、图18和图19)。没有通过单精子分析来评估常规精液的受精效率。这些数据示出了，尽管与经过性别鉴定的对照精液相比，经过svfem处理的射出精液的卵裂或胚泡转化率可以增加，但精液扩展剂并未增加、使精子受精性能达到与未性别鉴定的常规精液相当的水平。讨论：上面概述的结果指示，经过svfem处理的射出精液产生了有受精能力的精子，由与非扩展对照物相比以统计学上类似的百分比在两份svfem射出精液中发生的单精子受精事件证明。这些受精受精卵也能够经历胚胎发育经过在大约8细胞阶段(viuff等人,1996)活化胚胎转录物的点并且到形态学上评估的胚泡阶段。在p值<0.001的pearson相关系数测试中，单精子受精的数量与在第8天计数的平均胚泡数量呈正相关，这表明第8天的胚泡转化的增加可能是由于单精子受精的增加。基于历史出版物，任何测试组的多精入卵发生率均不呈现出超过预期水平。先前的工作使用未性别鉴定的精液将牛ivf中成熟卵母细胞的多精子发生率量化为约15％(cebrian-serrano等人,2012)。对照物、t0svfem或t24svfem这些组均未证明多精子受精发生率显著高于文献所报告的针对常规未性别鉴定精液的15％(单侧t测试)。但是，没有用原核染色来评估产生的常规未性别鉴定精液的受精受精卵，因此无法得出具体测试条件下多精子事件的数量与未性别鉴定的牛精液的直接比较。用svfem处理组的第7天胚泡转化与用仅第8天的t0svfem实现的显著性之间的差异产生了以下问题：处理组中的胚泡数量是否早于对照物达到胚泡阶段，或者对照胚泡数量在第7天与第8天之间是否比svfem处理组增加得更快。在查看第7天与第8天之间的差异时，可以看到平均而言，所有组均增加了约3.5％，这表明在所有测试组中，第7天与第8天之间的增加是一致的。进一步地，各组之间的第7天到第8天的胚泡百分比差异没有显著差异，这将会立即解释第7天与第8天之间的显著性差异，第7天与第8天之间的胚泡变化百分比的总体anova得出p值为0.723。但是，从第7天到第8天的平均变化来看，anova具有低功效0.10。在图13中可以看到比较测得的差异的箱线图。从收集到的数据无法确定失去t24svfem与经过性别鉴定的对照精液之间的显著性的原因。在此ivf试验期间受精和胚胎发育事件的增加可以归因于一些不同的理论机制。首先是经过svfem处理的精子细胞对bo-ivf培养基中的肝素剂量的响应性更强。艾华津生物技术公司(evergenbiotechnologies,inc.)的先前工作证明，受精培养基中的定制的肝素计算水平可以导致用经过性别鉴定的精液执行的ivf中的胚胎发育增加。这是因为来自不同公畜的射出精液对肝素活化的敏感性不同(xu等人,2009)。此试验中使用的肝素化培养基具有恒定剂量的肝素，因此svfem扩展剂可以影响精子对肝素作出反应的能力，从而改变受精和胚胎发育率。为了测试此猜测，可以在ivf试验中评估经过svfem处理的授精剂量，所述ivf试验使用可变的肝素浓度来确定单精子受精和胚泡转化是否随肝素剂量的变化而改变。第二种可能的机制是svfem可以在用svfem扩展剂温育期间使精子获能。必须完全获能以允许与透明带相互作用(yanagimachi,1994)。虽然不能完全理解整个获能过程，但是钙有助于触发获能过程。还已知钙增加由获能活化的超活化(lopez和jones,2013)。获能完全导致超活化，超活化进而导致更有效的运动和授精(smith和yanagimachi,1989)。已知svfem调配物含有钙，延长的温育导致获能增加，这进而导致精子在比其未处理对照组更短的温育期后准备受精。为了测试此理论，将会冻融的经过svfem处理并配对的对照精液的活动力参数进行融化并在bo-ivf获能培养基中温育，并比较测得的速度。也可以使用荧光显微镜可视化顶体反应来测定获能。第三种可能是svfem扩展剂中存在的抗氧化剂可以在性别鉴定过程期间将精子中的氧化应激和dna损伤最小化，从而最终改善胚胎发育。在性别鉴定过程期间用于在所有精子中激发hoechst的uv光产生ros，所述ros可以导致链断裂和氧化碱基对损伤(richter等人,1988；kong等人,2009)。由辐射诱导的精子dna损伤妨碍了胚胎发育的后期阶段，但不改变初始受精或卵裂率(fatehi等人,2006)。与对照物相比，svfem处理组的卵裂率和胚泡发育均显著改善，这表明svfem扩展不仅仅可以影响细胞行为的单一差异。从ivf试验期间收集的数据得出的首要结论是：在所有评估的参数中，t0svfem在ivf中表现得优于配对的对照物。t24svfem在每个卵母细胞的卵裂和胚泡第7天转化中也表现得优于对照物，并且在其他测量结果中与对照物表现得没有显著差异。实际上，在anova中与t0svfem和对照精液相比，即使t0svfem显著大于对照非扩展精液，t24svfem处理样品也示出其与任一组都没有差异。这指示t24svfem样品表现得至少与对照物一样，同时其表现得也不比t0svfem差很多。因此，用svfem扩展并在性别鉴定前温育长达24小时产生了经过性别鉴定的精液产品，所述精液产品使卵母细胞受精并导致早期胚胎发育事件与非扩展性别鉴定精液类似或比其更好。在开始性别鉴定过程之前增加时间，同时维持使卵母细胞受精并正常地产生卵裂及形态上正常的胚泡的能力是对当前程序的重大改进，因为其增加收集的每射出精液体积中经过性别鉴定的精液授精剂量的数量。尽管此早期测试阶段不评估所产生的推测胚泡的活力，但视觉评估正常的胚泡结构的产生确实证实了经过svfem处理的细胞能够受精并完成早期胚胎发育，而不仅仅是活化胚胎转录物。在我们的经过性别鉴定的精液产品中可以实施svfem之前，必须完成接下来的测试以评估体内受精效率以及妊娠和产犊率。实例2将两个公畜的射出精液作为分裂射出精液进行加工，一半产生经过性别鉴定的对照精液，而另一半产生经过24小时svfem扩展后进行性别鉴定的精液。将相对受孕率报告为[(svfem扩展妊娠％)/(对照妊娠％)]*100。对于公畜1，相对svfem/对照受孕率(相对受孕率)为92％。对于公畜2，相对受孕率为126％。两者之间的平均值为109％。此数据指示，用经过24小时svfem扩展的精液可以实现妊娠。初始数据点、受孕率呈现出与对照物类似。实例3表2：pearson相关系数值将ivf结果与在测试稀释培养基中融化后进行的速度测量相关。那些突出显示的内容指示斜率值在a＝0.05时显著不同于零。报告的r2是调整后的r2值。培养基配方：除非另有说明，否则所有化学品都是通过西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich)购买。台氏液(tyrode's)：1升h2o94.5mmnacl3mmkc1300μmna2hpo410mmnahco3400μmmgcl2*6h2o同渗容摩180到190mosm用0.22μm瓶顶ptfe过滤器过滤染色talp：1升台氏液25mm乳酸钠糖浆(60％w/w)5mm葡萄糖40mmhepes0.5mm丙酮酸钠3mg/mlbsa(级分v)ph7.6同渗容摩290到320mosm用0.22μm瓶顶ptfe过滤器过滤红色talp：1928ml染色talp60ml蛋黄12ml1％红色食品染料ph5.8静置24小时后倾析活动力稀释剂：300ml染色talp600ml红色talp用0.22μm瓶顶ptfe过滤器过滤trisa：1440ml无菌milli-qh2o160mll0xtris储液400ml蛋黄倒置以混合等待48小时后倾析将gtls添加到2％v/v倾析的trisatrisb：1012ml无菌milli-qh2o200mll0xtris储液66ml蛋黄720ml甘油2.0ml绿色食用色素0.1％gtlsv/vtrisb包装扩展剂：400mltrisa80mltrisb硫酸庆大霉素溶液：52.0g硫酸庆大霉素(粉状，amresco#0304)500ml无菌milli-qh2o泰乐菌素溶液：8.85泰乐菌素(酒石酸泰乐菌素；中西部兽医供应公司(midwestvetsupply))500ml无菌milli-qh2ogtls：4ml硫酸庆大霉素溶液3ml泰乐菌素溶液3ml利高霉素储液(50mg林可霉素/100mg壮观霉素；中西部兽医供应公司)qc稀释剂：10ml牛tf鞘液(美国德克萨斯州沃思堡市的茶塔生物系统公司(chatabiosystemsfortworth,txusa))2mltrisb240μl1％红色食品染料不含mg2+和ca2+的pbs：8gnacl0.2gkc11.44gna2hpo40.24gkh2po4ph7.4，加入1升dih2o中、过滤并在室温下储存裂解溶液：2.5m0.1medtana210mmtris-hc1ph10，过滤、在4℃下储存10％tritonx-100：10mltritonx-10090ml裂解缓冲液，在4℃下储存中和缓冲液：0.4mtrisph7.5，在室温下储存电泳溶液：0.3mnaoh1mmedtana2ph13每次使用时新鲜制成并且预冷至4℃至少1小时酶反应缓冲液：40mmhepes0.1mkc10.5mmedtana20.2mg/mlbsaph8.0制成10x储液并在-20℃下冷冻等分试样琼脂糖：用dih2o制成的琼脂糖稀释液通过英杰公司(invitrogen)购买低溶点标准琼脂糖预涂的琼脂糖玻片：将100ml1％琼脂糖溶化在玻璃烧杯中。将单面磨砂的载玻片浸入琼脂糖中。将玻片的背面擦干净。将玻片置于室温下、防尘、过夜干燥。第二天，可以在玻片盒中替换玻片以进行储存对用于核酸内切酶介导的碱性彗星测定的方法的优化自1984年由ostling和johanson进行初步测定开发以来，彗星测定已用于量化许多细胞类型中的单个细胞dna损伤。出现了使用不同电泳缓冲液ph条件的两种不同的彗星技术；被报告为量化双链断裂的程度的碱性彗星测定(singh等人,1988)以及中性彗星测定，后者对单链断裂的特异性更高(olive等人,1991)。通过添加糖基化酶和核酸酶消化步骤以揭示除链断裂以外的其它类型的dna损伤的能力，增加了彗星测定的应用(piperakis2008)。特定的核酸内切酶只在dna被氧化的地方裂解；核酸内切酶将氧化位点转化为链断裂，所述链断裂然后可按照标准彗星测定电泳量化(collins等人,2008)。精子中的dna完整性已经使用核酸内切酶介导的碱性彗星测定进行评估并且与生育力状况有关，从而证实了通过彗星测定而量化的dna损伤与精子生育力之间的相关性(bittner等人,2018(牛)；hughes等人,1996(人类)；mukhopadhyay等人，2010(牛))。先用过氧化氢给药再用核酸内切酶介导的碱性彗星测定来诱导ros的增加示出了精子中dna片段化的显著增加(hughes等人,1996)。用人工氧化的应激精子对受精进行的评估示出了，受精率受到负面影响(aitken等人,2009)。另一项关于牛的研究示出了，当卵母细胞通过特定地暴露于氧化损伤的精子受精后，胚胎发育减少(bittner等人,2018)。精子对外源dna损害特别敏感，因为它们缺乏大多数dna修复机制(aitken和baker,2006)。在精子性别鉴定过程中可以增加ros(并且因此增加dna损伤)的两个过程是用于激发在冷冻保护步骤中使用的dna结合染料和甘油的uv光(aitken等人,2015；farber,1994)。正常精子活化和获能需要低水平的ros(agarwal等人,2003；aitken和baker,2002)，但高浓度的胞内ros已示出增加了单链和双链断裂(aitken和krausz,2001)以及碱基修饰、缺失和移码(twigg等人,1998b；duru等人,2000)。由于细胞缺乏抗氧化酶，因此这些dna损害在精子中累积(aitken和fisher,1994)。累积的dna损伤可以对受精和胚胎发育产生负面影响(aitken等人,2009；bittner等人,2018)。在先前的文献中对经过性别鉴定的精子和未性别鉴定的精子中的dna双链和单链断裂进行了量化，其得出的结论是，与未性别鉴定的精液相比，经过性别鉴定的精液没有展现出增加的dna损伤水平。(boe-hansen等人,2005；gonsalvez等人,2010)。但是，这些评估是对使用beltsville法而不是使用在本申请中公开的性别鉴定程序进行性别鉴定的精子完成的，其中uv激光将不需要的细胞群体消融。此差异可以使细胞暴露于更多uv损伤并增加诱导的dna损伤，并且通过uv激光消融产生的经过性别鉴定的精液尚未以此方式进行评估。另外，先前关于经过性别鉴定的精液的dna完整性的研究未使用任何核酸内切酶处理来暴露特定的dna碱基对修饰损伤，这对于理解ros特定损伤很重要。svfem包含可以充当氧化汇的抗氧化剂和磷脂并且因此有可能减轻精子中的ros累积。核酸内切酶介导的碱性彗星测定可以用于确定svfem扩展是否减轻了在精子性别鉴定期间发生的氧化dna修饰。由于在氧化应激的精子受精的比较中，经过svfem处理的样品中的胚胎发育和受精率提高与报告的文献结果类似，因此猜测svfem扩展减轻了由性别鉴定造成的氧化dna损伤。材料和方法：上面概述了在以下实验中使用的培养基。彗星测定：整个彗星实验概况遵循hartmann等人(2003)所描述的步骤；简单地说，分离细胞、将其包埋在低溶点琼脂糖凝胶中、暴露于裂解条件下、在电泳溶液中平衡、以0.7v/cm进行电泳至少30分钟、中和、染色并成像。裂解溶液洗涤剂混合物和浓度各不相同，如裂解条件的持续时间和温度那样。对于所有实验，均包含用200μmh2o2处理的阳性对照玻片和用dih2o处理的阴性对照玻片，对于所述阳性对照玻片，将会预期看到如hughes等人,1996先前所描述的诱导的dna损伤，对于所述阴性对照玻片，将会预期仅有基线dna损伤。实验也包含核酸内切酶处理(endoiii)，对于所述核酸内切酶处理，将会预期看到由于诱导的链断裂而导致dna损伤增加(kushwaha等人,2011)。这导致包含4个处理组用于彗星测定：h2o2+endoiii(阳性/阳性玻片)、h2o2+1x酶反应缓冲液(阳性/阴性玻片)、dih2o+endoiii(阴性/阳性)和dih2o+1x酶反应缓冲液(阴性/阴性玻片)。裂解缓冲液的改变包含添加十二烷基硫酸钠(sds)或n-月桂基-肌氨酸以不同于表面活性剂的化学组成。两者都已经用于在彗星测定中成功地从基质中释放dna(ward,2013；bittner等人,2018)。基于裂解缓冲液的化学组成和实验室中先前彗星裂解尝试的结果，针对每个实验均改变裂解温度和持续时间的变化。还基于先前公布的精子彗星数据测试了包含蛋白酶k以用于鱼精蛋白去除并且包含二硫苏糖醇(dtt)以用于二硫键断裂(donnelly等人,2000；hughes等人,1996)。所有实验均以80％bovipuretm梯度开始，以从精子制备物中去除死的或切片的精子，因此仅测量了在性别鉴定和冷冻过程中存活下来的精子的dna损伤。在此梯度和离心步骤之前，包含与dna共价结合并且其激发/发射波长与用于可视化彗尾的hoechst33342不重叠的活/死染色剂叠氮溴化乙锭(ema)，以防止在彗星测定之前死亡但在bovipuretm步骤期间未去除的细胞在图像分析期间被量化。在吊桶式离心机中以500g执行离心15分钟，将样品抽吸至100μl并重新悬浮于1ml室温1xtris缓冲液中。然后将样品以300g第二次离心5分钟。吸出上清液并再次丢弃，直至100μl线。用血球计nucleocountersp-100或casa确定细胞密度。在1xtris缓冲液中稀释精子。在加入到玻片之前，在eppendorf试管中在室温下执行过氧化氢处理15分钟。将精子与1％lmp琼脂糖混合以达到1:1稀释的最终细胞浓度。将精子/lmp琼脂糖混合物快速添加到预涂的琼脂糖玻片上，并使其在冰上硬化。将玻片添加到科普林氏缸(coplinjar)中，并且执行裂解条件中的一种。用预冷的(4℃)电泳溶液在室温下进行电泳平衡20分钟，之后在0.7v/cm300ma下进行电泳30分钟。在室温下在中和缓冲液中将玻片中和并且然后风干，之后进行染色和成像。结果：与体细胞相比，精子利用了专门的dna包装系统，从而用鱼精蛋白替换了组蛋白。彗星测定不仅要求裂解细胞以使细胞核暴露于琼脂糖凝胶中，还要求对dna进行去缩合，因此其可以利用电泳场进行迁移。将彗星测定应用于经过性别鉴定的精液的第一步骤是鉴别出对dna有效地去缩合的裂解条件。实验裂解条件包含裂解温度和持续时间的变化以及用sds、肌氨酸、蛋白酶k和dtt进行的处理。每个活性裂解组分的浓度各不相同，从而根据先前报告的方案来增加浓度和/或增加温育时间。初始实验使用sds和tx-100两者作为裂解缓冲液的洗涤剂组分(ward,2013)。然而，当在裂解缓冲液中的浓度为0.5％时，sds在4℃裂解期间从溶液中沉淀出来。将裂解温度改为室温避免了sds沉淀，而细胞核仍然明显完整。在室温裂解步骤中将sds浓度增加到1％(enciso等人,2009)会产生凝胶完整性问题，并且不改善dna去缩合，如在明视野显微镜下具有透明膜的明显完整的精子细胞核所证明的那样，因此肌氨酸经过测试作为sds的取代物。n-月桂基-肌氨酸是彗星测定中用于膜裂解以及组蛋白和鱼精蛋白去除的另一种常用阴离子洗涤剂，但与sds不同，其在4℃时仍可溶。在4℃下以24小时的最长裂解时间测试了含有0.5％或1％肌氨酸的裂解缓冲液(仍包含1％tx-100)(fairbairn和o'neill,1996；bittner等人,2018)。然而，在裂解后仍可见核膜，这指示需要进一步优化。蛋白酶k(1mg/ml)通常也用于精子彗星测定裂解缓冲液中，以从dna基质中去除蛋白质(hughes等人,1996)。所述酶需要37℃温育以具有功能活性。在精子彗星测定中，结合蛋白酶k，通常还包含使二硫键断裂的还原剂dtt(2mm到5mm)(castro等人,2018；hisano等人,2013)。在初始洗涤剂裂解后，添加蛋白酶k/dtt消化步骤，其中温育的范围为3小时到24小时。但是，增加的消化步骤并不改变对彗星测定玻片上的透明核膜的观察(图20)。为了改善洗涤剂到达核膜的能力，在化学裂解之前，添加了使用具有小间隙和大间隙研杵两者(间隙为0.06mm和0.13mm)的1mldounce匀浆器(美国宾夕法尼亚州匹兹堡市的飞世尔科技公司(fisherscientificpittsburg,pausa))的机械细胞裂解步骤。机械裂解后的裂解条件包含用蛋白酶k在4℃下过夜的可商购获得的彗星测定裂解缓冲液(trevigen)+5mmdtt。此组合呈现为去除了核膜，所述核膜在明视野图像中不再可见，但是电泳后，dna仍然没有迁移(图20)。这表明dna未从鱼精蛋白中释放出来，或者这可以暗示在这些测试的电泳条件测试的过氧化氢阳性对照物所诱导的原始射出精液中没有可检测的dna损伤。阳性对照物中缺乏彗尾表明测定条件尚未优化。提出的玻片分析方案：将用zeisscalibri来捕获玻片的图像，同时注意避免彗星与玻片的边缘和任何气泡邻接，因为这些边缘和气泡会导致彗尾变形(collins,2004)。hoechst33342将被用于使用355/497nm激发/发射来可视化彗尾，并且通过504/600nm的激发和发射来观察用于排除非活细胞的ema阳性细胞。ema与dna分子共价键合并且因此在染色期间在具有完整膜的细胞中不会发出荧光，并且此键合在细胞裂解和dna变性步骤期间将不会改变。将量化每个重复玻片至少50个细胞，以提供统计严谨性(collins,2004；hartmann等人,2003；boe-hansen等人,2005；hughes等人,1996)。使用imagej的opencomet插件，将计算并分析对尾长和荧光强度的乘积值进行量化的‘olive矩’(tice等人,2000；olive和bananth,1993)。olive尾矩将被用于比较在处理组中测量的dna损伤水平。提出的统计分析：将使用originpro201864位软件执行统计分析。基于预期要收集的数据，将使用单向anova在svfem和对照处理组之间进行比较。讨论：正在进行对核酸内切酶介导的碱性彗星测定的优化。试图产生彗尾而得到的图像示出了呈精子头部形状的致密dna，这表明核基质中的dna螺旋并未完全释放。由于与体细胞相比精子中dna的致密度增加，因此需要专门对精子的彗星测定进行调整。具体的改变包含为使精子染色质去缩合而添加sds以及出于相同目的而添加dtt(rousseaux和chevret,1995)。常用的另外的改变是包含蛋白酶k以分解鱼精蛋白，精子用鱼精蛋白而不用组蛋白进行dna包装(singh等人,1989)。对裂解溶液的洗涤剂组成的优化继续并且可以包含用类似的非离子洗涤剂np-40替换tritonx-100并包含二碘水杨酸锂(lis)以进行dna去缩合。dna损伤减少：如果彗星数据指示svlem处理组中的dna修饰少于对照组中的dna修饰，则这将表明svlem扩展在性别鉴定过程期间保护精子免于dna修饰。因此，考虑到svlem扩展剂中存在的抗氧化剂，猜测此损伤减少是由于ros减少，将会准备用于在性别鉴定过程的各个阶段测定ros在精子+/-svlem扩展中的累积的设计实验。授精单元将会由用具有和不具有抗氧化剂(svlem-a)的svlem扩展的精子产生。使用endoiii进行的彗星分析将会用于评估这些测试组中存在的dna损伤。如果svlem-a组呈现的dna损伤与未扩展的对照物类似，则可以推断出抗氧化剂补充是特异性地介导的dna损伤。可以使用分光光度计测量精子中的ros含量(balamurugan等人,2018)。此实验方法依靠过渡金属在暴露于溶液中不断增加的ros水平时的颜色变化(hyashi等人,2007)。此方法还将会跟踪ros有害水平增加的累积位置并确定svlem是否阻止了所述累积。dna损伤无差异：如果对所有三个处理组的dna损伤进行评估均无显著差异，则将会猜测ivl结果的差异将会是由于活动力状况或获能状态的差异所致。在试验期间已经收集了没有活化因子的培养基中的活动力指标。已经发现不使用稀释培养基的针对casa速度指标的先前研究与ivl结果有关系(kasimanickam等人,2006)。可以计算测得的活动力参数与ivl结果之间的相关性，以确定是否存在任何关系。将收集在ivl受精程序期间使用的肝素化培养基中的另外的速度测量结果。肝素是顶体反应的活化剂并且是在体外活化精子以便受精所需要的(parrish等人,1988)。肝素会改变精子的速度特性(chamberland等人,2001)，并且未来的研究可以确定肝素化培养基中的速度测量结果是否与ivf结果相关。经过svfem处理的对照精液与未扩展的对照精液之间的获能状态差异也可以影响它们在ivf中的行为。svfem扩展剂可以具体地通过钙信号传导(lopez和jones,2013)或通过其他途径来加速获能反应。获能反应需要是完全的，之后才能进行受精，并且此反应的肝素活化需要最少四小时(parrish,2013年)。但是，如果经过svfem处理的射出精液的获能状态提前于未扩展对照物的获能状态，则精子细胞将会有能力比未扩展对照物更快地受精。可以通过对顶体的荧光染色来评估获能状态，因为获能在顶体反应完成时达到顶点(roldan和harrison,1990)。在经过性别鉴定的精液样品中没有可检测的dna损伤：如果彗星测定鉴别出阳性对照细胞中的可量化dna损伤，则用h2o2处理过的那些样品会诱导dna损伤，但在经过性别鉴定的精液样品中明显没有可量化的损伤，这可以证实使用了此核酸内切酶介导的碱性彗星测定来确定牛的经过性别鉴定的精液中的氧化性dna损伤。这也将会指示dna损伤在ivf试验中量化的差异中不起作用。可替代地，这可以指示使用仅裂解氧化嘧啶的核酸内切酶endoiii，经过性别鉴定的精液中存在的诱导型dna损伤不可见。可能还需要将核酸内切酶处理改为在不同的氧化碱基对处裂解的甲酰胺基嘧啶-糖基化酶或hogg1来完全确定存在的dna损伤的确切类型。实例4本发明培养基如下调配(指定为svfemsvfem)：将碱性盐培养基cep2(表3)与表4中的添加剂组合。表3：碱性盐培养基(cep2)化学品1x浓度nacl15mmkcl7mmcacl2(h2o2)3mmmgcl2(h2o)64mmnahco311.9mm二水合nah2po48mmkh2po420mm果糖55mm山梨糖醇1g/l牛血清白蛋白2g/ltris碱133.7mm柠檬酸42.9mm表4：svfem的添加剂浓度组分浓度磷脂酰丝氨酸5mm(2mg/ml)紫花前胡素1um氯化锌10ug/ml辅酶q1050ug/ml阿司匹林1mm亚麻酸5ng/ml脂肪酸补充剂1ul/mld-天冬氨酸500ug/mlnaf6mm在碱性盐培养基中，可以用20mmhepes((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)有机化学缓冲剂取代tris碱。脂肪酸补充剂是可从西格玛奥德里奇公司商购获得的混合物。储存在培养基svfem中的精子样品(n＝3)在保持24小时后未示出可测量的活动力降低。使用常规培养基的对照样品在同一时间段内示出有显著的活动力降低。参见图31。所使用的对照/常规培养基是本领域已知的那些，并且实例包含但不限于盐或糖(糖类)溶液，包含葡萄糖溶液。对照培养基还可以包含本领域已知的标准缓冲溶液。如果应用于常规精液加工，则不会将naf添加到培养基中。因此，一些替代性调配物不含有naf，naf可以抑制活动力。然而，测试证明，扩展24小时后，在冷冻/融化后存活下来的活动细胞数量的功效有所提高。样品加工充分稀释了精液以逆转通过naf提供的活动力抑制。因此，naf被包含在svfem中，并且也有可能结合培养基使用文献中鉴别出的其他活动力抑制剂。参见图32，其中示出了naf的作用。图2中的绘图展示了当天或在保持24小时后加工的活动射出精液中每个样品的融化后细胞的数量，其中naf的浓度不同。浓度沿x轴表示并且范围为0到6mmnaf。实例5精液样品产生：将实例1的培养基与精液以1:1的体积比混合。当在与安格斯牛的精液混合之前将培养基升温到37℃时，以及当在射精后10分钟与30分钟之间将培养基添加到精液中时，可以看到最佳性能。然而，当在射精后1小时与细胞混合时，培养基仍然有效。添加培养基之后，将细胞储存在19℃下。图3示出了，本发明的培养基svfem示出活动细胞相比于经过常规加工的样品增加了10％。在图33中，在配对t测试中，p＝0.017。实例6储存24小时后，测试对样品的细胞活动力的维持。取得来自安格斯公牛(n＝4)的精液样品并在收集时进行测试，然后在实例1的培养基(svfem)中储存24小时。样品在储存后保留有足够的活动力。参见图4。另外，对同一样品进行染色以用于性别鉴定过程(所述性别鉴定过程涉及将可激发染料与dna结合)。在此步骤之后，svfem中细胞的活动力还得以维持。还参见图34。实例7储存24小时后，执行另一项测试以比较样品。取得来自安格斯公牛(n＝10)的精液样品并与培养基组合。将使用本发明的培养基svfem的样品与使用常规培养基的对照样品进行比较。分析样品以确定细胞活动力是否由于储存而有损失。本发明的培养基(svfem)的使用允许在24小时储存后维持细胞的活动力。参见图5。另外，对相同的样品进行染色以用于性别鉴定过程(所述性别鉴定过程涉及将可激发染料与dna结合)。当使用本发明的培养基(svfem)时，在该步骤之后细胞的活动力还得以维持。还参见图35。实例8对svfem培养基进行测试以用于产生样品供进一步使用(例如，avf或ai)。这些样品或吸管包含已经过加工的精子细胞，在这种情况下，已对细胞进行了性别鉴定。测试吸管中每个样品的活动细胞。被储存24小时的使用本发明的svfem培养基的样品(n＝8)示出了与使用对照培养基的那些样品(n＝3)类似的细胞活动力。参见图36。以2.3×106个细胞/吸管包装样品。实例9使用本发明的培养基svfem可以提高ivf和/或al中的经过性别鉴定的精液的受精率。测试了使用svfem的样品的胚泡/受精卵母细胞的产生。将使用svfem和对照培养基两者的经过性别鉴定的样品(n＝10)与常规样品(未进行性别鉴定)进行比较。svfem在两个经过性别鉴定的样品之间示出了每个受精卵母细胞类似的胚泡数量。参见图37。当使用常规培养基相对于svfem进一步比较经过性别鉴定的精液的样品(n＝3份配对的射出精液/处理)时，如果使用本发明的培养基，则看到每个受精卵母细胞的胚泡增加。参见图38。实例10研究了从svfem培养基中消除成分的效果。当比较储存了24小时的样品的活动力时，逐个除去添加剂不会消除svfem保持培养基的功效，除非是在磷脂酰丝氨酸(ps)的情况下。参见图39。ps是关键成分，并且去除ps会导致活动力下降。实例11为了便于使用，可以将培养基调配成三部分的混合物。这三个部分如下：(1)补充有zncl、脂肪酸、d-天冬氨酸盐的cep2，在4℃下储存；(2)1000x有机储备溶液，含有紫花前胡素、阿司匹林、辅酶q10、亚麻酸，在-20℃下储存；(3)磷脂酰丝氨酸，在-20℃下储存。然后在使用时将这三个部分以适当的比率混合。由以此方式制备的svfem储备培养基制备的精液样品示出对24小时后活动力的维持类似于通过组合所有成分制成的svfem。参见图40。本文提及的所有出版物和专利均通过引用以其全文并入本文，就如同每个单独的出版物或专利被明确地且单独地指出通过引用并入一样。虽然已经讨论了本公开的特定方面，但是上述说明书是说明性的而非限制性的。在阅读了本说明书和下面的权利要求书后，本公开的许多变化对于本领域技术人员而言将变得显而易见。本公开的全部范围应参考权利要求书连同其等同物的全部范围以及说明书连同此类变化来确定。参考文献agarwal,a.,saleh,r.a.,bedaiwym,a.(2003).“活性氧类在人类生殖病理生理学中的作用(roleofreactiveoxygenspeciesinthepathophysiologyofhumanreproduction)”,《生育与不孕(fertilityandsterility)》79:829-843。aitken,r.,baker,m.,nixon,b.(2015).“精子获能和凋亡是否处于由氧化应激驱动的连续体的相对端？(arespermcapacitationandapoptosistheoppositeendsofthecontinuumdrivenbyoxidativestress？)”,《亚洲男性学杂志(asianjandrol)》17:633-639。aitken,r.j.,baker,m.(2006).“氧化应激、精子存活和生育力控制(oxidativestress,spermsurvivalandfertilitycontrol)”,《分子与细胞内分泌学(molcellendocrinol)》250:66-69。aitken,r.j.,baker,m.a.(2002).“人类精子产生的活性氧类：持续的谜团(reactiveoxygenspeciesgenerationbyhumanspermatozoa:acontinuingenigma)”,《国际男科学杂志(intjofandro)》25:191-194。aitken,r.j.,deiuliis,g.n.,etal(2009).“雄性种系中dna损伤的生物学和临床意义(biologicalandclinicalsignificanceofdnadamageinthemalegermline)”,《国际男科学杂志》32:46-56。aitken,r.j.,fisher,h.(1994).“活性氧类的产生和人类精子：利益与风险的平衡(reactiveoxygenspeciesgenerationandhumanspermatozoa:thebalanceofbenefitandrisk)”,《生物学论文集(bioessays)》16:259-267。aitken,r.j.,krausz,c.(2001).“氧化应激、dna损伤和y染色体(oxidativestress,dnadamageandtheychromosome)”,《繁殖(reproduction)》122:497-506。almquist,j.o.(1973).“与乳用公牛相比，性准备对肉用公牛的精子输出量、精液特性和性活动的影响(effectsofsexualpreparationonspermoutput,semencharacteristicsandsexualactivityofbeefbullswithacomparisontodairybulls)”,《动物科学杂志(janimsci)》36:331-336。almquist,j.o.,glantz,p.j.,shaffer,h.e.(1949)“青霉素和链霉素的组合对牛精液的存活率和细菌含量的影响(theeffectofacombinationofpenicillinandstreptomycinuponthelivabilityandbacterialcontentofbovinesemen)”,《乳业科学杂志(jdairysci)》32:183-190。alvarez,j.g.,storey,b.t.,(1992).“冷冻保存期间脂质过氧化损伤增加和超氧化物歧化酶活性损失的证据：对人类精子的亚致死性冷冻损伤的方式(evidenceforincreasedlipidperoxidativedamageandlossofsuperoxidedismutaseactivityasamodeofsublethalcryodamagetohumanspermduringcryopreservation)”,《男科学杂志(jandrol)》13(3):232-241。bacinoglu,s.,tas,m.等人(2007).“对牛的低渗溶胀测试、热应激测试和改良型宫颈粘液渗透测试的潜在生育力估计能力(thepotentialfertilityestimationcapacityofthehypoosmoticswellingtest,thethermalstresstestandamodifiedcervicalmucuspenetrationtestinthebovine)”,《动物繁殖科学(animreprodsci)》doi:10.1016/j.anireprosci.2007.01.014。balamurugan,b.,ghosh,s.k.等人(2018).“扩展剂的部分脱氧提高了精子质量、在冷冻保存水牛(亚洲水牛)精子期间减少了脂质过氧化和活性氧类(paritaldeoxygenationofextenderimprovesspermquality,reduceslipidperoxidationandreactiveoxygenspeciesduringcryopreservationofbuffalo(bubalusbubalis)semen)”,《动物繁殖科学(anireprosci)》189:60-68。barcelo-fimbres,m.,campos-chillon,l.f.,seideljr,g.e.(2011).“使用非性别鉴定和经过性别鉴定的牛精子进行体外受精：精子浓度、分选器压力和公牛效果(invitrofertilizationusingnon-sexedandsexedbovinesperm:spermconcentration,sorterpressure,andbulleffects)”,《家畜繁殖(reproddomanim)》46:495-502。barker,d.j.“成人疾病的胎儿和婴儿起源(thefetalandinfantoriginsofadultdisease)”,《bmj》301:1111bartlet,f.d.,vandemark,n.l.(1962).“稀释剂组成对储存在碳酸稀释剂中的牛精子的存活和生育力的影响(effectofdiluentcompositiononsurvivalandfertilityofbovinespermatozoastoredincarbonateddiluents)”,《乳业科学杂志(jdairysci)》45:360-367。bermejo-alvarez,p.,lonergan,p,rath,d.等人(2010).“经过性别分选的精子在体外产生的雄性和雌性牛胚胎中的发育动力学和基因表达(developmentalkineticsandgeneexpressioninmaleandfemalebovineembryosproducedinvitrowithsex-sortedspermatozoa)”,《繁殖、生育与发育杂志(repro,fert,devel)》22:426-436。bittner,l.,wyck,s.,herrera,c.等人(2018).“牛精子中的氧化应激对体外发育和胚胎的dna完整性的负面影响(negativeeffectsofoxidativestressinbovinespermatozoaoninvitrodevelopmentanddnaintegrityofembryos)”,《繁殖、生育与发育杂志(repro,fert,anddevel)》doi.org/10/1071/rd17533blom,e.(1950).“公牛精子细胞学解释(interpretationofspermaticcytologyinbulls)”,《生育与不孕(fertilsteril)》1:223-238blondin,p.,beaulieu,m.,fournier,v.等人(2009).“根据到胚胎的分选对ivf中牛的经过性别鉴定的精子的分析(analysisofbovinesexedspermforivffromsortingtotheembryo)”,《兽医产科学(theriogenology)》71:30-38。boe-hansen,g.b.,morris,i.d.,etal.(2005).“通过中性彗星测定和精子染色质结构测定评估的经过性别鉴定的公牛精子中的dna完整性(dnaintegrityinsexedbullspermassessedbyneutralcometassayandspermchromatinstructureassay)”,《兽医产科学(theriogenology)》63:1789-1802。bratton,r.w.,foote,r.h.等人(1956).“实验室测试的组合在预测牛精液的生育力方面的相对有用性(therelativeusefulnessofcombinationsoflaboratorytestsforpredictingthefertilityofbovinesemen)”,《乳业科学杂志(jdairysci)》39:1542-1549。cassou,r.(1964).“适用于冷冻泛化的塑料薄片法(lamethodedespailletesenplastiqueadapteealageneralizationdelaconqelation)”,《第5界国际动物繁殖大会(5thintconganimreprod)》意大利特伦托(trento,italy)，4:540-546。cebrian-serrano,a.,salvador,e.g.r.等人(2012).“牛输卵管液对体外产生的牛胚泡的体外受精、发育和基因表达的影响(effectofthebovineoviductalfluidoninvitrofertilization,developmentandgeneexpressionofinvitro-producedbovineblastocysts)”,《家畜繁殖(reproddomanim)》48(12):331-338。chamberland,a.,fournier,v.等人(2001).“肝素对牛精子获能期间的活动力参数和蛋白质磷酸化的影响(theeffectofheparinonmotilityparametersandproteinphosphorylationduringbovinespermcapacitation)”,《兽医产科学(theriogenology)》55:823-835。collins,a.r.,duthie,s.j.,dobson,v.l.(1993).“直接酶法检测人类淋巴细胞dna中的内源性氧化碱基损伤(directenzymicdetectionofendogenousoxidativebasedamageinhumanlympho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