生长在空隙空间中的真菌生物聚合物的提高的均质性的制作方法

这是非临时专利申请，并且要求2017年11月14日提交的临时专利申请第62/707,704号的权益。

与公开的美国专利申请us2015/0033620(a)所描述的真菌生物聚合物相比，本发明涉及产生均质性、强度和密度提高的生物材料的方法。

如公开的美国专利申请us2015/0033620(a)所述，用于产生真菌生物聚合物产物的环境条件，即高二氧化碳(co2)含量(按体积计从5％至7％)和升高的温度(85°f-95°f)，防止真菌完全分化为蘑菇。没有产生菌柄、菌盖或孢子。升高的温度加速了组织的产生。生物聚合物产物生长到工具的空隙空间中，从而用未分化的菌丝体几丁质聚合物填充该空间，随后将其从基质中提取并干燥。

简而言之，本发明允许产生坚韧、柔韧的材料，该材料可用于在诸如室内装饰、服装/时装、军事装备、运动装备和鞋类等许多应用中代替皮革、类皮革材料、织物以及高密度高强度泡沫。

本发明涉及在定向气流的条件下使真菌生物聚合物生长，在生长的生物表面上沉积水分和溶质，例如矿物质，通过基布(scrim)或膨松的非基质基体生长，以及在整个生长过程中使湿度分布波动，以诱导出更均质的材料并产生一系列材料密度。真菌生物聚合物产物完全由真菌菌丝体组成。

本发明的一个实施方案是将用于产生真菌生物聚合物的所含的接种的生长培养基置于生长围栏(growthenclosure)中，该生长围栏装备成在生长培养基的至少一个表面上递送定向气流。

在该实施方案中，使生物聚合物材料生长的方法包括以下步骤：提供多个容器，每个容器界定含有生长培养基的空腔，所述生长培养基包含营养基质和真菌；将容器置于封闭孵育室(incubationchamber)中；将孵育室保持在湿度、温度，二氧化碳和氧气的预定环境下，所述预定环境足以产生菌丝体生物聚合物同时防止所述真菌完全分化为蘑菇；引导含有高二氧化碳含量的气流通过所述孵育室，以经过每个容器中的生长培养基；和将每个容器中的生长培养基孵育足够真菌消化营养基质并在每个容器中产生完全由真菌菌丝体组成的菌丝体生物聚合物的时间段。

可以将每个容器置于“气流箱”内的孵育室内，使得该容器的高度与气流相互作用，或者可以将每个容器沉入气流箱中，从而可以使用该箱的总横截面。

根据本发明，将气流横向于容器或垂直于容器引导到封闭的孵育室中。

本发明的第二个实施方案采用了在至少一个生长表面上的、水分和矿物质的受控沉积，以基于水分和矿物质沉积体积诱导具有一系列密度的均质性。

在该实施方案中，使生物聚合物材料生长的方法包括以下步骤：提供多个容器，每个容器界限定含有生长培养基的空腔，所述生长培养基包含营养基质和真菌；将多个容器置于封闭的孵育室中；将孵育室保持在湿度、温度、二氧化碳和氧气的预定环境下，所述预定环境足以产生菌丝体生物聚合物同时防止所述真菌完全分化为蘑菇；通过所述孵育室分配雾，以经过每个容器中的生长培养基；以及将每个容器中的生长培养基孵育足以在每个容器中产生菌丝体生物聚合物的时间段。

根据本发明，雾包括水分和溶质，例如矿物质。

本发明的第三个实施方案涉及真菌生物聚合物通过与基质生长表面直接接触或升高到其上方的基布或膨松的非基质基体而生长，以及在不使用盖子的容器中生长。

第四个实施方案在整个周期的持续时间内，在生长时间段采用湿度百分比的波动，以诱导均质性提高的更高密度的材料。

第五个实施方案使用具体气流速率以获得一系列气生菌丝体密度和机械性能。

在本发明的所有实施方案中，真菌生物聚合物从营养基质生长，并以0.5-4磅/立方英尺的干密度生长成板状体(panel)。除了使用基布或膨松的非基质基体的实施方案之外，局部环境条件，即高二氧化碳空气、水分沉积和温度，必须是均匀的，以便在每个板状体内以及遍及较大的生长室实现均匀生长。

如已公开的美国专利申请us2015/0033620(a)进一步描述的那样，要求使用盖子来控制影响真菌生物聚合物生长的局部环境条件。

根据本发明，在定向气流下，除去容器上的盖子，并通过气流使局部环境条件均匀化。气流的使用允许从生长容器的整个表面生长，并有助于改善生长的组织的均质性和均匀性。这可能归因于气流促进将湿气、水和溶质例如矿物质递送到生长组织，消除微环境和/或增加机械力。生物织物和泡沫的许多应用需要增加均质材料的体积。

目前，用于生产食用蘑菇(特种蘑菇(specialty)和伞菌(agaricus))的生长环境利用通过生长室的一些不受控制的气流来加热、冷却、释放由生长的蘑菇产生的二氧化碳或将氧气引入生长室。这不同于用于防止真菌任何和全部分化成构成可食用蘑菇的子实体、同时提供均匀的环境来使真菌生物聚合物生长的气流技术。

此外，蘑菇栽培中的气流旨在去除诸如二氧化碳和其他挥发物等代谢副产物，并且本质上是间歇性的。用于使真菌生物聚合物生长的气流旨在提供始终如一的孵育环境均匀性，而没有局部变化，该均匀性具有足够受控的参数(例如高二氧化碳)，从而使菌丝体无法分化成蘑菇。同样，气流速度提供了调节了气生菌丝体结构的定向力，从而影响密度。

尽管用于生产可食用蘑菇的生长环境可以利用通过生长室的气流，但该气流是间接的，并且是用于环境加湿的再循环系统的一部分。气流不像本发明的情况那样被引导穿过生长培养基的表面。

通过以下结合附图的详细描述，这些和其他目的和优点会变得更显而易见，在附图中：

图1a示出了根据本发明的在直接的高气流环境中生长的板状体的上表面的照片，具有组织形态上的最小分化；

图1b示出了在间接低气流环境中生长的板状体的上表面的照片，具有高度分化的组织；

图1c示出了在零气流环境中生长并导致高度分化的组织和减少的气生生长的板状体的上表面的照片；

图2示出了根据本发明处理对比密度的图；

图3a1示意性地示出了本发明的横向气流系统；

图3a2示出了本发明的用于孵育两个容器的空气箱的透视图；

图3b示意性地示出了本发明的改进的横向气流系统；

图3c示意性地示出了本发明的另一改进的横向气流系统；

图4a示意性地示出了本发明的用于使空气在生长培养基表面上经过的垂直气流系统；

图4b示出了在图4a的系统中生长的板状体的上表面的照片；

图4c示意性地示出了在图4a的系统中生长培养基上方的气流模式；

图5a示意性地示出了本发明的雾分配系统；和

图5b示意性地示出了不根据本发明的用于再循环加湿空气的间接气流系统。

参照图3a1，在第一个实施方案中，使生物聚合物材料生长的方法采用封闭的孵育室10，该培养室具有多个竖直间隔开的架子11和用于观察室10内部的透明的前壁(未示出)。

另外，气流系统12与室10连接，用于如箭头13所示将气流从室10的一侧横向跨过室10引导到室10的相对侧并通过室10的相对侧。如所示，气流系统12包括在室10上部的歧管m，用于将加湿空气跨室10的顶部分配，以沿着架子11泻下，直到在右下角上再循环以进行再加湿。

室10的每个架子11的尺寸都设置成接受容纳两个容器14的空气箱b，每个容器14都含有包含营养基质和真菌的生长培养基15。

参照图3a2，每个容器14的形式都是矩形托盘，该托盘具有开放顶部以界定尺寸为11.5英寸乘以18.5英寸的空腔，整个容器的周围具有向外延伸到空腔外部的边缘。将每个容器都置于空气箱b中。

容器14由足够刚性的、非反应性的材料例如聚碳酸酯构成，并且容器的孔口使得其与气流设备配对，以实现期望的气流速率。容器的长度以及气流速率决定了该气流的一致性，并且在气流到达生长部分之前，入口长度给予控制气流的层流或浊流性质。容器可以包括斜坡(ramp)、诸如翼型等整流罩或挡板，以帮助使气流均匀化。

空气箱b为矩形形状，其容纳生长托盘14，并且在一个端面上具有开放侧16，在相对端面上具有较小的孔口17。

气流系统12包括位于每个空气箱b的孔口17处的风扇12′，以如水平箭头所示拉动空气越过容器14中的生长培养基15和生长部分。孔口被风扇覆盖，以确保所有空气都通过风扇移动。或者风扇12′可以定位在空气箱b的开放侧16处，以推动空气越过生长培养基15。

如所示，从歧管m泻下的加湿空气经由孔口16、17进入并穿过每个空气箱b。

具体而言，生长培养基15包括：

物料投入大概物料量

袋装密封基质：

接种体：

ecovative菌株id2880g

045-08-003spawn

在使生物聚合物材料生长的方法期间，将孵育室10保持在湿度、温度、二氧化碳和氧气的预定环境下。具体而言，在孵育步骤期间，将室10保持在99％的相对湿度(rh)、5％的co2以及从85°f-90°f的波动温度下。

孵育室10，即生长围栏，可以在一端开放，而在另一端可以配备风扇或装置，用于通过以5cfm到10,000cfm的速度稳定地或以脉冲方式拉动或推动空气、以箭头13所示的横向方向、在容器14上移动空气。孵育室10可以位于能够保持包括湿度、温度、二氧化碳和氧气的环境条件的较大的孵育室(未示出)内。

可以专门制作孵育室10的形状和构造，以帮助引导气流以及气流的层流或浊流特性。

方法步骤(参见图3a1)

定向横向气流

1.如us20150033620a所述，将营养生长培养基和生物接种体15包装到容器14中，例外的是这些容器14未配备盖子。

2.将这些容器14置于封闭孵育室10的架子11上的空气箱b内。

3.经由气流系统12引导气流通过孵育室10，用于如箭头13所示横向经过每个容器14中的生长培养基15。

4.将生长培养基15在每个容器14中孵育足以在每个容器14中产生菌丝体生物聚合物的板状体p的时间段，例如可以使板状体在孵育室10中生长4-14天。

气流由装备在孵育室10上的风扇产生，并被引导越过容器14并返回更大的孵育空间。

参照图1a，根据上述方法产生的一对板状体17完全由真菌菌丝体组成，并且在组织形态上显示出最小的分化。

恒定rh>99％时，每分钟100立方英尺的气流速率导致组织的干密度为1.98pcf，抗张强度为17.5psi。这些板状体提供了高度的一致性。

气流速率为每分钟100-175立方英尺且相对湿度降至96％48小时的时间段，导致组织的干密度为1.45pcf，抗张强度为13.6psi。这些成长的板状体导致高度的一致性。

气流速率为每分钟300-350立方英尺，且在恒定rh>99％下，导致组织的干密度为3.32pcf，抗张强度为31.2psi。

参照图1b，在没有定向气流的条件下产生的成对板状体的特征为具有高度分化的组织。

参照图1c，在零气流环境中生长的成对板状体的特征为具有高度分化的组织和减少的气生生长。

参照图3b，其中，相同的附图标记表示如上述的相同部件，孵育室10可以构造成具有竖直间隔开的架子11(或支架(rack))，并且可以由挡板(sheeting,未示出)包围，以与长度扩大的容器14协作，使得每个架子11容纳仅具有单个容器14的空气箱b。

另外，孵育室10配备有横向气流系统12'，该横向气流系统12'具有安装到室10'上的风扇，以将来自孵育环境的气流引导通过空气箱b并越过容器14，并如箭头18所示返回更大的孵育空间。

参照图3c，其中相同的附图标记表示如上述的相同部分，孵育室10’可以具有开放的架子11，在架子11上放置具有生长培养基15的容器14而不使用空气箱。另外，孵育室10'配备有横向气流系统，该横向气流系统具有风扇(未示出)，如所观察到的，该风扇位于室10'的右手侧，用于拉动气流通过并拉出室10'，同时在容器14上方横向经过。

参照图4a，其中相同的附图标记表示如上所述的相同的部分，可以通过使气流垂直于容器14穿过来实现真菌生物聚合物的生长。

例如，可以将封闭孵化室10”构造成具有一个或多个定位在营养培养基15上方的气流设备(未示出)，以在生长的菌丝体上方推动或拉动调节的空气。如图3a1的气流设备12在生长过程中或者在生长容器14’上方的期望高度处保持静止，或者在线性致动器(未示出)上受到调节。

如所示，将两个容器14'置于孵育室10”内的每个架子11上，并且每个容器14'都提供有竖直的隔离架(standoff)18，该隔离架18将盖子19(顶板)与容器14'间隔开。所述竖直隔离架18由非反应性物质例如聚氯乙烯(pvc)制成，并且足够坚硬以抵抗气流设备的力。

孵育室10”的一端可以开放，而另一端可以配备用于如箭头13”所示的垂直于生长表面的方向、在容器14’上方移动空气的风扇或装置，所述移动空气通过以5cfm到10,000cfm的速度稳定地或以脉冲方式拉动或推动空气在。

孵育室10”可以位于能够保持包括湿度、温度、二氧化碳和氧气的环境条件的较大的孵育室(未示出)内。

参照图4b，在孵育室10”中产生的真菌生物聚合物的板状体的特征在于，当如图4c所示空气被向上拉动到生长表面上方时(与图1a中的横跨过生长部分相反)，在气流设备下方具有集中的菌丝体。如图4b所示，在气流设备从生长培养基的中央区域向上拉动空气的情况下，生长的菌丝体集中在板状体的中央区域。

定向垂直气流(参见图4a)

1.如us20150033620a所述，将营养生长培养基和生物接种体包装到容器中，例外的是这些容器未配备盖子。

2.将这些容器14”置于封闭孵育室10”内。

3.如箭头13”所示，经由气流系统12引导气流通过孵育室10”，用于垂直于每个容器14”中的生长培养基经过。

4.可以专门制作生长围栏的形状和设计，以帮助引导空气的流动和层流或浊流特性。

5.将生长培养基15在每个容器14”中孵育足以在每个容器14”中产生菌丝体生物聚合物的板状体的时间段，例如可以使板状体在孵育室10”中生长4-14天。

6.在生长过程中，可以使用空气流动将材料塑造和构造成特定形状和图案，用于使用气流成型的最终产品。

在上文的步骤6中，拉动的水平气流速度(>175cfm)创建了密集的扇形图案。竖直气流在气流设备下方创建了呈现出与气流同等的形态(像石笋一样向上拉)的结构。推动会产生与气流相反的波形图案(160cfm)。靠近气流设备和气流模式会生成模仿流动的组织图案。

参照图2，如图所示，已经发现生长培养基的水分和溶质含量直接与所生长的材料的密度有关。水分含量越高，生长的材料的密度越低，这种趋势已在基质类型的分选中得以证明。

图2显示了在4种不同水分含量下与玉米秸秆材料相比的其他三种基质类型。这导致最终产物密度的变化，其中较高的水分含量导致密度较低的组织。

tukeykramer是确定测试之间的显著差异的平均(均值)比较测试。0.05是置信区间，因此数据之间的关系有95％的置信度。

真菌细胞填充空隙空间的能力取决于生物在生长过程中可利用的水和溶质。可用的水越多，生物就越积极膨胀，从而导致材料密度下降。

因此，参考图5a，其中相同的附图标记表示与上文相同的部分，封闭孵育室20装配有雾分配系统21，从而可以通过许多途径将水分和溶质应用到生长组织，目的在于在所产生的真菌生物聚合物中产生一系列的材料密度。

如所示，孵育室20具有多个竖直间隔开的架子21和用于观察室20内部的透明前壁(未示出)。孵育室20的尺寸设计成容纳多个容器14，每个容器都填充有成长培养基15。

如上所述，可以将孵育室20置于能够保持包括湿度、温度、二氧化碳和氧气的均匀环境条件的较大孵育室中。

将雾分配系统21定位成将水分和诸如矿物质等溶质递送到每个容器14中的生长组织的顶部，并且还可以用于控制材料密度并调节材料的均质性。这种材料由逐渐生长到营养空间外并进入非营养环境的气生菌丝构成。为了控制这种环境下的生长，生物利用膨压来调节菌丝在顶点或菌丝尖端的延伸。因此，调节沉积在生长材料顶面上的可用水分和溶质的量、分布和/或液滴大小能够控制菌丝内产生的渗透梯度，进而控制其生长速率和定殖模式。

溶质是能够引起渗透势的任何试剂(agent)。ro(反渗透)或蒸馏水不含此类试剂。其他溶质可能包括蛋白质、碳水化合物、聚合物和矿物质。

溶质是在溶液中引起渗透势的物质。溶质可以是矿物质、碳水化合物、蛋白质或脂质。在膜(例如细胞膜和/或壁)一侧的溶质浓度将驱动跨膜电势,如果在膜另一侧的溶液具有较低的溶质浓度。

可以采用水分和溶质沉积来实现具体材料密度并提高材料均质性。

可以使用配备有将水喷成蒸汽或雾的“加湿圆盘(humidifyingpuck)”的水浴将水分和溶质分配在生长培养基的生长表面。“加湿圆盘”是一种超声加湿器，其产生质量低、液体含量高、大小为5-22微米的液滴。与蒸汽相反，液态水滴非常重要，因为液滴可以携带溶质。喷雾器或起泡器也是如此，但用蒸汽不能实现。蒸汽可用于调节湿度，但不能代替携带溶质的水。

可以使用来自风扇或类似装置的间接气流或通过可配备有压缩空气的喷嘴或其他将水分从喷嘴中驱出并定向到生长培养基的生长表面的方式，将雾分布在生长培养基的表面。

可以调节水分和矿物质的量、分布以及液滴的大小，以产生密度不同的均质菌丝体生物聚合物。

生长周期中湿度百分比的波动可以用作提高材料密度和均质性的方法。在公开的us2015/0033620a所描述的方法中，在整个生长周期持续时间内，保持湿度恒定以实现材料生长。通过在生长周期的目标阶段改变这种范例并使生长室的湿度发生波动，可以提高密度和均质性。

潮湿的环境通常对于真菌积极生长是必需的。当遇到干燥环境时，许多真菌物种已发展出保护自身免受水分丧失的方法。对于气生菌丝，局部高湿度环境是允许持续扩张并防止菌丝朝生长表面塌陷必须的。生长室中湿度的波动可用于触发生物体对干燥环境的生理反应，以及操纵气生菌丝的生长，以实现所需的材料性质。

利用图5a的孵育室对系统设计进行了原型设计和测试，该系统设计允许在不使用气流的情况下使雾受控沉积到生长材料上。该雾化系统原型作为对照高气流系统，将等效体积的雾均匀地分布在生长材料上。雾化系统使用sf1010ss虹吸式雾化喷嘴或“雾化器”在不使用直接气流的情况下，在实验部件的生长表面上排出细小水滴的扇形喷雾，其大小相当于us2015/0033620所述方法中使用的mycoflex^tm控制技术。

设置雾化器雾化系统，将喷嘴定位在从培养箱壁到目标生长表面右侧26.5英寸的位置。将喷嘴以45度角固定在目标容器14上方的架子11上，并旋转90度，从而导致竖直取向的扇形喷雾模式。使用在1分钟内2.4％时间(time)雾化的雾化范例，实现水分目标总体积为每分钟0.28微西门子(microsiemens)每厘米(us/cm)加上/减去七微西门子每厘米(us/cm)，在板状体表面的目标水分偏差为0.00014g/min。目标体积基于针对图3a1的直接高气流孵育系统收集的tds值。

用生物质试验了该雾化器雾化系统，以评估独立于气流的水分沉积的影响。将七个部件装入装备有雾化器雾化系统但无任何气流的实验室培养箱(图5a)。

通过经由雾化器将水分输入到系统中实现该系统的加湿。

使用标准生物聚合物加湿系统和环境条件，同时运行两个对照培养箱。使用标准的直接高气流箱系统和加湿再循环系统(图3a1)设置了一个对照培养箱，而另一个仅配备了用于加湿空气再循环的低间接气流(图5b)。将所有三个培养箱均设置为标准生物聚合物环境条件，即99％的rh、5％的co2和华氏85-90度的波动温度，生长9天。

直接高气流导致整个培养箱内板状体中生长的均质性提高，并允许产生图1a的组织形态分化最小的板状体。

配备雾化器雾化系统的零气流培养箱导致高度分化、竖直生长量很小的板状体(图1c)。通过这种技术生长的板状体的特征可以为具有直径为0.1-1英寸的菌丝体纤维“球(bulb)”或束，并且具有主要缺乏结缔组织的离散的致密区域。

低间接气流培养箱也导致高度分化的材料和降低的气生生长；然而，竖直生长量增加了(图1b)。通过该技术生长的板状体的特征可以为具有直径等于或大于0.6英寸，例如0.6-4英寸的菌丝体纤维“球”或束。相比之下，图1c板状体上的菌丝体纤维“球”小于0.6英寸。

此外，图1b的板状体的特征为结缔组织较小，并且导致均质的美观但异质的性能。这意味着，尽管表面看起来光滑，但机械性能可在部件的整个截面上发生变化。

高度直接气流生长环境导致板状体显著更加均匀，整个板状体的分化最小(图1a)。

方法步骤

生长期间材料表面上的水分和矿物质沉积

1.如us20150033620a中所述，将营养生长培养基和生物接种体包装到容器14中，例外的是这些容器14未配备盖子。

2.将这些容器14置于保持在包括湿度、温度、二氧化碳和氧气的预定环境条件下的孵育室10内。

3.使用配备有将水喷成蒸汽或雾的加湿圆盘的水浴将水分和矿物质分配在容器中培养基的生长表面上。

4.使板状体在孵育室10中生长4-14天。

调节基质中的水分和矿物质以控制组织密度

进行测试以确定对于所产生的真菌生物聚合物面状体的密度而言，在封闭孵育室中孵育之前，调节基质(生长培养基)中的水分和矿物质的效果。

一种测试使用以下步骤：

1.如us20150033620a所述，将营养生长培养基和生物接种体包装到容器14中，例外的是这些容器14未配备盖子。

2.将水分和矿物质分配在生长培养基中，以达到20-95％水分的指定水分。

3.将生长培养基15在每个容器14中孵育足以在每个容器14中产生菌丝体生物聚合物板状体的时间段，使板状体在孵育室10中生长4-14天。

测试的结果是，可以调节置于孵育室中之前生长培养基中水分和矿物质的量，以产生所需密度的均质的真菌生物聚合物板状体。值得注意的是，玉米秸秆基质中65％的水分含量导致密度为1.7pcf，55％的水分含量导致密度为2.7pcf。

在另一个实施方案中，可以通过基布或膨松的非基质基体使真菌生物聚合物生长。在该实施方案中，基布或膨松的非基质基体本质上是有机或无机的，并提供足够的孔隙率，使得菌丝体可以渗入材料。将基布或膨松非基质基体置于营养基质之上或上方，并在上文配置之一中孵育整个组装。基布或膨松材料可作为对菌丝体的增强，定向和引导组织生长的手段，从营养基质中始终去除生长组织的方法或上述的组合。

在第四个实施方案中，在整个周期的持续时间内，在生长时间段采用湿度百分比的波动，以诱导更高密度的均质性提高的材料。在该实施方案中，在气生菌丝体诱导期间，将相对湿度保持于高百分比，这可以在生长的第0天和第5天之间开始。一旦诱导，将湿度降至低于98％持续4-72小时，以诱导顶端组织致密化。然后可以再次提高湿度，以诱导新分化的生长，从而在产物的整个横截面上提供一系列密度、组织形态和取向。如果必要，可以重复进行多次，以通过真菌泡沫获得所需的性能变化。

在第五个实施方案中，使用具体的空气流率实现一系列气生菌丝体密度和机械性能。在该实施方案中，可以将气流设置为恒定速率，使得在组织生长时被动地调节气流速度，或者可以通过孵育过程来调节速率，以在生长组织上递送恒定速率。较高的气流速率已证明产生了较密的组织，而较低的气流速率导致干燥时组织密度较低的膨松度较高的组织。