一种利用蛹虫草菌接种蓖麻蚕5龄幼虫培育蚕虫草的方法与流程

本发明涉及一种利用蛹虫草菌接种蓖麻蚕5龄幼虫培育蚕虫草的方法,属于虫草培育技术领域。

背景技术：

虫草是一类具有显著滋补功效的药食同源真菌，有“活黄金”之美誉。古语云：“宁要虫草一把，不要金玉满车”。冬虫夏草、蛹虫草以及金蝉花均是中药用虫草的佼佼者。蛹虫草(cordycepsmilitaris)亦称北虫草，是麦角菌科虫草属的模式种，以鳞翅目昆虫为寄主，通过不同方式侵染昆虫幼体，经过不断的生长发育突破昆虫体表而形成的一种真菌与虫体外壳共存的虫菌复合体。蛹虫草的药用价值在医药书目中多有记载，其药性作用温和，具有广泛的药用和食用性，无任何副作用，是我国药食两用的高级滋补品。经研究证明蛹虫草含有虫草素、喷司他丁、虫草多糖等活性成分，具有抗疲劳、抗衰老、提高机体免疫力、抑制肿瘤等作用，可以与人参、鹿茸相媲美，是一种珍稀的食用菌和珍贵的抗癌中药材。

1950年，科学家首次在蛹虫草中发现和鉴定了腺苷类系物虫草素，后陆续发现其具有抗菌、抗虫和抗癌等生物活性。虫草素含量因此成了衡量虫草质量最主要的指标。2011年以来，中科院上海植物生理生态研究所先后完成了冬虫夏草、蛹虫草和蝉花等18种虫草的基因组研究。在此基础上，完整地解析了虫草素生物合成的分子机理。并首次发现蛹虫草能够合成抗癌药物喷司他丁，为蛹虫草的抗癌活性提供了分子证据，为蛹虫草的质量标准提供了新的分子指标。

蛹虫草因具有其他虫草无可比拟的优点，使其在功能食品和医药等方面都有很好的开发利用前景，目前已被国家科技部批准为冬虫夏草的替代品和新资源食品。近年来，以鳞翅目经济昆虫家蚕幼虫为寄主人工栽培蛹虫草的技术不断成熟，其培育的蛹虫草形态近似于天然蛹虫草，活性成分含量高于其他寄主栽培的蛹虫草。蓖麻蚕是一种体型较大的鳞翅目泌丝昆虫，与家蚕类似，蚕体含有丰富的粗脂肪、蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质元素，其脂肪酸组成也较合理，不饱和脂肪酸含量较高，而且还含有丰富的亚麻酸，是低胆固醇食品的潜在来源。20世纪中后期，由于食物及肉类匮乏，广西蓖麻蚕养殖户尝试把蚕蛹作为菜肴烹饪，久而久之在当地逐渐形成富有特色的饮食文化，如今已由最初的食蛹发展为食用熟蚕和预蛹。蓖麻蚕抗逆性和抗病性都比家蚕强，体型大、蚕体柔软、营养丰富。以蓖麻蚕为宿主，更便于大规模生产接种及提升蚕虫草产量和活性成分积累，从而提升保健食品附加值，有利于规模化推广。

蓖麻蚕蚕虫草是蛹虫草的一种，目前与蓖麻蚕有关的人工栽培成功的蛹虫草报道较少。中国发明专利申请201910113947.2公开了以木薯蚕蛹为寄主培育的木薯蚕蛹虫草及其培育方法：本发明是将蛹虫草菌种培养成蛹虫草液体菌种，用无菌注射器将菌种注入木薯蚕蛹体内，然后控制温、湿、光等环境条件培养出草来。木薯蚕蛹虫草产品具有多种活性成分和营养成分，其功效与冬虫夏草相似，可作为药品，保健品，食品应用，其培育方法简单，周期短，成本低，是开发新型蛹虫草的一种实用方法。中国发明专利申请201811136359.6公开了一种蓖麻蚕蚕虫草人工栽培方法：包括蓖麻蚕饲养，其特征在于还包括寄主蚕饲养及选择、虫草母种选择、寄主蚕接种和发菌等步骤。该方法通过液体菌种将蓖麻蚕幼虫作为寄主与蛹虫草结合，培养出来的蚕虫草有效成份含量高，尤其是sod含量比冬虫夏草高。李亚洁等(2011)采用蛹虫草菌种接种蓖麻蚕蚕蛹培育蓖麻蛹虫草，其虫草素含量高出野生蛹虫草接近2倍，而腺苷含量与野生蛹虫草相当。

蓖麻蚕是一类野蚕，抗逆性和抗病性均比家蚕强的多，如何提升蛹虫草菌对蓖麻蚕感染的能力，如何预防蛹虫草菌在感染僵化期间，蚕体容易被其他病菌侵染、变黑软化腐臭是蓖麻蚕蚕虫草人工栽培需要解决的关键问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的缺陷，提供一种杂菌污染率低，感染僵化率、出草率高且稳定的利用蛹虫草菌接种蓖麻蚕5龄幼虫人工培育蚕虫草的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种利用蛹虫草菌接种蓖麻蚕5龄幼虫培育蚕虫草的方法，包括以下步骤：

（1）蛹虫草菌宿主选择：选择五龄3～5d蓖麻蚕健康蚕体，5龄饷食后，在温度25～30℃，相对湿度60～70%环境下，连续给蓖麻叶饲养，保证通风，及时除沙，选择健壮的蓖麻蚕幼虫备用；

（2）菌种液体制备液扩大培养：选用蛹虫草菌斜面母种，接种于添加5～8wt%蚕蛹粉的现配固体平板培养基上，活化7～10天；无菌操作下，将菌种均匀分割成黄豆大小，及时接种7～9块黄豆大小的菌种于1l添加6～10wt%蚕蛹粉的液体培养基中，在黑暗条件、温度20～22℃下静置培养1天，第2天开始振荡培养，每天振荡3～5h、130～140r/min，第5天在100～150lx光照强度下培养1天，用3～4层无菌纱布过滤除去菌丝，获得菌种液体制备液；

蛹虫草菌斜面母种优选对抗病性强的一代杂交品种家蚕幼虫感染力强、出草稳定、子实体优质高产的母种。

进一步，步骤（2）中，所述蛹虫草菌斜面母种为北冬虫夏草菌，活化后，经过抗病性强的一代杂交品种家蚕5龄幼虫活体复壮优选后分离、纯化、保存后备用。

所述添加5～8wt%蚕蛹粉的现配固体平板培养基和添加6～10wt%蚕蛹粉的液体培养基为普通常用的固体平板培养基和液体培养基中分别添加蚕蛹粉。

添加5～8wt%蚕蛹粉的现配固体平板培养基原料重量配比为：马铃薯25%、葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、酵母浸膏0.1%、蚕蛹粉5～8wt%、琼脂粉1.5%、kh2po40.15%、mgso40.05%、水1000ml、ph7.0；添加6～10wt%蚕蛹粉的液体培养基原料重量配比为：马铃薯25%、葡萄糖2%、蛋白胨0.25%、酵母浸膏0.2%、蚕蛹粉6～10wt%、kh2po40.2%、mgso40.1%、vb10.01%、水1000ml、ph7.5。

（3）宿主蓖麻蚕接种后处理：取步骤（1）所得健壮的蓖麻蚕幼虫，每头注射0.45～0.60ml的步骤（2）所得菌种液体制备液，注射完成后立即将蚕体放在草木灰上自由爬行（所述草木灰经过100℃以上高温灭菌8～10小时处理过），温度21～24℃，相对湿度60～70%，通风条件下培养3天，待接种伤口完全愈合后放入纱网木框中，用纱网盖住，温度21～24℃，相对湿度60～70%，通风条件下继续培养7～9天，待95%以上蚕体被感染僵化后，收集整理感染僵化尚未发菌的蚕体，剔除因杂菌感染、变黑软化或未感染僵化的蚕体；

草木灰优选为水稻谷壳燃烧处理所得的黑灰；

（4）蚕虫草子实体培育管理：将步骤（3）所得感染僵化尚未发菌的蚕体整齐放置于带盖透明塑料盒（所述带盖透明塑料盒经过紫外灯无菌处理3小时以上）中，放置在温度18℃～22℃、相对湿度60%～70%的黑暗环境下培养7～10天；再转入光强为100～260lx，温度为白天20～22℃、夜晚16～18℃,相对湿度70～75%的条件下培养4～6天；在带盖透明塑料盒盖打孔透气后，再转入光强为150～300lx，温度为18℃～23℃,相对湿度70%～80%的条件下培养40～50天，即获得成熟蓖麻蚕蚕虫草。

进一步，步骤（2）中，蚕蛹粉的制备方法：将蛹体色黄褐、变硬、未羽化前的家蚕蛹，在60～70℃烘干粉碎，过80目筛，即得。

进一步，步骤(3)中，接种时应缓慢平稳推进，尽量减轻对蚕体的机械性创伤，以避免蚕体尚未感染僵化过早死亡。

注射完成后立即将蚕体放在草木灰上自由爬行，因为草木灰有助于蓖麻蚕体表干爽、伤口愈合、吸收蓖麻蚕接种后排出的水分以及尿液，可以有效地预防杂菌污染。

步骤（4）中，采用不同光强、温差处理，因为蓖麻蚕蚕体发菌后表面菌丝转色需要光照诱导，同时一定的温差刺激有利于子实体原基形成。

本发明的优点是：

1、本发明通过抗病性强的一代杂交品种家蚕5龄幼虫活体复壮蛹虫草菌种，初步筛选及提升蛹虫草菌的感染僵化能力，有效地预防因长期低温保存及多次传代造成的菌种退化。

2、固体和液体培养基中添加5～10wt%蚕蛹粉，能进一步维持及提升蛹虫草菌菌种的活力和感染能力，缩短僵化时间和减少感染僵化期间蚕体营养成分损耗，提高出草稳定性和产量。

3、蓖麻蚕是一种体型较大的杂食性野蚕，蚕体所含营养物质丰富，蚕幼虫抗病性强，本发明5龄蓖麻蚕幼虫接种蛹虫草菌后，蓖麻蚕蚕体感染僵化稳定，出草率高，蓖麻蚕蚕虫草虫体部分整齐饱满，子实体长度3cm以上，虫草素、喷司他丁等有效活性成分含量丰富。

4、蓖麻蚕蚕体接种大剂量蛹虫草液体菌种后，放在经过100℃高温灭菌8～10小时处理过的草木灰上自由爬行，温度21～24℃，相对湿度60～70%通风条件下培养3d，待接种伤口完全愈合后放入纱网木框中继续培养，极大的降低了因杂菌感染，蚕体发生败血病的概率。

本发明充分利用蓖麻蚕幼虫个体大、身体柔软、营养丰富等优势培育子实体；操作简易，容易推广，杂菌污染率低，感染僵化率、出草率高，所得蓖麻蚕蚕虫草稳定性好，子实体产量高，有效活性成份含量丰富，成本低，蓖麻蚕蚕虫草外观饱满，适合规模化生产。本发明方法既有利于蓖麻蚕产业多元化发展，提高综合利用附加值，同时提升蚕虫草相关产品品质量和档次，开发前景广阔。

附图说明

图1为本发明实施例2培育的蚕虫草感染僵化图；

图2为本发明实施例2培育的蚕虫草发菌图；

图3为本发明实施例2培育的蚕虫草出草管理图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明。

实施例一：

本实施例包括以下步骤：

（1）蛹虫草菌宿主选择：选择五龄3d蓖麻蚕健康蚕体，5龄饷食后，在温度25℃，相对湿度60%环境下，连续给蓖麻叶饲养，保证通风，及时除沙，选择健壮的蓖麻蚕幼虫备用；

（2）菌种液体制备液扩大培养：选用对抗病性强的一代杂交品种家蚕幼虫感染力强、出草稳定、子实体优质高产的蛹虫草菌斜面母种，将1块黄豆大小的蛹虫草菌斜面母种接种于1l添加了5wt%蚕蛹粉的现配固体平板培养基上，活化10天后，无菌操作下，将菌种均匀分割成黄豆大小，及时接种9块黄豆大小的菌种于1l添加了6wt%蚕蛹粉的液体培养基中，在黑暗条件、温度22℃下静置培养1d，第2天开始振荡培养，每天振荡3h、130r/min，第5天在100lx光照强度下培养1d，用3层无菌纱布过滤除去菌丝，获得菌种液体制备液；

所述蛹虫草菌斜面母种为北冬虫夏草，活化后，经过抗病性强的一代杂交品种家蚕5龄幼虫活体复壮优选后分离、纯化、保存后备用。

添加5wt%蚕蛹粉的现配固体平板培养基原料重量配比为：马铃薯25%、葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、酵母浸膏0.1%、蚕蛹粉5wt%、琼脂粉1.5%、kh2po40.15%、mgso40.05%、水1000ml、ph7.0；

添加6wt%蚕蛹粉的液体培养基原料重量配比为：马铃薯25%、葡萄糖2%、蛋白胨0.25%、酵母浸膏0.2%、蚕蛹粉6wt%、kh2po40.2%、mgso40.1%、vb10.01%、水1000ml、ph7.5。

步骤（2）中，蚕蛹粉的制备方法：将蛹体色黄褐、变硬、未羽化前的家蚕蛹，在70℃烘干粉碎，过80目筛，即得。

（3）宿主蓖麻蚕接种后处理：取步骤（1）所得健壮的蓖麻蚕幼虫，每头注射0.45ml的步骤（2）所得菌种液体制备液，注射完成后立即将蚕体放在经过100℃高温灭菌8小时处理过的草木灰上自由爬行，温度21℃，相对湿度60%，通风条件下培养3d，待接种伤口完全愈合后放入纱网木框中，用纱网盖住，温度21℃，相对湿度70%，通风条件下继续培养9d，待95%以上蚕体被感染僵化后，收集整理感染僵化尚未发菌的蚕体，剔除因杂菌感染、变黑软化或未感染僵化的蚕体；

步骤(3)中，接种时应缓慢平稳推进，尽量减轻对蚕体的机械性创伤，以避免蚕体尚未感染僵化过早死亡。

（4）蚕虫草子实体培育管理；将步骤（3）所得感染僵化尚未发菌的蚕体整齐放置于经过紫外灯无菌处理3小时的带盖透明塑料盒中，放置在温度18℃、相对湿度60%的黑暗环境下培养10天；再转入光强为100lx，温度为白天22℃、夜晚16℃,相对湿度70%的条件下培养6天；在带盖透明塑料盒盖打孔透气后，再转入光强为150lx，温度为18℃,相对湿度70%的条件下培养50天，即获得成熟蓖麻蚕蚕虫草。

本实施例培育指标统计：蓖麻蚕蚕体感染率92%，未感染率8%，杂菌污染、机械致死等损失合计2%，出草率为93%，子实体长2～5cm，经测定，所得蓖麻蚕蚕虫草中虫草素含量为8.42mg/g，喷司他丁为8.16mg/g，腺苷为5.07mg/g。

实施例二：

本实施例包括以下步骤：

（1）蛹虫草菌宿主选择：选择五龄4d健康蓖麻蚕蚕体，5龄饷食后，在温度28℃，相对湿度65%环境下，连续给蓖麻叶饲养，保证通风，及时除沙，选择健壮的蓖麻蚕幼虫备用；

（2）菌种液体制备液扩大培养：选用对抗病性强的一代杂交品种家蚕幼虫感染力强、出草稳定、子实体优质高产的蛹虫草菌斜面母种，将1块黄豆大小的蛹虫草菌斜面母种接种于1l添加了7wt%蚕蛹粉的现配固体平板培养基上，活化9天后，无菌操作下，将菌种均匀分割成黄豆大小，及时接种8块黄豆大小的菌种于1l添加了8wt%蚕蛹粉的液体培养基中，在黑暗条件、温度20℃下静置培养1d，第2天开始振荡培养，每天振荡4h、135r/min，第5天在130lx光照强度下培养1d，用4层无菌纱布过滤除去菌丝，获得菌种液体制备液；

所述蛹虫草菌斜面母种为北冬虫夏草，活化后，经过抗病性强的一代杂交品种家蚕5龄幼虫活体复壮优选后分离、纯化、保存后备用。

添加7wt%蚕蛹粉的现配固体平板培养基原料重量配比为：马铃薯25%、葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、酵母浸膏0.1%、蚕蛹粉7wt%、琼脂粉1.5%、kh2po40.15%、mgso40.05%、水1000ml、ph7.0；

添加了8wt%蚕蛹粉的液体培养基原料重量配比为：马铃薯25%、葡萄糖2%、蛋白胨0.25%、酵母浸膏0.2%、蚕蛹粉8wt%、kh2po40.2%、mgso40.1%、vb10.01%、水1000ml、ph7.5。

步骤（2）中，蚕蛹粉的制备方法：将蛹体色黄褐、变硬、未羽化前的家蚕蛹，在70℃烘干粉碎，过80目筛，即得。

（3）宿主蓖麻蚕接种后处理；选择步骤（1）所得健壮的蓖麻蚕幼虫，每头注射0.50ml的步骤（2）所得菌种液体制备液，注射完成后立即将蚕体放在经过100℃高温灭菌9小时处理过的草木灰上自由爬行，温度23℃，相对湿度70%，通风条件下培养3d，待接种伤口完全愈合后放入纱网木框中，用纱网盖住，温度24℃，相对湿度70%通风条件下继续培养8d，待95%以上蚕体被感染僵化后，收集整理感染僵化尚未发菌的蚕体，剔除因杂菌感染、变黑软化或未感染僵化的蚕体；

步骤(3)中，接种时应缓慢平稳推进，尽量减轻对蚕体的机械性创伤，以避免蚕体尚未感染僵化过早死亡。

（4）蚕虫草子实体培育管理；将步骤（3）所得感染僵化尚未发菌的蚕体整齐放置于经过紫外灯无菌处理3小时的带盖透明塑料盒中，放置在温度20℃、相对湿度70%的黑暗环境下培养8天；再转入光强为200lx，温度为白天22℃、夜晚16℃,相对湿度75%的条件下培养5天；在带盖透明塑料盒盖打孔透气后，再转入光强为250lx，温度为20℃,相对湿度75%的条件下培养45天，即获得成熟蓖麻蚕蚕虫草。

本实施例培育指标统计：蓖麻蚕蚕体感染率94%，未感染率3%，杂菌污染、机械致死等损失合计4%，出草率为92%，子实体长3～6cm，经测定，所得蓖麻蚕蚕虫草中虫草素含量为8.52mg/g，喷司他丁为8.46mg/g，腺苷为5.27mg/g。

实施例三

本实施例包括以下步骤：

（1）蛹虫草菌宿主选择；选择五龄5d蓖麻蚕健康蚕体，5龄饷食后，在温度30℃，相对湿度70%环境下，连续给蓖麻叶饲养，保证通风及时除沙，选择健壮的蓖麻蚕幼虫备用；

（2）菌种液体制备液扩大培养，选用对抗病性强的一代杂交品种家蚕幼虫感染力强、出草稳定、子实体优质高产的蛹虫草菌斜面母种，将1块黄豆大小的蛹虫草菌斜面母种接种于1l添加了8wt%蚕蛹粉的现配固体平板培养基上，活化7天后，无菌操作下，将菌种均匀分割成黄豆大小，及时接种7块黄豆大小的菌种于1l添加了10wt%蚕蛹粉的液体培养基中，在黑暗条件、温度21℃下静置培养1d，第2天开始振荡培养，每天振荡4h、140r/min，第5天在150lx光照强度下培养1d，用4层无菌纱布过滤除去菌丝，获得菌种液体制备液；

所述蛹虫草菌斜面母种为北冬虫夏草，活化后，经过抗病性强的一代杂交品种家蚕5龄幼虫活体复壮优选后分离、纯化、保存后备用。

添加了8wt%蚕蛹粉的现配固体平板培养基原料重量配比为：马铃薯25%、葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、酵母浸膏0.1%、蚕蛹粉8wt%、琼脂粉1.5%、kh2po40.15%、mgso40.05%、水1000ml、ph7.0；

添加10wt%蚕蛹粉的液体培养基原料重量配比为：马铃薯25%、葡萄糖2%、蛋白胨0.25%、酵母浸膏0.2%、蚕蛹粉10wt%、kh2po40.2%、mgso40.1%、vb10.01%、水1000ml、ph7.5。

步骤（2）中，蚕蛹粉的制备方法：将蛹体色黄褐、变硬、未羽化前的家蚕蛹，在70℃烘干粉碎，过80目筛，即得。、

（3）宿主蓖麻蚕接种后处理；选择步骤（1）所得健壮洁净的蓖麻蚕幼虫，每头注射0.60ml的步骤（2）所得菌种液体制备液，注射完成后立即将蚕体放在经过100℃高温灭菌10小时处理过的草木灰上自由爬行，温度24℃，相对湿度65%，通风条件下培养3d，待接种伤口完全愈合后放入纱网木框中，用纱网盖住，温度23℃，相对湿度65%，通风条件下继续培养7d，待95%以上蚕体被感染僵化后收集整理感染僵化尚未发菌的蚕体，剔除因杂菌感染、变黑软化或未感染僵化的蚕体；

步骤(3)中，接种时应缓慢平稳推进，尽量减轻对蚕体的机械性创伤，以避免蚕体尚未感染僵化过早死亡。

（4）蚕虫草子实体培育管理；将步骤（3）所得感染僵化尚未发菌的蚕体整齐放置于经过紫外灯无菌处理3小时的带盖透明塑料盒中，放置在温度23℃、相对湿度65%的黑暗环境下培养7天；再转入光强为260lx，温度为白天21℃、夜晚17℃,相对湿度73%的条件下培养4天；在带盖透明塑料盒盖打孔透气后，再转入光强为300lx，温度为23℃,相对湿度80%的条件下培养40天，即获得成熟蓖麻蚕蚕虫草。

本实施例培育指标统计：蓖麻蚕蚕体感染率91%，未感染率5%，杂菌污染、机械致死等损失合计4%，出草率为95%，子实体长3～6cm，经测定，所得蚕虫草中虫草素含量为8.19mg/g，喷司他丁为8.32mg/g，腺苷为5.13mg/g。

对比实验

采用现有技术：中国发明专利申请201811136359.6公开了一种蓖麻蚕蚕虫草人工栽培方法（对比例1）和李亚洁等(2011)采用蛹虫草菌种接种蓖麻蚕蚕蛹培育蓖麻蛹虫草研究（对比例2）中所提及的方法培育蓖麻蚕蚕虫草及蚕蛹虫草，其感染率、出草率及活性成分如下表1所示：可见本发明的感染率接近现有技术，但出草率高于现有技术，主要活性成分远高于现有技术。