一种高效生产XX♂雄性黄颡鱼的方法与流程

本发明属于鱼类遗传育种技术领域，具体涉及一种高效生产xx♂雄性黄颡鱼的方法，适用于工厂化温控生产雄性黄颡鱼苗和黄颡鱼全雌配套系生产。

背景技术：

黄颡鱼(pelteobagrusfulvidraco)隶属于鲇形目，鲿科，黄颡鱼属，是我国重要的淡水经济鱼类之一。近年来，我国科研人员对黄颡鱼生殖调控和品种改良进行了大量研究。由于黄颡鱼雄性比雌性生长快2-3倍，刘汉勤等^[1]通过性激素处理结合丹成等^[2]开发的黄颡鱼性别连锁分子标记成果筛选出yy超雄黄颡鱼。yy超雄黄颡鱼与普通xx雌性黄颡鱼繁殖得到的xy全雄黄颡鱼。生产xy全雄黄颡鱼需使用雌激素来生产xy和yy生理雌性黄颡鱼，而农业部公布的ny5071-2002《无公害食品渔用药物使用准则》规定了禁止雌激素在水产品中使用，此外各个家系的维持成本大。

大多数鱼类的性别决定为遗传性别决定，极少数鱼类存在遗传性别决定和环境性别决定共存的现象，如半滑舌鳎和银鲫，它们的后代性别比例容易受到温度的影响。目前还没有效的方法能够诱导鱼类从遗传性别决定到环境(温度)性别决定。zhang等^[3]利用高温处理xy♂与xx♀繁殖的黄颡鱼仔鱼的性比接近1:1，高温对黄颡鱼的遗传性别决定几乎没有影响；而且野生和养殖群体中均未发现xx♂伪雄鱼。目前普遍使用17α-甲基睾酮(mt)定向诱导鱼类性腺向精巢分化来生产伪雄鱼，但本实验室已研究了不同浓度的17α-甲基睾酮(mt)，发现mt不能逆转为功能性精巢，另外芳香化酶抑制剂来曲唑(lz)处理黄颡鱼鱼苗并结合黄颡鱼性别连锁分子标记筛选发现仅20％左右的xx雌鱼逆转为雄性黄颡鱼^[4]，在后来的繁殖过程中发现伪雄黄颡鱼性腺存在退化现象，而且处理效果不稳定。本发明首次发现利用来曲唑(lz)诱导的性逆转促使黄颡鱼从遗传性别决定向环境(温度)性别决定转换，常温下xx雄性黄颡鱼和xx雌鱼交配的子一代全部为雌性；但高温32-34℃处理能够诱导出接近100％比例的xx雄鱼。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种高效生产xx♂雄性黄颡鱼的方法，首次以来曲唑(lz)逆转的xx♂雄性黄颡鱼与xx♀雌性黄颡鱼繁殖的xx子一代为研究对象，通过摸索温度处理梯度和处理时间，以最佳组合方式建立了高效生产xx♂雄性黄颡鱼的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种高效生产xx♂雄性黄颡鱼的方法，包括以下步骤：

(1)来曲唑诱导：xx♀雌性黄颡鱼和xy♂雄性黄颡鱼人工繁殖的子代通过来曲唑诱导进行性逆转，分子标记筛选出xx♂雄性黄颡鱼；

(2)温度诱导：将上述方法获得的xx♂雄性黄颡鱼与xx♀雌性黄颡鱼进行人工繁殖，子代从第7日龄到15日龄在32-34℃培育，从第16日龄到60日龄在34℃培育，全雌黄颡鱼经高温处理后逆转为xx♂雄性黄颡鱼。

优选地，步骤(2)中子代从第7日龄到60日龄在34℃培育，雄性逆转率为高达99％。

优选地，步骤(2)中子代从第7日龄到15日龄在32℃培育，从第16日龄到60日龄在34℃培育，雄性逆转率为95％，存活率高达95.54％。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明首次通过32-34℃处理xx♂黄颡鱼与xx♀黄颡鱼的子一代即可逆转成xx♂雄性黄颡鱼，逆转率高达99％，相比现有技术中使用激素性逆转，其逆转率显著提高。与常规的xy全雄黄颡鱼的生产相比，本发明更为生态环保、简单和高效，仅需一个家系即可在常温生产全雌配套系，也可工厂化温控生产雄性黄颡鱼苗。本发明首次在鱼类中成功诱导从遗传性别决定向环境(温度)性别决定转换，为鱼类性别控制和单性育种提供新的技术途径。

附图说明

图1：性腺结构和组织切片图；po：初级卵母细胞，sz：精子。

图2：60日龄性腺结构统计图。

图3：雄性和全雌黄颡鱼生产工艺图；ysm、xsm：黄颡鱼性别连锁分子标记。

具体实施方式

为了更清楚的了解本发明的技术方案，通过以下具体实施例对本发明进一步描述。

实施例1：来曲唑(lz)诱导获得xx♂雄性黄颡鱼

1.人工繁殖

亲本挑选：挑选体表色泽正常，游泳活泼，腹部膨大、饱满、柔软和卵巢轮廓明显且有下坠感，生殖孔变圆且微红的xx♀雌性黄颡鱼和体型瘦长，生殖突突出、膨大、末端较尖有明显红点xy♂雄性黄颡鱼。

人工催产：催产药物剂量按鱼的体重计算为：第一针为lhrh-a220ug/kg；第二针为lhrh-a210-14ug/kg+hcg2500iu-2900iu+dom6mg-8mg/kg。雄鱼仅注射第二针，注射剂量与雌鱼相同。注射方式：第一、第二针每尾各注射0.3～0.6ml(0.7％的生理盐水配制)，可根据亲鱼的大小调整。一般雌性黄颡鱼注射两针(胸鳍基部注射)，两针时间间隔8-12h，雄鱼仅注射第二针。

人工授精：1)采卵：从鱼框中拿出鱼，用毛巾将生殖孔附近水擦干，左手食指和中指由头部向下握住亲鱼左右胸鳍，右手拇指和食指从腹部由上往下轻、缓的挤压，将鱼卵挤入钵中，如没有挤完，可重复1-2次；2)取精：用毛巾擦干雄鱼体表水，先用剪刀剪开两侧鱼鳃，头向下倾斜放血，避免取精巢时血液污染精巢，再沿泄殖孔向上剪开腹部用镊子拨开内脏，取出精巢称重后放入4℃的精子保存液中存放；取出精巢放入匀浆器或研钵中研磨成白色浆状；3)授精：一般按1g精巢配120万卵，先称取相应的数量的卵，根据精卵配比取出相应的精液加入鱼卵中，快速搅拌10s，再加入足量水激活精子，之后快速搅拌均匀，约2min后即可进行脱粘作业；4)脱粘：先将泥浆倒入盆中加水(泥浆：水体积比为1：3)，用手搅拌均匀，将受精卵倒入脱粘盆中，搅动3～4min后鱼卵粘性消失；或将泥浆水和卵倒入倒锥形脱粘桶中气动脱粘，持续时间与前者相同。

孵化及出苗：将清洗干净的受精卵倒入孵化桶中，每桶可放120万枚卵左右。孵化桶为倒锥形的桶身和桶罩(60目筛绢布做成)和相关附件组成，体积为250l，下方进水、充气，上端出水。进水和充气应使受精卵在桶中轻轻翻滚、底部无堆积适宜。水流速度一般为0.3l/s。先关掉水阀、气阀待鱼苗沉入桶底后，采用虹吸的方式将鱼苗吸入带水的容器中。注意虹吸时装鱼容器水位高度与孵化桶的落差高度为1m最佳。

2.来曲唑(lz)诱导

实验鱼苗出膜后3d用丰年虫开口，7日龄进行药物处理实验。在7—29日龄期间用lz(100、300和1000μg/l)浸泡丰年虫1h后再投喂。在30—60日龄期间，lz(100、300和1000mg/kg)拌入微粒饲料后再投喂(饲料购自湖州亿盛饲料有限公司，主要成分：粗蛋白≥45.0％，粗脂肪>5.0％，粗纤维≤6.0％，灰分≤15.0％，水分≤10.0％)。lz溶于95％的乙醇，拌入微粒饲料后于40℃中烘干4h，对照组仅加入95％乙醇。实验共4个组:0(对照组)、lz100、lz300和lz1000。每组3个平行，每个平行随机放入300尾鱼苗。结果：投喂浓度为lz300和lz1000组对xx黄颡鱼的逆转率分别为20％，30％，lz100组则不能逆转。

3.分子标记筛选

提取黄颡鱼基因组dna，性别鉴定的pcr引物来源于dan等^[2]分离得到的黄颡鱼性染色体连锁标记ysm和xsm，得到的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，再利用凝胶成像系统依据片段长度鉴别出xy和xx，xy为2条带(826和955bp),xx为一条带(955bp)。

4.将筛选到的xx♂雄性黄颡鱼放入网箱培育一周年。

实施例2：温度诱导生产xx♂雄性黄颡鱼

1.获得实验仔鱼

用来曲唑(lz)诱导的xx♂雄性黄颡鱼和yy♂超雄黄颡鱼分别与xx♀雌性黄颡鱼进行人工繁殖(实验步骤同实施例1)，分别获得基因型xx仔鱼和xy仔鱼。

2.温度试验分组设计

试验大致分为7组即：xx室温(26-28.5℃)(7-60日龄)、xy室温(26-28.5℃)(7-60日龄)、xx32℃(7-30日龄)、xx32℃(7-60日龄)、xx34℃(7-30日龄)、xx34℃(7-60日龄)及xx32℃(7-15日龄)34℃(16-60日龄)。每组3个平行，每个平行随机放入300尾鱼苗。温度处理组中加热棒从第5日龄放入水箱中(水温28℃)以1℃/12h速度升至目的温度。室温组每天早中晚各测三次水温并记录。xx32℃、34℃(7-30日龄)组即加温从第7日龄处理到第30日龄后撤出加热棒后在室温饲养。xx32℃、34℃(7-60日龄)组则加温从第7日龄处理到第60日龄。xx32℃(7-15日龄)34℃(16-60日龄)组则加温从第7日龄处理到第15日龄后在第16日龄升温到34℃继续加温到60日龄。所有组的鱼苗从开口到30日龄用丰年虫培育，第30日龄到60日龄采用微粒饲料投喂(主要成分：粗蛋白≥45.0％，粗脂肪>5.0％，粗纤维≤6.0％，灰分≤15.0％，水分≤10.0％)。61日龄全部进网箱培育。

3.性逆转个体分析及存活率统计

第60日龄每组各取100尾黄颡鱼，解剖后滴加波恩氏液到性腺上，观察形态学差异并分类统计后并显微拍照。第90日龄每组再各取100尾观察记录后拍照，并用pfa固定进行石蜡切片和he染色。所有组均在60日龄期间统计存活率。

结果分析

通过显微镜下形态学观察和组织学鉴定，观察温度对性腺分化的影响。如图1所示，根据60日龄的性腺形态学可划分为3类，分别是卵巢、兼性性腺、精巢，可看出90日龄逆转的xx精巢与xy精巢相同均可观察完整精小叶和精子，而兼性性腺中同时存在初级卵母细胞(po)和精子(sz)。图2结果表示在7-60dfp期间高温34℃处理效果最佳，99％的全雌黄颡鱼逆转为雄性黄颡鱼。zhangg等^[4]研究发现xy♂黄颡鱼与xx♀黄颡鱼繁殖的仔鱼生长在室温和高温的性比仍为1：1，表明其后代的性别控制为遗传性别决定。我们的研究发现经来曲唑逆转的xx♂黄颡鱼与xx♀黄颡鱼繁殖的仔鱼在室温中为全雌鱼，该仔鱼从第7日龄至第60日龄经高温(34℃)处理后99％为雄性黄颡鱼，表明全雌黄颡鱼从室温到高温中其性别决定方式也由遗传性别决定变为温度控制性别为主。同时，如表1所示，通过不同温度搭配可显著提高雄性黄颡鱼的存活率，在7-15日龄选择32℃处理、16-60日龄用34℃处理，其存活率为95.54％，雄性转化率也高达95％。

表160日龄存活率

参考文献

[1]liuh,guanb,xuj,etal.geneticmanipulationofsexratioforthelarge-scalebreedingofyysuper-maleandxyall-maleyellowcatfish(pelteobagrusfulvidraco(richardson))[j].marinebiotechnology,2013,15(3):321-328.

[2]danc,meij,wangd,etal.geneticdifferentiationandefficientsex-specificmarkerdevelopmentofapairofy-andx-linkedmarkersinyellowcatfish[j].internationaljournalofbiologicalsciences,2013,9(10):1043.

[3]zhangg,jiax,yux,etal.effectofwatertemperatureonsexratioandgrowthrateofjuvenilepelteobagrusfulvidraco,p.vachelliandhybrids[p.fulvidraco(♀)×p.vachelli(♂)][j].aquaculturereports,2016,3:115-119.

[4]杨天毅,熊阳,丹成,等.利用鱼类性逆转技术创制黄颡鱼xx雄鱼的方法[j].水生生物学报,2018,42(5)。