本发明涉及微生物制剂技术领域，具体涉及一种复合微生物菌剂及其应用。
背景技术：
锈病是由真菌中的锈菌寄生引起的一类植物病害，危害植物的叶、茎和果实。严重时锈菌孢子堆密集成片，如果不及时防治，病斑危害着作物的产量，造成减产，严重的地块能减产一半以上，最严重的造成绝收。如玉米锈病发生严重时，叶片上布满孢子堆，造成大量叶片干枯，植株早衰，籽粒不饱满，导致减产，轻者减产10％～20％，重者达30％以上，甚至造成叶片从受害部位折断，全株干枯。
目前对作物锈病的预防以选择抗病性强的种子，加以田间管理。病害发生时常用化学药剂，如0.2％波美度石硫合剂、25％三唑酮可湿性粉剂、25％丙环唑(敌力脱)乳油、43％戊唑醇悬浮剂、65％代森锌可湿性粉剂、百菌清及多菌灵等进行多次喷施治疗。但化学药物会对人畜与环境带来危害。另化学农药利用率不高，约80％～90％的残留在环境中，造成对环境的污染。经常使用化学农药，病菌也产生了抗药性，导致用药次数和用药量的增加，加大了对环境的污染和对生态的破坏，由此形成滥用农药的恶性循环。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种复合微生物菌剂及其应用。本发明提供的复合微生物菌剂，应用于作物锈病的防治，能够提高作物的抗病性，减少锈病的发病率，同时能对前中期发病的锈病起到良好的治疗效果，实现抑菌、防病、键株及增产的效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种复合微生物菌剂，包括枯草芽孢杆菌菌剂、多粘芽孢杆菌-解淀粉芽孢杆菌的混合菌剂、壳寡糖和几丁寡糖；所述枯草芽孢杆菌菌剂、多粘芽孢杆菌-解淀粉芽孢杆菌的混合菌剂的体积与壳寡糖、几丁寡糖的质量比为(40～60)ml:(30～40)ml:(3～6)g:(2～8)g；所述多粘芽孢杆菌-解淀粉芽孢杆菌的混合菌剂是由多粘芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌共同发酵制备得到。
优选地，所述枯草芽孢杆菌菌剂的有效活菌数为3.5×109～5×109cfu/ml，多粘芽孢杆菌-解淀粉芽孢杆菌的混合菌剂的有效活菌数为2×109～5×109cfu/ml。
优选地，所述壳寡糖的分子量为350～2000da，几丁寡糖的分子量为400～1000da。
优选地，所述枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌的种子液以2％～5％的接种量接种于灭菌后的枯草芽孢杆菌发酵液体培养基中在35～40℃发酵48～60h，得到枯草芽孢杆菌菌剂。
优选地，所述枯草芽孢杆菌发酵液体培养基以水为溶剂，每升包括：葡萄糖5～10g、豆饼粉10～20g、酵母浸粉5～10g、魔芋粗粉40～80g、氯化钙2～3g、磷酸氢二钾3～5g、磷酸二氢钾1～2g和硫酸镁0.3～0.5g。
优选地，所述多粘芽孢杆菌-解淀粉芽孢杆菌的混合菌剂的制备方法包括：将多粘芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的种子液混合液，以5％～10％的接种量接种于灭菌后的多粘芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌混合发酵液体培养基中在30～35℃发酵36～48h，得到多粘芽孢杆菌-解淀粉芽孢杆菌的混合菌剂。
优选地，所述多粘芽孢杆菌种子液和解淀粉芽孢杆菌的种子液的体积比为(1.5～2.5):(0.5～1.5)。
优选地，所述多粘芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌混合发酵液体培养基以水为溶剂，每升包括：玉米粉20～40g、豆饼粉30～60g、鸭毛酶解肽10～50g、氯化钙4～5g、磷酸氢二钾1.5～2.5g和磷酸二氢钾0.5～1g。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合微生物菌剂在防治作物锈病中的应用。
优选地，所述作物包括玉米、小麦、梨树、花生、甘蔗、大豆、苹果和向日葵。
本发明的有益效果，与现有技术相比，具有以下优势：
(1)本发明将具有拮抗特性，且能产生抗菌功效的代谢产物的枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌制成复合菌剂，该复合菌剂对锈病菌发生拮抗作用的同时，抗菌代谢产物也作用锈病菌，发挥双重功效，能快速地治疗锈病菌引起的作物的危害。
(2)本发明制备的复合微生物菌剂中添加了壳寡糖与几丁寡糖，它们是小分子信号物质，可进入作物体内刺激诱导作物本身的抗性基因，提高作物自身的抗病性，在作物苗期使用复合微生物菌剂可提高整个生长周期的抗病性，起到良好的预防作用。
(3)本发明在枯草芽孢杆菌发酵繁殖菌体的同时，添加了魔芋粗粉，魔芋粗粉的主要成分是甘露聚糖，枯草芽孢杆菌分解魔芋粗粉的同时，能诱导刺激代谢支路产生更多的抗菌物质，提高菌剂的抗病性。
(4)本发明在多粘芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌混合发酵繁殖的同时，添加了鸭毛酶解肽，其分子量为180～2000，多粘芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌能快速将其利用，形成芽孢的时间缩短，促进了代谢产生较多的抗菌物质，提高菌剂的抗病性。
(5)本发明的复合微生物菌剂对作物锈病的预防发病率可达到94％以上；前期发病的锈病治疗率可达88％以上，中期锈病的治愈率可达到83％以上。
具体实施方式
本发明提供了一种复合微生物菌剂，包括枯草芽孢杆菌菌剂、多粘芽孢杆菌-解淀粉芽孢杆菌的混合菌剂、壳寡糖和几丁寡糖；所述枯草芽孢杆菌菌剂、多粘芽孢杆菌-解淀粉芽孢杆菌的混合菌剂的体积与壳寡糖、几丁寡糖的质量比为(40～60)ml:(30～40)ml:(3～6)g:(2～8)g；所述多粘芽孢杆菌-解淀粉芽孢杆菌的混合菌剂是由多粘芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌共同发酵制备得到。
本发明所述的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法优选包括：将枯草芽孢杆菌的种子液以2％～5％的接种量接种于灭菌后的枯草芽孢杆菌发酵液体培养基中在35～40℃发酵48～60h，得到枯草芽孢杆菌菌剂。在本发明中，所述枯草芽孢杆菌菌剂的有效活菌数优选为3.5×109～5×109cfu/ml，更优选为4×109～4.5×109cfu/ml。
本发明对所述枯草芽孢杆菌的来源没有特殊限定，优选购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。在本发明中，所述枯草芽孢杆菌种子液的制备方法优选为将枯草芽孢杆菌的斜面菌种接种于含1％的魔芋粗粉细菌基础液体培养基中，在30～35℃、180～220r/min摇床培养14～18h，得到枯草芽孢杆菌种子液。在本发明中，所述细菌基础液体培养基以升计，每升优选包括：葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母浸粉5g、nacl5g和余量水。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌发酵液体培养基以水为溶剂，每升优选包括：葡萄糖5～10g、豆饼粉10～20g、酵母浸粉5～10g、魔芋粗粉40～80g、氯化钙2～3g、磷酸氢二钾3～5g、磷酸二氢钾1～2g和硫酸镁0.3～0.5g。
本发明在制备枯草芽孢杆菌菌剂时，优选添加魔芋粗粉，所述魔芋粗粉优选以质量比2:3:5分三次进行添加，在初始发酵培养基中添加总魔芋粗粉量的20％，发酵12小时后再添加总量的30％，发酵24小时后添加剩余的50％。
本发明所述多粘芽孢杆菌-解淀粉芽孢杆菌的混合菌剂的制备方法优选包括：将多粘芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的种子液混合液，以5％～10％的接种量接种于灭菌后的多粘芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌混合发酵液体培养基中在30～35℃发酵36～48h，得到多粘芽孢杆菌-解淀粉芽孢杆菌的混合菌剂。在本发明中，所述多粘芽孢杆菌-解淀粉芽孢杆菌的混合菌剂的有效活菌数优选为2×109～5×109cfu/ml，更优选为3×109～4×109cfu/ml。
本发明对所述多粘芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的来源没有特殊限定，优选购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。在本发明中，所述多粘芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌种子液混合液的制备方法优选为将多粘芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌的斜面菌种分别接种于含0.5％的鸭毛酶解肽的细菌基础液体培养基中，分别在28～32℃、200～250r/min摇床培养15～18h，分别得到多粘芽孢杆菌种子液和解淀粉芽孢杆菌种子液，将多粘芽孢杆菌种子液和解淀粉芽孢杆菌种子液混合得到多粘芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌种子液混合液。在本发明中，所述细菌基础液体培养基以水为溶剂，每升优选包括：葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母浸粉5g和nacl5g。在本发明中，所述所述多粘芽孢杆菌种子液和解淀粉芽孢杆菌的种子液的体积比优选为(1.5～2.5):(0.5～1.5)，更优选为2:1。
在本发明中，所述多粘芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌混合发酵液体培养基以水为溶剂，每升包括：玉米粉20～40g、豆饼粉30～60g、鸭毛酶解肽10～50g、氯化钙4～5g、磷酸氢二钾1.5～2.5g、磷酸二氢钾0.5～1g和余量水。
在本发明中，所述壳寡糖优选分子量为350～2000da的壳寡糖；所述几丁寡糖优选分子量为400～1000da的几丁寡糖。本发明对所述壳寡糖和几丁寡糖的来源没有特殊限定，采用市售产品即可。
在本发明中，所述复合微生物菌剂的制备方法优选为将枯草芽孢杆菌菌剂与多粘芽孢杆菌-解淀粉芽孢杆菌的混合菌剂混和后，再与壳寡糖、几丁寡糖混合，得到复合微生物菌剂。本发明对所述混合的方法没有特殊限定，采用常规混合方法即可。在本发明中，所述复合微生物菌剂的有效活菌数优选为6×109～10×109cfu/ml，更优选为7×109～8×109cfu/ml。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合微生物菌剂在防治作物锈病中的应用。本发明对所述作物的种类没有特殊限定，优选包括玉米、小麦、梨树、花生、甘蔗、大豆、苹果和向日葵。
在本发明中，所述复合微生物菌剂的使用方法优选为在作物苗期将复合微生物菌剂稀释500～800倍对叶面进行喷施，共喷施三次，每次喷施后间隔10天再进行喷洒；在锈病发病初期，将复合微生物菌剂稀释100～200倍对叶面进行喷施，共喷施两次，每次喷施后间隔一天再喷施一次；在锈病发病中期，将复合微生物菌剂不进行稀释对叶面连续三天喷施。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
复合微生物菌剂的制备方法：
(1)配制含10g/l魔芋粗粉的细菌基础液体培养基，无菌条件下将枯草芽孢杆菌的斜面菌种接种，于32℃、200r/min摇床培养16h，得到种子液；
配制含5g/l的鸭毛酶解肽的细菌基础液体培养基，将多粘芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌的菌种分别接种，于30℃、220r/min摇床培养18h，得到种子液；
(2)发酵罐中配制枯草芽孢杆菌发酵液体培养基100l，各成分含量为：葡萄糖500g，豆饼粉1000g，酵母浸粉500g，魔芋粗粉800g，cacl2200g，k2hpo4300g，kh2po4100g，mgso430g，ph6.0。灭菌后接种枯草芽孢杆菌种子液2l，控制发酵温度35℃，转速300r/m；发酵12h时，补加1.2kg魔芋粗粉，发酵24h时，补加2kg魔芋粗粉，总发酵时间为60h，收集全部发酵产物，测定枯草芽孢杆菌活菌数为7.3×109cfu/ml；
(3)发酵罐中配制多粘芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌混合发酵液体培养基100l，各成分含量为：玉米粉2000g，豆饼粉3000g，鸭毛酶解肽1000g，cacl2400g，kh2po450g，k2hpo4150g，ph6.5。先将两菌种的种子培养液按质量分数2:1比例混合，接种5l混合种子液于发酵培养基中，控制发酵温度30℃，转速300r/m，发酵60h后，收集全部发酵产物，测定两种芽孢杆菌混合的活菌总数为6×109cfu/ml；
(4)将枯草芽孢杆菌菌剂60ml、多粘芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌混合菌剂30ml，投入混合罐中，搅拌混匀，再往混合罐中投入壳寡糖6g，几丁寡糖8g，搅拌促进溶解，得到复合微生物菌剂，其总活菌数为6.86×109cfu/ml。
实施例2
复合微生物菌剂的制备方法：
(1)发酵罐中配制枯草芽孢杆菌发酵液体培养基100l，各成分含量为：葡萄糖800g，豆饼粉1500g，酵母浸粉750g，魔芋粗粉1200g，cacl2250g，k2hpo4400g，kh2po4140g，mgso440g，ph6.5。接种枯草芽孢杆菌种子液5l，控制发酵温度37℃，转速400r/m；发酵12h时，补加1.8kg魔芋粗粉，发酵24h时，补加3kg魔芋粗粉，总发酵时间为60h，收集全部发酵产物，测定枯草芽孢杆菌活菌数为8.2×109cfu/ml；
(2)发酵罐中配制多粘芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌混合发酵液体培养基100l，各成分含量为：玉米粉3000g，豆饼粉4500g，鸭毛酶解肽3000g，cacl2450g，kh2po470g，k2hpo4200g，ph6.5。先将两菌种的种子培养液按质量分数2:1比例混合，接种10l混合种子液于发酵培养基中，控制发酵温度32℃，转速400r/m，发酵60h后，收集全部发酵产物，测定两种芽孢杆菌混合的活菌总数为7.5×109cfu/ml；
(3)将枯草芽孢杆菌菌剂50ml、多粘芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌混合菌剂35ml，投入混合罐中，搅拌混匀，再往混合罐中投入壳寡糖3.5g，几丁寡糖4g，搅拌促进溶解，得到复合微生物制剂，其总活菌数为7.9×109cfu/ml。
枯草芽孢杆菌种子液，多粘芽孢杆菌-解淀粉芽孢杆菌种子液的制备方法同实施例1。
实施例3
复合微生物菌剂的制备方法：
(1)发酵罐中配制枯草芽孢杆菌发酵液体培养基100l，各成分含量为：葡萄糖1000g，豆饼粉2000g，酵母浸粉1000g，魔芋粗粉1600g，cacl2300g，k2hpo4500g，kh2po4200g，mgso450g，ph6.5。接种枯草芽孢杆菌种子液5l，控制发酵温度37℃，转速400r/m；发酵12h时，补加2.4kg魔芋粗粉，发酵24h时，补加4kg魔芋粗粉，总发酵时间为60h，收集全部发酵产物，测定枯草芽孢杆菌活菌数为9.6×109cfu/ml；
(2)发酵罐中配制多粘芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌混合发酵液体培养基100l，各成分含量为：玉米粉4000g，豆饼粉6000g，鸭毛酶解肽5000g，cacl2500g，kh2po4100g，k2hpo4250g，ph6.5。先将两菌种的种子培养液按质量分数2:1比例混合，接种10l混合种子液于发酵培养基中，控制发酵温度32℃，转速400r/m，发酵60h后，收集全部发酵产物，测定两种芽孢杆菌混合的活菌总数为8.8×109cfu/ml；
(3)将枯草芽孢杆菌菌剂40ml、多粘芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌混合菌剂40ml，投入混合罐中，搅拌混匀，再往混合罐中投入壳寡糖3g，几丁寡糖3g，搅拌促进溶解，得到复合微生物制剂，其总活菌数为7.3×109cfu/ml。
枯草芽孢杆菌种子液，多粘芽孢杆菌-解淀粉芽孢杆菌种子液的制备方法同实施例1。
实施例4
使用实施例1～3所述的复合微生物菌剂在小麦分蘖期开始，稀释不同的倍数，对叶面喷施，间隔10天再喷施一次，总共喷施3次。以水作对照。预防锈病的结果见表1。
表1复合微生物菌剂与对照(水)比较在小麦苗期喷施对锈病的预防效
果
由表1可知，使用实施例1～3的复合微生物菌剂，小麦锈病发病率较对照组显著降低。
实施例5
使用实施例1～3所述的复合微生物菌剂在玉米苗期开始，稀释不同的倍数，对叶面喷施，间隔10天再喷施一次，总共喷施3次。以水作对照。预防锈病的结果见表2。
表2复合微生物菌剂与对照(水)比较在玉米苗期喷施对锈病的预防效果
由表2可知，使用实施例1～3的复合微生物菌剂，玉米锈病发病率较对照组显著降低。
实施例6
使用实施例1～3的复合微生物菌剂在小麦锈病发生的不同时期，稀释不同的倍数后对液面进行喷施，以50％多菌灵可湿性粉剂化学农药为对照，防治结果见表3。
表3复合微生物菌剂与多菌灵对小麦锈病的防治效果
由表3可知，实施例1～3的复合微生物菌剂，对小麦锈病的防治效果达到86％～89％。
实施例7
使用实施例1～3的复合微生物菌剂在玉米锈病发生的不同时期，稀释不同的倍数后对液面进行喷施，以50％多菌灵可湿性粉剂化学农药为对照，防治结果见表4。
表4复合微生物菌剂与多菌灵对玉米锈病的防治效果
由表4可知，实施例1～3的复合微生物菌剂，对玉米锈病的防治效果达到83％～86％。
由实施例4～7可知，利用本发明的复合微生物菌剂能够较好的用于防治作物锈病。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。