一种鉴定自花授粉植物异交率的方法与流程

本发明涉及作物杂交选育
技术领域：
，具体而言，涉及一种鉴定自花授粉植物异交率的方法。
背景技术：
：异交率(outcrossingrate)是指植物不同个体间发生杂交的概率。研究植物异交率主要有两种方法：间接法和直接法。间接法又叫居群结构方法(populationstructureapproach，psa)，是通过居群的自交系数(inbreedingcoefficient，fis)和异交率的关联关系，估计异交率的方法(li，1955)。间接法由于以居群为单位进行异交率估计，所得到的结果代表居群异交率，间接法无法了解群内各家系的异交率和变异情况。间接法主要用于分析生物血缘，时间跨度较长的进化分析。直接法又叫后代检测方法(progeny-arrayapproach，paa)，是检测特定母株后代中杂交后代的比例以估计母株异交率的方法(jarneetal.，2008)。例如，当检测来自同一母株的10个后代中出现5个异交后代，则母株的异交率即为50％。从传统的观点看，大豆是一种典型的自花授粉作物，天然异交率很低，在0.03％-19％之间(caviness，1966；carlsonandlersten，1987；sunetal.，1992；ahrentandcavinsee，1994；fujitaetal.，1997；jeffery，2003)。通过母本(不育系，代号：a-lines)×父本(恢复系，代号：r-lines)进行杂交获得的杂交种作为市场销售的杂交大豆种子。其中不育系(a-lines)的繁殖还需要母本(不育系，a-lines)×父本(保持系，b-lines)进行杂交获得；恢复系为可育材料，正常繁殖。大豆人工杂交困难且天然异交率非常低，风力传粉的可能性微乎其微(赵丽梅等，1999)。专利(cn1391795a)大豆杂交种制种方法中所声明的以花蓟马作为大豆授粉昆虫，目前未见应用于大田生产。为了保证不育系繁殖、杂交种制种产量，需要选育出来的杂交种不仅具有优势目标性状(高产、高油、高蛋白等)，同时要保证作为母本的不育系材料具有高异交率性状。选择有产量潜力或针对某一优异性状的亲本，需要经过至少五代以上的回交转育，才能获得稳定的不育系。而在生产上应用上述回交转育的不育系时，却发现其异交性能低，繁殖系数小，制种成本高，无法继续使用，将会导致大量时间、精力的浪费。因此，对可育材料入选杂交组合之前进行异交率性状的提前甄别，将加快杂交大豆育种的进程。现有技术大多通过测定雄性不育植株异交结实率来计算异交率，这种方法受到雄性不育株在生理和代谢缺陷上的影响，难以全面的反映正常大豆群体的异交率。鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种鉴定自花授粉植物异交率的方法。该方法应用后代检测方法，根据子代抗除草剂的植株数量鉴定所述待测的自花授粉植物的异交率，可以对自花授粉植物进行异交率性状的评估，省去了多代回交转育不育系的中间环节，也避免了雄性不育植株由于生理和代谢缺陷上的差异导致异交结实率不准确从而无法全面的反映正常自花授粉植物的异交率，对可育材料入选杂交组合之前进行异交率性状的提前甄别，有利于加快杂交植物育种的进程，降低了制种成本。本发明是这样实现的：一种鉴定自花授粉植物异交率的方法，上述方法包括：选择待测的自花授粉植株作为母本，选择携带抗除草剂基因的自花授粉植株作为父本，在指定授粉昆虫或封闭条件下天然进行杂交，统计子代抗除草剂的植株数量，根据子代抗除草剂的植株数量鉴定待测的自花授粉植物的异交率。在本发明应用较佳的实施例中，上述抗除草剂基因能抗除草剂。当喷施除草剂时，非异交自花授粉植物由于不含抗除草剂基因而代谢异常，进而枯萎，死亡，而异交自花授粉植物由于核基因组中通过杂交含有抗除草剂基因能够耐除草剂，正常存活，最后统计正常存活的自花授粉植株，计算得到待测自花授粉植株的异交率。待测的自花授粉植物的异交率通过如下公式计算：异交率＝子代抗除草剂的植株数量/子代总植株数。方法还包括：将杂交获得的种子培养至子叶期，喷施与抗除草剂基因相对应的除草剂，根据子代抗除草剂的植株数量鉴定待测的自花授粉植物的异交率。除草剂的喷施浓度为0.27％-0.59％；优选的，除草剂的喷施浓度为0.37％-0.59％；更优选的，除草剂的喷施浓度为0.59％。在本发明提供的除草剂喷施浓度范围内能够高效的筛分出异交自花授粉植物，若高于该喷施浓度，则正常的抗性异交自花授粉植物也会植株叶片枯萎，影响正常生长发育，无法筛分出异交自花授粉植物；若低于该喷施浓度，则非异交自花授粉植物叶片部分枯萎，甚至会在后续一段的培养时间通过植株的自身生理代谢耐受除草剂，恢复叶片颜色及正常的生长发育，导致无法区分出异交自花授粉植物。在本发明应用较佳的实施例中，上述抗除草剂基因为epsps、ahas、gat、gat4621、sxglr-11或其组合；优选的，所述抗除草剂基因为epsps。在本发明应用较佳的实施例中，上述抗除草剂基因的组合可以是epsps和gat的串联组合，epsps和gat4621的串联组合，epsps和sxglr-11的串联组合中的任意一种，也可以是抗除草剂基因epsps、gat、gat4621、sxglr-1分别整合于不同的染色体上。在本发明应用较佳的实施例中，上述携带抗除草剂基因的自花授粉植株也可以是通过化学诱变或辐射诱变选育的抗除草剂基因的自花授粉植株。在本发明应用较佳的实施例中，上述待测的自花授粉植株选自大豆，油菜、水稻、芝麻、花生、绿豆、苏子、草莓或西红柿；优选的，所述待测的自花授粉植株选自大豆。在本发明应用较佳的实施例中，上述携带抗除草剂基因的自花授粉植株为h03-06-4。在本发明应用较佳的实施例中，上述当喷施除草剂4-7天后，调查植株叶片颜色，统计亲本子代抗除草剂植株数，并计算待测自花授粉植株的异交率。若调查统计植株叶片的颜色时间在7天后，部分非异交自花授粉植株可能恢复生长代谢，使叶片恢复颜色，不利于后续植株耐受除草剂的甄别。若调查统计植株叶片的颜色时间在4天内，部分非异交自花授粉植株可能尚未发生生理阻遏，叶片颜色也不易甄别。在本发明应用较佳的实施例中，上述指定授粉昆虫为蜜蜂。通过提供蜜蜂对自花授粉植物进行授粉，有效提升了自花授粉植物杂交率。在本发明应用较佳的实施例中，上述使用蜜蜂作为虫媒进行传粉时，设置24平方米放蜂1500只，设置72平方米放蜂3000只。此外，在大面积制种中，可以提高放蜂的数量。在本发明应用较佳的实施例中，上述将父本和母本间隔种植，父本和母本的垄距为60-65cm，父本和母本的株距均为10-20cm。本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种鉴定自花授粉植物异交率的方法，该方法利用抗除草剂基因能抗除草剂。当喷施除草剂时，非异交自花授粉植物由于不含抗除草剂基因而代谢异常，进而枯萎，死亡，而异交自花授粉植物由于核基因组中通过杂交含有抗除草剂基因能够耐除草剂，正常存活，最后统计正常存活的自花授粉植物，计算得到待测自花授粉植物的异交率。这种方法根据子代抗除草剂的植株数量鉴定所述待测的自花授粉植物的异交率，对于自花授粉植物异交率鉴定提供了新思路，省去了多代回交转育不育系的中间环节，降低了制种成本。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为网室立体图；图2为网室的截面图；图3为网室的俯视图；图4为育种箱定穴板种植示意图；图5为实施例2中草甘膦喷施浓度结果图；图6为不同生长期的大豆植株长势图；图7为实施例3中不同生长期的大豆植株草甘膦耐受性结果图；图8为实施例4中后代群体栽培鉴定图；图9为实施例5中后代群体栽培鉴定图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。一种鉴定大豆异交率的方法，具体包括如下依次进行的步骤：1.异源花粉在蜜蜂授粉条件下的传输：在第一年春，将待测大豆种质资源作为母本，h03-06-4(抗草甘膦转基因自选品系)作为父本种质在同一网室(4m×6m×2m或6m×18m×2m)内，网室立体图参照图1所示，网室的截面图和俯视图分别参照图2和图3所示，每穴2-3粒穴播，出苗后定苗1株。田间管理同大田生产田，开花前及时除草除虫，开花后禁止施用杀虫剂，避免对授粉昆虫蜜蜂造成危害。每份待测大豆种质种植3-20穴。开花前覆盖尼龙网，孔目1.5mm，父母本间隔种植，垄距60-65cm，株距10-20cm，开花期放置蜜蜂蜂箱。在整个大豆开花期，对蜜蜂进行饲喂，维持蜜蜂蜂群密度。开花期结束，撤离蜜蜂蜂箱，撤除尼龙网。本发明实施例中网室用于提供一个可控蜂群及授粉源的结构，在其他实施例中也可以通过其他简易装置实现授粉源的控制。2.待测大豆种质后代异交种子的检测：在第一年秋，将步骤1网室内种质的待测大豆种质按单株收获(每株对应一个株系)。将收获的种子在育种箱中按照株系种植，在其他实施例中，参照图4所示，也可以采用育种箱定穴板进行种植。对每个株系设置标签，以便于调查。设置种植深度为1-4cm，顶层覆盖育苗基质土或草炭土，防治灌溉时土壤表面板结。及时灌溉，经13-20天，当植株处于2个叶片的子叶期时，对这些植株喷施草甘膦除草剂，喷施时注意药液施于植株叶片，尽量避免喷施于表层土壤。再经过6-7天，调查存活植株，存活植株判定为母株的异交粒，根据以下公式计算待测种质的异交率：此外，在其他实施例中，也可以将步骤1收获的种子在室内进行培养，待长至2个叶片的子叶期时，对这些植株喷施草甘膦除草剂，因此，可以在一年内实现待测种质异交率的鉴定，极大缩短了育种周期。实施例1将jlcms82b和jlcms89b作为两种母本待测大豆品系，h03-06-4作为父本种植在同一网室(4m×6m×2m)，开花前覆盖尼龙网，孔目1.5mm，父母本间隔种植，垄距60cm，株距10cm，开花期放置蜜蜂蜂箱，共3个网室(a、b和c)，每个网室的待测材料jlcms82b和jlcms89b各选取5株。通过后代草甘膦抗性检测统计jlcms82b和jlcms89b大豆异交率。jlcms82b和jlcms89b品种的大豆异交率参照表1所示：表1jlcms82b和jlcms89b品种的大豆异交率由表1可知，大豆品种jlcms82b的异交率明显高于jlcms89b。实施例2本实施例对生长至2个叶片的子叶期的正常非转基因大豆和抗草甘膦大豆同时进行4.1％，1.36％，0.82％，0.59％，0.45％，0.37％，0.31％，0.27％，0.24％和0.21％共10个有效成分浓度的喷施对比试验，喷施5天后的结果参照图5所示。每个育种箱分为上下两个区域，上下两个区域中间间隔一行设置，上面区域种植有5行h03-06-4(抗草甘膦大豆自选品系)，下面区域种植有5行吉育47(非抗草甘膦大豆品种)，由图5可知，当喷施草甘膦有效浓度为0.59％时，非转基因大豆能在5天内全部枯萎，而抗草甘膦大豆的植株叶片颜色均未受损，长势未受影响。当喷施草甘膦有效浓度大于0.59％时，非转基因大豆能在5天内全部枯萎，而部分抗草甘膦大豆的植株叶片颜色变黄，生长受抑制。当喷施草甘膦有效浓度低于0.59％时，部分非转基因大豆在5天内叶片没有呈现严重枯萎，继续观察，在后续生长期内恢复绿色，抗草甘膦大豆的植株叶片颜色无明显变化，生长正常。因此，当草甘膦有效喷施浓度为0.59％时，鉴定效果最佳。实施例3本实施例对不同生长期的大豆植株进行草甘膦耐受试验，不同生长期的大豆植株参照图6所示。对照组为抗草甘膦大豆h03-06-4，实验组为常规非转基因大豆品种(吉林47)，两个处理组的水，氧，温度，肥料等条件均一致，种植时间相同，喷施有效浓度为0.59％的草甘膦时间相同。分别将对照组长至ve(发芽期)，vc(子叶期)，v2，v3，v5，r1，r5期的植株喷施0.59％的草甘膦，实验组的处理与对照组相同。在喷施5天后观察结果，草甘膦的喷施期在vc(子叶期)、v2和v3期时实验组(左)大豆品种全部枯萎，而对照组(右)的大豆品种未受影响，喷施效果较好。而在ve期以及r5期的实验组大豆品种喷施鉴定效果较差，试验结果参照图7所示。本发明通过选择2-3个叶片子叶期作为最适喷施时期，一方面可以缩短鉴定周期，另一方面有利于降低喷施除草剂的成本。实施例4本实施例实际提供了针对1034株大豆资源的异交率统计，将1034株大豆资源作为母本，h03-06-4作为父本种植在同一网室内。开花前覆盖尼龙网，孔目1.5mm，父母本间隔种植，垄距为60cm，株距为10cm，在开花期放置蜜蜂蜂箱。采用有效浓度为0.59％的草甘膦喷施后代群体，测得每株大豆资源的异交率，参照图8和表2所示。去除受冷害影响，未出苗或死苗情况，共检测868株大豆资源。表2868个待测大豆种质异交率数据统计表实施例5本实施例实际提供了针对水稻品种吉粳88的异交率鉴定，将10株水稻品种吉粳88作为母本，k12-08作为父本种植在同一水稻苗池内。其中k12-08为通过ems诱变产生的水稻草甘膦抗性品系。父母本间隔种植，行距为30cm，株距为20cm，开花前插入支杆立柱，覆盖尼龙网，孔目1.5mm，网内放置蜜蜂蜂箱。采用有效浓度为0.27％的草甘膦喷施吉粳88收获的后代群体，测得每株吉粳88的异交率，参照图9和表3所示。去除受冷害影响，未出苗或死苗情况，共检测6株水稻。表36株待测水稻种质异交率数据统计表编号异交粒数总粒数异交率1626710.002242336520.000823232710.0006140402605726380.002656532190.00155以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12