一种微量精子冷冻和解冻方法及其自动夹具装置与流程

本发明属于人类辅助生殖领域，具体涉及一种微量精子冷冻和解冻方法及其自动夹具装置。

背景技术：

环境污染日趋严重、激素滥用等导致男性精子质量和数量不断下降，男性不育比例日益增高，世界范围内由于男性不育问题导致的不育大约占40-50%，而无精子症大约占男性不育问题的10%，影响着全世界1%的男性人群，而且无精子症的发生率会逐渐升高。

无精子症患者在以前是无法拥有自己遗传学意义上的孩子，而随着辅助生殖技术的发展，无精子症患者可以通过经皮附睾精子抽吸术（pesa）、睾丸切开取精术（tesa）、显微睾丸切开取精术（mese）等技术来获取少量的精子，再通过卵胞浆内单精子注射（icsi）将精子注射到卵母细胞中，最后将形成的胚胎移植到女性宫腔内获得临床妊娠。但是反复的取精术可能造成睾丸、附睾组织纤维化，导致睾丸萎缩、生精功能退化。因此将少量活动精子冷冻保存起来，既减轻患者因为反复穿刺所带来的痛苦和经济负担，又可以很大程度上避免取卵日因无可用精子而取消受精。

目前的微量精子冷冻有空透明带、冷冻环、icsi针、微型麦管等多种方法，但缺乏实用性。传统的精子冷冻采用1.8ml的冷冻管(cryovial)作为冷冻载体，精子复苏存活率、回收率都很低，所以不适用于对穿刺获得的精子进行冷冻保存。

曾有中国专利申请200810042695.4提供了一种微量精子的冷冻和解冻方法及精子的冷冻和解冻装置，但该方法需要制造饱和湿度条件的专用湿盒，以保证冷冻过程中微滴不蒸发，操作过程繁琐、耗时长，这极大限制了该发明在临床上的广泛使用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种微量精子冷冻和解冻方法及其自动夹具装置，以解决上述背景技术中提出的的问题。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种微量精子冷冻和解冻方法，包括以下步骤：

s1、精子的冷冻：首先将精液富集优化后，再将精子与冷冻保护剂1:1混合均匀后得到冷冻液滴并置于常温下备用，向液氮盒内注入液氮，使得液氮注入量为液氮盒的二分之一容积，使用自动夹具装置对冷冻载杆进行夹持，冷冻载杆距离液氨蒸气面20cm，将混合后的冷冻液滴以5-10ul量滴入在冷冻载杆的片部，通过自动夹具装置以5cm/分钟的速度下降至液氮面5cm位置，再以1cm/分钟的速度将冷冻载杆降入液氮中，进行长期保存；

s2、精子的解冻：首先进行解冻前准备，对矿物油覆盖的缓冲培养液进行预温30min，使得缓冲培养液温度稳定在34-37摄氏度，将冷冻载杆从液氮中取出并在1-3秒时间内置于预温完成的缓冲培养液内复温解冻，用于单精子卵胞浆注射icsi。

优选的，在s1中，自动夹具装置按照指定的速度匀速的将冷冻载杆降入液氮中的步骤为：首先向上提拉上拉手柄使得上拉手柄远离上夹板，将冷冻载杆插入窄条夹紧槽内，使得冷冻载杆被夹紧弹片卡紧固定，然后松开上拉手柄，在夹紧弹簧的拉拽下使得下夹板和上夹板对冷冻载杆进行夹持固定，保持冷冻载杆的片部与液氮蒸气面成十五度夹角倾斜状态放置，然后通过提升电机驱动由聚四氟乙烯材料制成的提升螺杆顺时针匀速旋转，提升螺杆旋转时带动导向杆在导向柱的导向下进行匀速下降，在冷冻载杆完全浸入液氮盒内的液氮中后停止提升电机工作，待精子冷冻完成后，将外套管装入载杆，再通过上拉手柄将上夹板提升，载有精子的载体自然脱离夹具装置进入液氮内进行长期储存。

优选的，在s2中，将冷冻载杆从液氮中取出的步骤为：首先核对患者夫妇标签正确，将冷冻载杆从液氮罐转入液氮盒内，液氮盒中取出冷冻载杆并在1-3秒时间内置于预温完成的缓冲培养液内复温解冻，直至冷冻液滴完全融入培养液内，显微镜下观察精子活力及形态，选取形态正常及有活力的精子用于单精子卵胞浆注射icsi。

另外本发明还提供了：一种自动夹具装置，包括液氮盒和冷冻载杆，所述液氮盒的内侧底部放置有固定架，所述固定架的顶部固定有提升电机，所述提升电机的输出轴固定连接有贯穿固定架的提升螺杆，所述固定架的内侧两部固定有导向柱，两个所述导向柱分别贯穿下夹板的两侧，所述下夹板的顶部固定有导向杆，所述导向杆的外侧滑动套接有套管，所述套管的底部和顶部分别固定有套接于导向杆外侧的上夹板和上拉手柄，所述上夹板的底部两侧均通过夹紧弹簧连接于下夹板的顶部，所述导向杆的顶部开设有螺纹孔，所述提升螺杆与螺纹孔螺纹连接，所述导向杆的顶部固定有套接于提升螺杆外侧的固定把手，所述下夹板的顶部均匀开设有窄条夹紧槽，所述窄条夹紧槽的两内侧壁均固定有夹紧弹片，所述冷冻载杆插入于窄条夹紧槽内，所述窄条夹紧槽与夹紧弹片紧密贴合，所述冷冻载杆包括片部和杆部。

优选的，所述下夹板的两侧顶部均开设有与导向柱相匹配的导向孔，所述导向柱插入于导向孔内。

优选的，所述固定架包括第一支撑柱、横板、底座和站脚，所述底座的底部两侧均固定有站脚，所述底座的顶部两侧均固定有第一支撑柱，所述第一支撑柱的顶部固定于横板的底部。

优选的，所述导向柱的顶部固定于横板的底部，所述导向柱的底部固定于底座的顶部。

优选的，所述窄条夹紧槽的内腔尺寸为：高为2.4mm、宽为2.4mm。

优选的，所述片部为长片状或者槽状设置，所述夹紧弹片、夹紧弹簧的材质均为304不锈钢。

优选的，所述固定架、固定把手、上拉手柄、套管、上夹板、下夹板和导向柱的材质均为聚四氟乙烯材料。

本发明的技术效果和优点：本发明提出的一种微量精子冷冻和解冻方法及其自动夹具装置，与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明可对多根冷冻载杆同时进行冷冻，操作更加方便、高效快捷，冷冻载杆上的精子微滴受冷凝器熏蒸更均匀，更准确，极大提高微量精子的冷冻复苏率；同时又减少了操作人员的失误和冻伤；

2、本发明冷冻载杆前端呈片状或槽状装载精子，精子置于前端的载体微滴中冷冻，在热的矿物油覆盖的缓冲培养液内复温解冻，精子回收率接近100％。自动夹具装置可以一次性装载8根冷冻载杆，操作更加方便、高效快捷，减少操作人员的失误和冻伤。本发明很好地解决了目前精子冻存技术中出现的严重少弱精子、睾丸、附睾精子冻存后精子回收容易失败的难题，使无精子症患者接受辅助生育治疗的灵活性极大提高。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为本发明的固定架结构示意图；

图3为本发明的下夹板结构示意图；

图4为本发明的夹紧弹片结构示意图；

图5为本发明的冷冻载杆结构示意图。

图中：1、液氮盒；2、固定架；3、第一支撑柱；4、横板；5、提升电机；6、提升螺杆；7、固定把手；8、导向杆；9、上拉手柄；10、套管；11、上夹板；12、下夹板；13、导向柱；14、夹紧弹簧；15、导向孔；16、窄条夹紧槽；17、螺纹孔；18、夹紧弹片；19、冷冻载杆；20、底座；21、站脚；22、片部；23、杆部。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

本发明提供了如图1-5所示的一种微量精子冷冻和解冻方法，包括以下步骤：

s1、精子的冷冻：首先将精液富集优化后，再将精子与冷冻保护剂1:1混合均匀后得到冷冻液滴并置于常温下备用，向液氮盒内注入液氮，使得液氮注入量为液氮盒的二分之一容积，使用自动夹具装置对冷冻载杆进行夹持，冷冻载杆距离液氨蒸气面20cm，将混合后的冷冻液滴以5-10ul量滴入在冷冻载杆的片部，通过自动夹具装置以5cm/分钟的速度下降至液氮面5cm位置，再以1cm/分钟的速度将冷冻载杆降入液氮中，待精子冷冻完成后，安装冷冻载杆外套管，通过上拉手柄将上夹板拉开，载杆自然脱离置冷冻盒，而对精子进行长期保存；自动夹具装置按照指定的速度匀速的将冷冻载杆降入液氮中的步骤为：首先向上提拉上拉手柄使得上拉手柄远离下夹板，将冷冻载杆插入窄条夹紧槽内，一次可插入8根载杆，使得冷冻载杆被夹紧弹片卡紧固定，然后松开上拉手柄，在夹紧弹簧的拉拽下使得下夹板和上夹板对冷冻载杆进行夹持固定，保持冷冻载杆的片部与液氮蒸气面成十五度夹角倾斜状态放置，然后通过提升电机驱动由聚四氟乙烯材料制成的提升螺杆顺时针匀速旋转，提升电机选用全封闭自冷不锈钢电机，提升螺杆旋转时带动导向杆在导向柱的导向下进行匀速下降，在冷冻载杆完全浸入液氮盒内的液氮中后停止提升电机工作，待精子冷冻完成后，将外套管装入载杆，再通过上拉手柄将上夹板提升，载有精子的载体自然脱离夹具装置进入液氮内进行长期储存；

s2、精子的解冻：首先进行解冻前准备，对矿物油覆盖的缓冲培养液进行预温30min，使得缓冲培养液温度稳定在34-37摄氏度，将冷冻载杆从液氮中取出并在1-3秒时间内置于预温完成的缓冲培养液内复温解冻，直至冷冻液滴完全融入培养液内，显微镜下观察精子活力及形态，选取形态正常及有活力的精子用于单精子卵胞浆注射icsi。

另外本发明还提供了：一种自动夹具装置，包括液氮盒1和冷冻载杆19，所述液氮盒1的内侧底部放置有固定架2，所述固定架2的顶部固定有提升电机5，所述提升电机5的输出轴固定连接有贯穿固定架2的提升螺杆6，所述固定架2的内侧两部固定有导向柱13，两个所述导向柱13分别贯穿下夹板12的两侧，所述下夹板12的顶部固定有导向杆8，所述导向杆8的外侧滑动套接有套管10，所述套管10的底部和顶部分别固定有套接于导向杆8外侧的上夹板11和上拉手柄9，所述上夹板11的底部两侧均通过夹紧弹簧14连接于下夹板12的顶部，所述导向杆8的顶部开设有螺纹孔17，所述提升螺杆6与螺纹孔17螺纹连接，所述导向杆8的顶部固定有套接于提升螺杆6外侧的固定把手7，所述下夹板12的顶部均匀开设有窄条夹紧槽16，所述窄条夹紧槽16的两内侧壁均固定有夹紧弹片18，所述冷冻载杆19插入于窄条夹紧槽16内，所述窄条夹紧槽16与夹紧弹片18紧密贴合，所述冷冻载杆19包括片部22和杆部23。片部22的大小为可以承载5.0-10.0ul的冷冻液微滴，冷冻载杆19以聚苯乙烯材料制成。在进行精子冷冻操作时，将8支冷冻载杆19在脱离液氮蒸汽表层状态下依次插设在窄条夹紧槽16内，通过夹紧弹片18及夹紧弹簧14将冷冻载杆19夹紧，通过提升螺杆6将载有精子的冷冻载杆19送入液氮盒1内进行冷冻，待精子冷冻完成后，通过上拉手柄9将上夹板11提升，载有精子的冷冻载杆19自然脱离夹具装置进入液氮内进行储存。所述下夹板12的两侧顶部均开设有与导向柱13相匹配的导向孔15，所述导向柱13插入于导向孔15内。所述固定架2包括第一支撑柱3、横板4、底座20和站脚21，所述底座20的底部两侧均固定有站脚21，所述底座20的顶部两侧均固定有第一支撑柱3，所述第一支撑柱3的顶部固定于横板4的底部。所述导向柱13的顶部固定于横板4的底部，所述导向柱13的底部固定于底座20的顶部。所述窄条夹紧槽16的内腔尺寸为：高为2.4mm、宽为2.4mm。所述片部22为长片状或者槽状设置，所述夹紧弹片18、夹紧弹簧14的材质均为304不锈钢。所述固定架2、固定把手7、上拉手柄9、套管10、上夹板11、下夹板12和导向柱13的材质均为聚四氟乙烯材料，冷冻载杆19采用聚苯乙烯制成。

工作原理：在将首先向上提拉上拉手柄使得上拉手柄远离下夹板，将冷冻载杆19插入窄条夹紧槽16内，共设置8个窄条夹紧槽16，一次可插入8根冷冻载杆19，使得冷冻载杆19被夹紧弹片18卡紧固定，然后松开上拉手柄9，在夹紧弹簧14的拉拽下使得下夹板12和上夹板11对冷冻载杆19进行夹持固定，保持冷冻载杆19的片部22与液氮蒸气面成十五度夹角倾斜状态放置，然后通过提升电机5驱动由聚四氟乙烯材料制成的提升螺杆6顺时针匀速旋转，提升电机5选用全封闭自冷不锈钢电机，提升螺杆6旋转时带动导向杆8在导向柱13的导向下进行匀速下降，冷冻载杆19下降至液氮内，套上外套管，通过抬高上拉手柄9，冷冻载杆19自然脱离自动夹具装置而置于液氮盒1内，装入支架转入液氮罐进行长期保存。。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。