一种组织培养快速繁殖木薯种苗的方法与流程

本发明属于植物组织培养技术，具体涉及一种组织培养快速繁殖木薯种苗的方法。

背景技术：

木薯(manihotesculentacrantz)是大戟科木薯属灌木，原产于南美洲的热带地区。木薯是世界主粮之一，块根中含有丰富的淀粉，有着“淀粉之王”、“地下粮仓”等美称，与马铃薯、红薯并列称为世界三大薯类作物；同时它的单位面积提供的食物能量超过水稻、小麦、玉米和高粱，是人类主要的食用作物资源之一。木薯全年皆可种植，具有粗生易栽，耐干旱，耐贫瘠，病虫害少的优点，并且单产量较高，是一种理想的农作物。我国在19世纪20年代引种，现主要栽培于江西、广西、广东、海南、福建和四川等省份。

传统的种茎扦插繁殖方式存在繁殖率低、周期长和运输不便等问题；长期的无性繁殖导致品种严重退化，产量大幅降低，迫切需要对木薯栽培品种进行脱毒改良，建立快速繁殖体系。传统的种子繁殖方式易造成木薯后代单株之间差异较大，难以稳定保持优良性状。组织培养快繁技术是以优良无性系为外植体，通过无菌培养快速得到组培苗；该技术具有产量高，易于生产管理、且能保持原有品种的优良性状等优点，可以有效克服传统无性繁殖和种子繁殖存在的问题。

本发明采用木薯茎段为外植体，建立了快速高效的快繁体系，并有效克服传统繁殖周期长、品种严重退化以及产量大幅降低的问题，大大降低了木薯种苗培育的成本，可应用于大规模生产木薯种苗和科学研究。

技术实现要素：

基于上述背景技术中提到的问题，本发明拟提供一种木薯的茎段组织培养快繁种苗的方法，解决现有技术存在的繁殖周期长、用种量大和品种严重退化的问题。

本发明包括以下步骤：

(1)外植体选择：选择健壮无病害、生长旺盛的植株，剪取距茎顶端约10厘米幼嫩茎段。从叶柄基部切除叶片，剪取带有腋芽的茎段，即为外植体。

(2)外植体消毒：将步骤(1)中的外植体用自来水冲洗10分钟，清除尘土和碎屑，再完全浸没于饱和洗衣粉溶液10分钟，流水冲洗30-60分钟，将洗好的茎段放入广口瓶，在无菌工作台上利用两步法脱毒，即75％酒精消毒20秒，无菌水冲洗2-3次，用0.1％升汞消毒6分钟，无菌水冲洗3-4次，置于无菌滤纸上吸干表面水分，最后将外植体剪成约1厘米茎段。

(3)丛生芽诱导培养：将步骤(2)中的外植体接种到丛生芽诱导培养基中。培养14天后获得木薯丛生芽，再切取再生芽茎段0.5－1厘米接种到丛生芽诱导培养基中，进行诱导分化、增殖培养，即诱导过程同步增殖；当扩繁系数达到10倍时，进行生根培养。温度(23-27)℃，光周期12h/d，光照强度6000lx。

(4)生根培养：将步骤(3)中获得的不定芽接种到生根培养基中，培养30天后，即可获得大量木薯试管苗，温度(23-27)℃，光周期12h/d，光照强度6000lx。

(5)幼苗驯化：取出试管苗，用自来水洗净根部残留的培养基，再用0.1％kmno4浸泡30秒，最后用自来水清洗，将处理好的试管苗移栽至营养钵基质中驯化，将成活的幼苗移栽到大田中，即为木薯种苗。

作为优选，本发明步骤(1)过程中要优先保证木薯植株健壮块茎大、无病害，并带有幼嫩腋芽。

作为优选，本发明步骤(2)过程中要保证剪取的1厘米茎段上至少含有一个叶片。

作为优选，本发明步骤(3)中的丛生芽诱导培养基以ms培养基为基本培养基，添加20g·l^-1蔗糖，7g·l^-1琼脂，0.5mg·l^-16-苄基氨基嘌呤，2μmol·l^-1硫酸铜，ph5.8～6.0。

作为优选，本发明步骤(4)中的生根培养基以ms培养基为基本培养基，添加30g·l^-1蔗糖，7g·l^-1琼脂，0.1mg·l^-1萘乙酸，0.6mg·l^-16-苄基氨基嘌呤，2.5μmol·l^-1硫酸铜，ph5.8～6.0。

本发明步骤(5)中试管苗用0.1％kmno4浸泡30秒，可以有效降低移栽过程中幼苗伤害引起的感染。

本发明的有益效果

1、本发明催芽方式简洁快速，脱毒方式简捷有效，诱导率高达98.1％。

2、再生时间短：本发明诱导过程同步增殖，生根过程同步壮苗，驯化移栽后，约在65～70天内获得大量的木薯种苗。

3、变异低：利用丛生芽途径快繁，有效克服了愈伤组织途径变异率高的问题。

4、节约成本：本发明在保证较高丛生芽诱导率和繁殖系数的基础上，合理调节基本培养基和蔗糖等浓度，缩短了培养时间，大大降低生产成本。

附图说明

图1为组织培养快速繁殖木薯种苗全过程；

其中(a).诱导培养14天后的丛生芽，诱导过程同步增殖；(b).生根培养40天的试管苗，生根过程同步壮苗；(c).组培室大量培育的试管苗；(d).移栽成活的植株；以上标尺均是1.0厘米。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可由商业途径得到。

下述实施例中的木薯可从市场购得。

实施例1

一种组织培养快速繁殖木薯种苗的方法

一、外植体的选择和消毒

选择健壮无病害、生长旺盛并带有幼嫩腋芽的植株，剪取距茎顶端约10厘米幼嫩茎段，切除叶柄基部叶片。使用饱和洗衣粉溶液进行表面消毒，并利用两步法脱毒，剪取约1厘米的茎段，最后置于无菌滤纸上吸干表面水分。

二、木薯的丛生芽诱导培养

为获得最佳丛生芽诱导培养基，以ms培养基为基本培养基，采用3因素3水平设计正交实验(表1)，14天后，统计丛生芽诱导率；根据设计，在每种培养基中接种30个茎段，每种10瓶，每瓶3个。培养条件：温度(23-27)℃，光周期12h/d，光照强度6000lx。

丛生芽诱导率(％)＝(诱导出丛生芽的外植体数÷接种的外植体数)×100％

表1木薯丛生芽诱导培养基优化正交实验结果

结果表明：丛生芽诱导效果最佳培养基是以ms培养基为基本培养基，添加20g·l^-1蔗糖，7g·l^-1琼脂，0.5mg·l^-16-苄基氨基嘌呤，2μmol·l^-1硫酸铜，ph5.8～6.0。诱导过程同步增殖，诱导率是98.1％，增殖倍数为4.04。

三、木薯的生根培养

选用ms培养基为基本培养基，选用l16(4⁵)设计进行4因素4水平的正交实验(表2)。每种培养基中转接40个上述不定芽，培养40天，观察、统计每组的生根情况。培养条件：温度(23-27)℃，光周期12h/d，光照强度6000lx。

表2木薯丛生芽生根的正交实验结果

结果表明：最佳生根培养基是以ms培养基为基本培养基，添加40g·l^-1蔗糖，7g·l^-1琼脂，1.6g·l^-1活性炭，0.7mg·l^-1萘乙酸，0.8mg·l^-16-苄基氨基嘌呤，2.9mg·l^-1烯效唑。生根过程同步壮苗，培养的完整植株叶片浓绿，茎部健壮，根率发达，生根率为94.87％。

三、驯化移栽

取出试管苗，用自来水洗净根部残留的培养基，再用0.1％kmno4浸泡30秒，最后用自来水清洗，将处理好的试管苗移栽至土壤∶珍珠岩(1∶3)的混合基质中培养14天，3-4天浇水1次，保持基质湿润。移栽成活率达75％以上，试管苗越大、越粗壮，越容易成活；移栽到大田中，成活率可达90％以上。

对比例1

以木薯茎段为外植体，丛生芽诱导最佳培养基是以ms培养基为基本培养基，添加30g·l^-1蔗糖，7g·l^-1琼脂，1.0mg·l^-16-苄基氨基嘌呤，增殖倍数是3.1。本研究丛生芽诱导效果最佳培养基是以ms培养基为基本培养基，添加20g·l^-1蔗糖，7g·l^-1琼脂，0.5mg·l^-16-苄基氨基嘌呤，2μmol·l^-1硫酸铜。本研究诱导过程同步增殖，增殖倍数为4.04，比以往提高了30.3％。本研究在培养基中添加2μmol·l^-1硫酸铜，这有效促进了茎段节点愈伤组织的形成，促进丛生芽的生长。

对比例2

用ms培养基对木薯进行生根培养，生根率是93.8％，但生成的组培苗长势不佳、根系纤弱，成活率仅为30％。本研究的生根培养基是以ms培养基为基本培养基，添加40g·l^-1蔗糖，7g·l^-1琼脂，1.6g·l^-1活性炭，0.7mg·l^-1萘乙酸，0.8mg·l^-16-苄基氨基嘌呤，2.9mg·l^-1烯效唑。生根过程同步壮苗，培养的完整植株叶片浓绿，茎部健壮，根率发达，生根率为94.87％，成活率达75％以上。