一种七叶一枝花提取液的制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种七叶一枝花提取液的制备方法及其应用。

背景技术：

稻瘟病是由稻瘟病菌引起的世界性病害，是水稻生产上三大主要病害之一[1]。据相关数据显示，稻瘟病引起的水稻年损失约占总产量的10％-15％，损失达10亿元[2]，严重时减产可达数半。发病时主要以叶片为主，形成或大或小的病斑。目前，培育出抗稻瘟病品种并且将其推广种植是防治稻瘟病最经济有效的方法之一。但是，稻瘟病菌分为许多不同的生理小种，且生理小种复杂多变，极易发生变异[3]，对单一化学药剂容易产生抗药性。六十年代以来，选育出来的抗病品种在推广、栽种的过程中，抗性不断丧失，导致抗病水平越来越低。另外，生产者也通过化学农药来控制病害的发生。但是，化学防治存在环境污染、改变土壤结构和组成的不利因素，且对生产者身体具有高危害性。因此，植物源农药具有广谱的抑菌活性、低残留、无污染等优势。本申请选取了多种武陵山区特色植物提取液，经过反复的筛选，发现七叶一枝花对水稻稻瘟病菌有较好的抑菌作用，通过进一步分离七叶一枝花不同组织部位，并分别制成相应的提取液，进行抗菌活性筛选，为开发对人畜安全、无污染、低毒、低残留的植物源杀菌剂奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种可抑制稻瘟病菌的七叶一枝花提取液及其制备方法。

本发明提供的技术方案为一种七叶一枝花提取液，其制备方法如下：

步骤1：将七叶一枝花果皮烘干，研磨成粉末；

步骤2：将步骤1中的粉末用甲醇进行第一次溶解，进行超声、离心后，取上清液；

步骤3：将步骤2所得上清液减压烘干，用蒸馏水充分溶解；

步骤4：将步骤3所得溶液用正丁醇进行萃取，再次减压烘干，加入甲醇进行第二次溶解溶解制得七叶一枝花提取液。

其中，用七叶一枝花的根替换步骤1中的七叶一枝花果皮。

其中，用七叶一枝花的根和果皮混合物替换步骤1中的七叶一枝花果皮。

而且，所述甲醇为无水甲醇。

以及，所述的七叶一枝花提取液对稻瘟病菌的抑制作用。

以及，所述的七叶一枝花提取液对水稻防卫基因表达的促进作用。

而且，所述防卫基因为wrky45基因、pbz基因和pr1b基因。

与现有技术相比，该技术方案的有益效果在于：提供了一种可抑制稻瘟病菌的七叶一枝花提取液及其制备方法，该七叶一枝花能有效抑制稻瘟病菌，促进水稻防卫基因表达。而且该提取液是对人畜安全、无污染、低毒、低残留的植物源杀菌剂。

附图说明

图1为七叶一枝花根提取液(正丁醇相)对稻瘟病菌孢子抑菌效果图；

图2为七叶一枝花果皮提取液(正丁醇相)对稻瘟病菌孢子抑菌效果图；

图3为稻瘟灵农药对稻瘟病菌孢子抑菌效果图；

图4为无水甲醇对稻瘟病菌孢子抑菌效果图；

图5为wrky45基因的相对表达量分析；

图6为pbz基因的相对表达量分析；

图7为pr1b基因的相对表达量分析。

具体实施方式

七叶一枝花采集于武陵山区，之后分离七叶一枝花不同组织部位，即根、茎、叶、花、果皮、种子，制备相应提取液。稻瘟病菌：race007。水稻品种：日本晴。

本发明的七叶一枝花果皮提取液的制备方法如下：

(1)取0.5g七叶一枝花果皮烘干至恒重，用粉碎机磨成粉末，过40目筛子；

(2)将上述粉末用50ml甲醇超声1h,4℃4000rpm离心20min，取上清于圆底烧瓶内；

(3)用旋转蒸发仪58℃减压烘干混合液，再用蒸馏水洗涤圆底烧瓶壁，充分溶解；

(4)取适量正丁醇分2-3次萃取上述溶液，再转入新的圆底烧瓶；

(5)再次用旋转蒸发仪70℃减压烘干，经浓缩后，用甲醇定容至10ml。

七叶一枝花其他部位提取液制备方法与上述相同。

靶标病原菌孢子悬浮液的配制

稻瘟病菌用燕麦培养基(燕麦30g、琼脂15g、琼脂7g，用蒸馏水定容至1l)于26℃培养箱暗培养，待菌体长满培养基表面后(10d左右)，用棉签轻轻刮去表面的菌丝，在紫光灯下培养(3-4d)产孢，观察其表面变成灰色即可。用无菌水和刷子洗下表面的孢子，再用双层纱布过滤，取一滴至载玻片上，在10倍镜下调整孢子浓度，使每个视野中有50-80个孢子即可。

抗菌活性测定

(1)抑制孢子萌发法：将植物提取液与靶标病原菌孢子悬浮液按照不同体积混合后(见表1)，平铺于水琼脂培养基(7g琼脂定容至1l)，以1×10-3稻瘟灵作为对照药剂，每个样品的每个浓度处理5个重复。在26℃培养箱中培养24h后镜检孢子萌发情况，以孢子芽管长度大于孢子短半径为萌发，保证每个视野下有30-70个孢子，计算每个视野中孢子总数和萌发孢子数，每个处理每次观察一个载玻片要找5个视野，计算平均萌发抑制率，结果发现根和果皮的提取液对稻瘟病菌孢子萌发抑制明显，其对孢子萌发平均抑制率分别为78.00％和77.00％。

表1为七叶一枝花不同部位提取液对水稻稻瘟病菌的抗菌活性测定

由此可知，七叶一枝花不同部位提取液对水稻稻瘟病菌的孢子萌发平均抑制率差别显著。在镜检中发现，加入茎提取液后，孢子大部分萌发，其中孢子丝较长，其抑制效果不佳。

七叶一枝花果皮提取液(正丁醇相)和七叶一枝花根提取液(正丁醇相)对孢子萌发抑制效果明显，孢子大部分不萌发，形状似比较规则的椭圆形。在两组对照实验中，稻瘟灵农药几乎全部抑制了孢子的萌发；而在用无水甲醇时，绝大部分孢子均萌发，其两端出现较细长的孢子丝，对比十分明显，如图1至图4所示。

(2)盆栽活体接种测定法：选取3-5叶期、长势一致的水稻苗进行盆栽活体防治实验。按照上述方法制备孢子悬浮液，然后加入0.02％吐温，混匀待用。实验组：先喷七叶一枝花果皮提取液，24h后采取喷雾法接种稻瘟病菌孢子悬浮液，接种后黑暗处理24h，同时保持空气湿度90％以上。实验组：先接种稻瘟病菌孢子悬浮液，黑暗处理24h后，再喷七叶一枝花果皮提取液，培养条件同上。同时设置对照组：即先喷水，24h后喷稻瘟病菌孢子悬浮液。保证稻瘟病菌接种时间一致。待接种培养7d后，观察水稻叶片发病情况，统计病斑数目。再分别采集相同部位的水稻叶片，每个处理约100mg，用锡箔纸包好，并做好标记，液氮速冻后放入-80℃冰箱中待用。

通过统计实验组(先喷药)、实验组(先喷孢子)、对照组(先喷水)水稻叶片稻瘟病菌病斑数目。实验表明，先接种稻瘟病菌后喷果皮提取液的平均病情指数最低，先喷果皮提取液后接种稻瘟病菌的其次，先喷水后接种稻瘟病菌的平均病情指数最高。可见，果皮提取液对稻瘟病菌的防治效果高于预防效果。

(3)防卫基因相对表达量检测分析

根据axyrep总rna小量制备试剂盒提取水稻叶片总rna，利用反转录试剂盒primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser合成cdna。对照组与实验组分别取水稻叶片，提取rna，反转cdna后进行表达量分析，分别检测防卫基因wrry45基因、pbz基因、pr1b基因的相对表达量。

利用实时荧光定量试剂盒sybrpremixextaq，应用appliedbiosystems7500fastreal-timepcrsystem进行表达量分析。

本实验采用相对表达量定量分析的方法，以表达恒定的管家基因rubq为参照基因，获得目的基因wrry45、pbz、pr1b的相对表达量，从而反映出3组实验基因表达量变化情况。相对表达量的计算采用2-δδct法：相对表达量＝2-δδct＝2-[(e-f)-(a-b)]，所以：相对表达量＝2(f-b)-(e-a)。其中，a为干预前待测基因ct值；b为干预前参照基因ct值；e为干预后待测基因ct值；f为干预后参照基因ct值。

对防卫基因的相对表达量检测中发现，从先喷水再喷孢子，到先喷药再喷孢子，再到先喷孢子后喷药实验中，其相对表达量均呈现依次递增的趋势。wrky45、pbz、pr1b均在先喷孢子后喷果皮提取液的水稻叶片中相对表达量最高；而先喷水后喷孢子悬浮液的水稻叶片中3个基因表达量最低。可见，七叶一枝花果皮提取液可能直接抑制稻瘟病菌孢子的萌发,同时也诱导防卫基因的表达，激活水稻的基础抗性而达到很好的防治效果，如图5至图7所示。

综上所述，离体抑菌实验和活体防治实验均表明七叶一枝花提取液(尤其是七叶一枝花果皮提取液)对稻瘟病菌具有较强的抑菌活性，且能够诱导或引起植物体内防卫基因wrky45基因、pr1b基因、pz1基因的表达。