杀虫蛋白的用途的制作方法

文档序号：21186112发布日期：2020-06-20 18:08阅读：658来源：国知局

本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，特别是涉及一种vip3aa蛋白质通过在植物中表达来控制南美棉铃虫为害植物的用途。

背景技术：

南美棉铃虫helicoverpagelotopoeon，属于鳞翅目夜蛾科铃夜蛾属，主要分布于巴西、阿根延、玻利维亚、巴拉圭和乌拉圭等南美洲南部国家和地区。南美棉铃虫为多食性害虫，主要为害大豆，棉花，首蓿，向日葵，鹰嘴豆和玉米等经济作物，其为害特点为：整个幼虫阶段能为害茎秆，叶子，花序和果实等大部分植物组织。喜食大豆，其幼虫能取食大豆地上部分81.8％的组织，幼虫阶段能消耗340cm²的大豆叶片，幼虫末龄能消耗15粒大豆种子，将严重影响产量。

栽培大豆(glycinemax(l.)merri)，是一种全球种植的作为植物油和植物蛋白主要来源的重要经济作物，是中国重要的食用和饲用作物。大豆是南美棉铃虫最喜取食的植物之一，在阿根延，大豆每年因南美棉铃虫为害减产5％到30％不等，造成严重经济损失。为了防治南美棉铃虫，人们通常采用的主要方法有农业防治、化学防治、物理防治和生物防治。

农业防治是把整个农田生态系统多因素的综合协调管理，调控作物、害虫、环境因素、创造一个有利于作物生长而不利于南美棉铃虫发生的农田生态环境。而在南美，大部分农田都采用免耕耕作方式，几乎没有任何农业防治措施，若上年越冬种群增长极有可能促使次年的种群爆发，对大豆等作物造成经济损失。

化学防治即农药防治，是利用化学杀虫剂来杀灭害虫，是南美棉铃虫综合治理的重要组成部分，它具有快速、方便、简便和高经济效益的特点，特别是南美棉铃虫大发生的情况下，是必不可少的应急措施。目前化学防治方法主要是药液喷雾和药粉喷洒，在南美棉铃虫幼虫3龄以前有较好的防治效果，这时幼虫食量小，抗药性弱，可根据灯下诱集成虫的高峰期确定1-2龄幼虫期，或根据初龄幼虫为害状确定防治时间。通常选用20％氯虫苯甲酰胺悬浮剂，或48％氟虫双酰胺悬浮，或25％高效氟氯氰菊酯微囊悬浮剂，或48％毒死蜱液喷施。化学防治也有其局限性，如使用不当往往会导致农作物发生药害、害虫产生抗药性，以及杀伤天敌、污染环境，使农田生态系统遭到破坏和农药残留对人、畜的安全构成威胁等不良后果。

物理防治主要根据害虫对环境条件中各种物理因素的反应，利用各种物理因素如光、电、色、温湿度等以及机械设备进行诱杀、辐射不育等方法来防治害虫。成虫盛发时用网扑或灯光诱杀。利用南美棉铃虫成虫较强的趋光性，在羽化期设置黑光灯诱杀成虫，以降低田间落卵量和幼虫密度；但是黑光灯需要每天及时清理滤光片上的污垢，否则会影响黑光的发出，进而影响杀虫效果；并且对电源电压的稳定性要求较高，在操作上还有照伤人眼睛的危险；此外安装灯的一次性投入较大。

生物防治是利用某些有益生物或生物代谢产物来控制害虫种群数量，以达到降低或消灭害虫的目的，如选择对天敌毒性低的农药，并根据害虫和天敌田间发生期的差异，调整施药时间，避开在天敌大量发生时施药以保护天敌；其次，释放赤眼蜂(trichogrammatidae)或喷施苏云金杆菌sd-5、南美棉铃虫核多角体病毒制剂控制南美棉铃虫。其特点是对人、畜安全，对环境污染少，对某些害虫可达到长期控制的目的；但是效果常不稳定，并且不论南美棉铃虫发生轻重均需同样投资进行。

为了解决农业防治、化学防治、物理防治和生物防治在实际应用中的局限性，科学家们经过研究发现将来自于苏云金芽孢杆菌的编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物虫害。

vip3aa杀虫蛋白是众多杀虫蛋白中的一种，是由苏云金芽孢杆菌产生的特异性蛋白质。vip3aa蛋白通过激发凋亡类型的细胞程序性死亡对敏感性昆虫具有毒杀效应。vip3aa蛋白在昆虫肠道内被水解为4种主要蛋白产物，其中只有一种蛋白水解产物(66kd)为vip3aa蛋白的毒性核心结构。vip3aa蛋白结合敏感昆虫的中肠上皮细胞，启动细胞程序性死亡，造成中肠上皮细胞的溶解导致昆虫死亡。对非敏感昆虫不产生任何病症，不会导致中肠上皮细胞的凋亡和溶解。

已证明转vip3aa基因的植株可以抵抗小地老虎、棉铃虫和草地贪夜蛾等鳞翅目(lepidoptera)害虫的侵害，然而，至今尚无关于通过产生表达vip3aa蛋白的转基因植株来控制南美棉铃虫对植物为害的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种杀虫蛋白的用途，首次提供了通过产生表达vip3aa蛋白的转基因植株来控制南美棉铃虫对植物危害的方法，且有效克服现有技术农业防治、化学防治、物理防治和生物防治等技术缺陷。

为实现上述目的，本发明提供了一种控制南美棉铃虫害虫的方法，包括将南美棉铃虫害虫至少与vip3aa蛋白接触。

进一步地，所述vip3aa蛋白存在于至少产生所述vip3aa蛋白的宿主细胞中，所述南美棉铃虫害虫通过摄食所述宿主细胞至少与所述vip3aa蛋白接触。

更进一步地，所述vip3aa蛋白存在于至少产生所述vip3aa蛋白的细菌或转基因植物中，所述南美棉铃虫害虫通过摄食所述细菌或转基因植物的组织至少与所述vip3aa蛋白接触，接触后所述南美棉铃虫害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对南美棉铃虫危害植物的控制。

所述转基因植物的组织为根、叶片、茎秆、果实、雄穗、雌穗、花药或花丝。

所述植物为大豆、绿豆、豇豆、油菜、甘蓝、花椰菜、白菜、萝卜。

所述转基因植物可以处于任意生育期。

所述对南美棉铃虫危害植物的控制不因种植地点和/或种植时间的改变而改变。

所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述vip3aa蛋白的多核苷酸的植物。

优选地，所述vip3aa蛋白的氨基酸序列具有seqidno：1、seqidno：3、seqidno：5或seqidno：7所示的氨基酸序列。所述vip3aa蛋白的核苷酸序列具有seqidno：2、seqidno：4、seqidno：6或seqidno：8所示的核苷酸序列。

在上述技术方案的基础上，所述植物还可以包括至少一种不同于编码所述vip3aa蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。

进一步地，所述第二种核苷酸编码cry类杀虫蛋白质、vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶。

在本发明中，vip3aa蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个cry类杀虫蛋白质和/或vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物(第1亲本)可以通过遗传工程操作表达vip3aa蛋白质，第二种植物(第2亲本)可以通过遗传工程操作表达cry类杀虫蛋白质和/或vip类杀虫蛋白质。通过第1亲本和第2亲本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。

优选地，所述第二种核苷酸编码cry1ab或cry2ab蛋白。

更进一步地，所述cry1ab蛋白的氨基酸序列具有seqidno：9所示的氨基酸序列。所述cry1ab蛋白的核苷酸序列具有seqidno：10所示的的核苷酸序列。所述cry2ab蛋白的氨基酸序列具有seqidno：11所示的氨基酸序列。所述cry2ab蛋白的核苷酸序列具有seqidno：12所示的的核苷酸序列。

可选择地，所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsrna。

为实现上述目的，本发明还提供了一种vip3aa蛋白质控制南美棉铃虫害虫的用途。

为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制南美棉铃虫害虫的植物的方法，包括向所述植物的基因组中引入编码vip3aa蛋白的多核苷酸序列。

为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制南美棉铃虫害虫的植物繁殖体的方法，包括将由所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，和/或取下由所述方法获得的植株上具有繁殖能力的组织进行培养，从而产生含有编码vip3aa蛋白的多核苷酸序列的植物繁殖体。

为实现上述目的，本发明还提供了一种培养控制南美棉铃虫害虫的植物的方法，包括：

种植至少一粒植物繁殖体，所述植物繁殖体的基因组中包括编码vip3aa蛋白的多核苷酸序列；

使所述植物繁殖体长成植株；

使所述植株在人工接种南美棉铃虫害虫和/或南美棉铃虫害虫自然发生危害的条件下生长，收获与其他不具有编码vip3aa蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量的植株。

本发明中所述的“植物繁殖体”包括但不限于植物有性繁殖体和植物无性繁殖体。所述植物有性繁殖体包括但不限于植物种子；所述植物无性繁殖体是指植物体的营养器官或某种特殊组织，其可以在离体条件下产生新植株；所述营养器官或某种特殊组织包括但不限于根、茎和叶，例如：以根为无性繁殖体的植物包括草莓和甘薯等；以茎为无性繁殖体的植物包括甘蔗和马铃薯(块茎)等；以叶为无性繁殖体的植物包括芦荟和秋海棠等。

本发明中所述的“接触”是指触碰、停留和/或摄食，具体为昆虫和/或害虫触碰、停留和/或摄食植物、植物器官、植物组织或植物细胞，所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞既可以是其体内表达杀虫蛋白，还可以是所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞的表面具有杀虫蛋白和/或具有产生杀虫蛋白的微生物。

本发明所述的“控制”和/或“防治”是指南美棉铃虫害虫至少与vip3aa蛋白接触，接触后南美棉铃虫害虫生长受到抑制和/或导致死亡。进一步地，南美棉铃虫害虫通过摄食植物组织至少与vip3aa蛋白接触，接触后全部或部分南美棉铃虫害虫生长受到抑制和/或导致死亡。抑制是指亚致死，即尚未致死但能引起生长发育、行为、生理、生化和组织等方面的某种效应，如生长发育缓慢和/或停止。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，含有编码vip3aa蛋白的多核苷酸序列的控制南美棉铃虫害虫的植物和/或植物种子，在人工接种南美棉铃虫害虫和/或南美棉铃虫害虫自然发生危害的条件下，与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，具体表现包括但不限于改善的叶片抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增产等。vip3aa蛋白对南美棉铃虫的“控制”和/或“防治”作用是可以独立存在的，具体地，转基因植物(含有编码vip3aa蛋白的多核苷酸序列)的任何组织同时和/或不同步地，存在和/或产生，vip3aa蛋白和/或可控制南美棉铃虫害虫的另一种物质，则所述另一种物质的存在vip3aa不能导致所述“控制”和/或“防治”作用完全和/或部分由所述另一种物质实现，而与vip3aa蛋白无关。通常情况下，在大田，南美棉铃虫害虫摄食植物组织的过程短暂且很难用肉眼观察到，因此，在人工接种南美棉铃虫害虫和/或南美棉铃虫害虫自然发生危害的条件下，如转基因植物(含有编码vip3aa蛋白的多核苷酸序列)的任何组织存在死亡的南美棉铃虫害虫、和/或在其上停留生长受到抑制的南美棉铃虫害虫、和/或与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，即为实现了本发明的方法和/或用途，即通过南美棉铃虫害虫至少与vip3aa蛋白接触以实现控制南美棉铃虫害虫的方法和/或用途。

rna干扰(rnainterference，rnai)是指在进化过程中高度保守的、由双链rna(double-strandedrna，dsrna)诱发的、同源mrna高效特异性降解的现象。因此在本发明中可以使用rnai技术特异性剔除或关闭目标昆虫害虫中特定基因的表达，特别是与目标昆虫害虫生长发育的相关的基因。

南美棉铃虫成虫的翅展可达30-40毫米；具有细长的丝状触角。第一对翅膀颜色由浅棕色渐变至深棕色，中心附近有明显的肾形斑点。翅膀的边缘带为浅褐色，次边缘带更宽且比翅膀的其他部分颜色更暗。第二对翅膀呈浅棕色，具有很明显的朝向外边缘变暗的趋势。卵为半球形，珍珠白色，并且在顶点处有条纹。老熟幼虫长约35毫米，身体颜色多变，可以是绿色，粉红色，黄色，棕色甚至黑色，在身体的每一侧都有一条锯齿状的白色带，且具有亮黑色刚毛突起。

南美棉铃虫广泛分布于巴西、阿根延、玻利维亚、巴拉圭和乌拉圭等南美洲国家和地区。在阿根延每年发生3-5代，从上一年11月持续到次年的4月，每代30-40天。该虫以蛹越冬，成虫羽化后产卵于花芽和叶子上，单雌产量达到300-1000粒。卵到幼虫需要5-10天，幼虫孵化后即开始取食叶肉，留下表皮。3-5龄取食量大增，造成叶片大量缺刻和孔洞。幼虫历期12-20天。老熟幼虫钻入地下做茧化蛹。南美棉铃虫的为害程度主要受虫源基数和温湿度的影响，夏天较高的湿度和较低的温度有利于其发生，但在卵期和初龄幼虫期下暴雨，则不利于发生。

在分类系统上，一般主要根据成虫翅的脉序、连锁方式和触角的类型等形态特征，将鳞翅目分为亚目、总科、科等。而夜蛾科是鳞翅目中种类最丰富的科，全世界已发现2万种以上，仅中国记录就有几千条。大部分夜蛾科昆虫是农作物的害虫，可以食叶、蛀铃等，如棉铃虫、斜纹夜蛾等。尽管中国棉铃虫(helicoverpaarmigera)、斜纹夜蛾(spodopteralitura)等和南美棉铃虫同属于鳞翅目夜蛾科，除了在分类标准上存在相似性，在其它形态结构上则存在极大差异；就好比植物中的草莓与苹果一样(同属于蔷薇目蔷薇科)，它们都有花两性，辐射对称，花瓣5片等特征，但是其果实以及植株形态却是千差万别。但因人们较少接触昆虫，尤其是较少接触农业害虫，对于昆虫形态上的差异较少关注，而使得人们以为昆虫的形态大同小异。而事实上，南美棉铃虫不管是从幼虫形态还是成虫形态上来看，都具有其独特的特征。例如中国棉铃虫和南美棉铃虫幼虫前足内侧有1条大的顶端内刺状刚毛和1-3条更细、逐渐变小的刺状刚毛，外侧2-4条逐渐变小的强健的刺状刚毛；成虫的前翅，中国棉铃虫和南美棉铃虫的雌虫为橄榄黄色，雄虫为铁锈黄色。同为夜蛾科的南美棉铃虫的幼虫前足内侧有3-6条细刺状刚毛，在外侧有1条细的顶端刺状刚毛；成虫的前翅为褐色。

同属夜蛾科的昆虫不仅在形态特征上存在较大差异，同时在取食习性上，也存在差异。例如中国棉铃虫以钻蛀型为害棉花的棉铃或者玉米穗子，南美棉铃虫更加偏好大豆。取食习性的不同，也暗示着体内消化系统所产生的酶和受体蛋白不同。而消化道中产生的酶是bt基因起作用的关键点，只有能够与特异性bt基因相结合的酶或受体蛋白，才有可能使得某个bt基因对该害虫具有抗虫效果。越来越多的研究表明，同目不同科、甚至同科不同种的昆虫对同种bt蛋白的敏感性表现不同。例如vip3aa基因对螟蛾科的二化螟chilosuppressalis和亚洲玉米螟ostriniafumacalis都表现出了抗虫活性，但是vip3aa基因对于同属螟蛾科的印度谷螟plodiainterpunctella和欧洲玉米螟ostrinianubilalis却没有抗虫效果。上述几种害虫均属于鳞翅目螟蛾科，但同种bt蛋白对这几种螟蛾科害虫表现出不同的抗性效果。尤其是欧洲玉米螟和亚洲玉米螟在分类上甚至同属于螟蛾科ostrinia属(同目同科同属)，但是其对同种bt蛋白的反应却是截然不同的，更加充分说明了bt蛋白与昆虫体内酶和受体的相互作用方式是复杂且难以预料的。

本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。

本发明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋白质或多肽。本领域技术人员很容易认识到，可以将本发明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下。

本领域技术人员所熟知的，dna典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于dna在植物中复制产生了dna的其它互补链。这样，本发明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将dna的一条链转录为一条mrna的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。mrna实际上是从dna的“反义”链转录的。“有义”或“编码”链有一系列密码子(密码子是三个核苷酸，一次读三个可以产生特定氨基酸)，其可作为开放阅读框(orf)阅读来形成目的蛋白质或肽。本发明还包括与示例的dna有相当功能的rna。

本发明中核酸分子或其片段在严格条件下与本发明vip3aa基因杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本发明vip3aa基因的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。本发明中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。

本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进dna杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠(ssc)处理，然后在50℃条件下用2.0×ssc洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×ssc、50℃到高度严格条件的约0.2×ssc、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6×ssc、0.5％sds溶液中，在65℃下与seqidno：2、seqidno：4、seqidno：6和seqidno：8发生特异性杂交，然后用2×ssc、0.1％sds和1×ssc、0.1％sds各洗膜1次。

因此，具有抗虫活性并在严格条件下与本发明seqidno：2、seqidno：4、seqidno：6和seqidno：8杂交的序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40％-50％同源，大约60％、65％或70％同源，甚至至少大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同源性。

本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的杀虫活性特征的部分和/或片段(包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失)、变体、突变体、取代物(有替代氨基酸的蛋白质)、嵌合体和融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有杀虫活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗南美棉铃虫害虫的生物活性的蛋白。

本发明中所述的dna分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始dna或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如适合植物表达的序列)，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保(编码)蛋白质为昆虫毒素。

使用标准技术可以修饰基因和容易的构建基因变异体。例如，本领域熟知制造点突变的技术。又例如美国专利号5605793描述了在随机断裂后使用dna重装配产生其它分子多样性的方法。可以使用商业化核酸内切酶制造全长基因的片段，并且可以按照标准程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶诸如bal31或定点诱变从这些基因的末端系统地切除核苷酸。还可以使用多种限制性内切酶获取编码活性片段的基因。可以使用蛋白酶直接获得这些毒素的活性片段。

本发明可以从bt分离物和/或dna文库衍生出等价蛋白和/或编码这些等价蛋白的基因。有多种方法获取本发明的杀虫蛋白。例如，可以使用本发明公开和要求保护的杀虫蛋白的抗体从蛋白质混合物鉴定和分离其它蛋白。特别地，抗体可能是由蛋白最恒定和与其它bt蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通过免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(elisa)或western印迹方法使用这些抗体专一地鉴定有特征活性的等价蛋白。可使用本领域标准程序容易的制备本发明中公开的蛋白或等价蛋白或这类蛋白的片段的抗体。然后可以从微生物中获得编码这些蛋白的基因。

由于遗传密码子的丰余性，多种不同的dna序列可以编码相同的氨基酸序列。产生这些编码相同或基本相同的蛋白的可替代dna序列正在本领域技术人员的技术水平内。这些不同的dna序列包括在本发明的范围内。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响杀虫活性的序列，亦包括保留杀虫活性的片段。

本发明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本领域的常规技术，优选这种氨基酸变化为：小的特性改变，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约20-25个残基长。

保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，n.neurath和r.l.hill在1979年纽约学术出版社(academicpress)出版的《protein》中进行了描述。最常见的互换有ala/ser，val/ile，asp/glu，thu/ser，ala/thr，ser/asn，ala/val，ser/gly，tyr/phe，ala/pro，lys/arg，asp/asn，leu/ile，leu/val，ala/glu和asp/gly，以及它们相反的互换。

对于本领域的技术人员而言显而易见地，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生，而且仍产生活性多肽。对于由本发明的多肽，其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定(如参见，cunningham和wells，1989，science244：1081-1085)。后一技术是在分子中每一个带正电荷的残基处引入突变，检测所得突变分子的抗虫活性，从而确定对该分子活性而言重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过其三维结构的分析来测定，这种三维结构可由核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等技术测定(参见，如devos等，1992，science255：306-312；smith等，1992，j.mo1.biol224：899-904；w1odaver等，1992，febsletters309：59-64)。

在本发明中，vip3aa蛋白包括但不限于seqidno：1、seqidno：3、seqidno：5和seqidno：7所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本发明中。这些序列与本发明序列类似性/相同性典型的大于60％，优选的大于75％，更优选的大于90％，甚至更优选的大于95％，并且可以大于99％。也可以根据更特定的相同性和/或类似性范围定义本发明的优选的多核苷酸和蛋白质。例如与本发明示例的序列有60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性和/或类似性。

本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子、增强子、前导序列、内含子以及其它可操作地连接到所述vip3aa蛋白的调节序列。

所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35s启动子、拟南芥ubi10启动子、玉米ubi启动子、水稻gos2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规rna试验进行测定)，如pep羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(pini和pinii)和玉米蛋白酶抑制基因(mpi)的启动子。

所述转运肽(又称分泌信号序列或导向序列)是指导转基因产物到特定的细胞器或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用‘kdel’保留序列靶向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的ctpp靶向液泡。

所述前导序列包含但不限于，小rna病毒前导序列，如emcv前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)；马铃薯y病毒组前导序列，如mdmv(玉米矮缩花叶病毒)前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质(bip)；首蓿花叶病毒的外壳蛋白质mrna的不翻译前导序列(amvrna4)；烟草花叶病毒(tmv)前导序列。

所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒(camv)增强子、玄参花叶病毒(fmv)增强子、康乃馨风化环病毒(cerv)增强子、木薯脉花叶病毒(csvmv)增强子、紫菜莉花叶病毒(mmv)增强子、夜香树黄化曲叶病毒(cmylcv)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒(clcumv)、鸭跖草黄斑驳病毒(coymv)和花生褪绿线条花叶病毒(pclsv)增强子。

对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛素内含子、adh内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻act1内含子。对于双子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，cat-1内含子、pkannibal内含子、piv2内含子和“超级泛素”内含子。

所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限于，来源于农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合成酶(nos)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂ii(pinii)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于豌豆ssrubiscoe9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。

本发明中所述“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表示：启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5’非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表达功能的序列(即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子)、提供dna转移和/或整合功能的序列(即t-dna边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素抗性标记物、生物合成基因)、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列(即多接头序列、位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。

本发明中所述的“杀虫”或“抗虫”是指对农作物害虫是有毒的，从而实现“控制”和/或“防治”农作物害虫。优选地，所述“杀虫”或“抗虫”是指杀死农作物害虫。更具体地，目标昆虫是南美棉铃虫害虫。

本发明中vip3aa蛋白对南美棉铃虫害虫具有毒性。本发明中的植物，特别是大豆，在其基因组中含有外源dna，所述外源dna包含编码vip3aa蛋白的核苷酸序列，南美棉铃虫害虫通过摄食植物组织与该蛋白接触，接触后南美棉铃虫害虫生长受到抑制和/或导致死亡。抑制是指致死或亚致死。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，该植物可基本消除对化学或生物杀虫剂的需要(所述化学或生物杀虫剂为针对vip3aa蛋白所靶向的南美棉铃虫害虫的杀虫剂)。

植物材料中杀虫晶体蛋白(icp)的表达水平可通过本领域内所描述的多种方法进行检测，例如通过应用特异引物对组织内产生的编码杀虫蛋白质的mrna进行定量，或直接特异性检测产生的杀虫蛋白质的量。

可以应用不同的试验测定植物中icp的杀虫效果。本发明中目标昆虫主要为南美棉铃虫。

本发明中，所述vip3aa蛋白可以具有序列表中seqidno：1和seqidno：3或seqidno：5或seqidno：7所示的氨基酸序列。除了包含vip3aa蛋白的编码区外，也可包含其他元件，例如编码选择性标记的蛋白质。

此外，包含编码本发明vip3aa蛋白的核苷酸序列的表达盒在植物中还可以与至少一种编码除草剂抗性基因的蛋白质一起表达，所述除草剂抗性基因包括但不限于，草铵膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敌草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如epsps基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、对除草剂茅草枯的抗性基因、对氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制剂(如ppt)的抗性基因，从而获得既具有高杀虫活性、又具有除草剂抗性的转基因植物。

本发明中，将外源dna导入植物，如将编码所述vip3aa蛋白的基因或表达盒或重组载体导入植物细胞，常规的转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将dna摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的dna导入。

本发明提供了一种控制害虫的方法，具有以下优点：

1、内因防治。现有技术主要是通过外部作用即外因来控制南美棉铃虫害虫的危害，如农业防治、化学防治、物理防治和生物防治；而本发明是通过植物体内产生能够抑制南美棉铃虫生长的vip3aa蛋白来控制南美棉铃虫害虫的，即通过内因来防治。

2、无污染、无残留。现有技术使用的化学防治方法虽然对控制南美棉铃虫害虫的危害起到了一定作用，但同时也对人、畜和农田生态系统带来了污染、破坏和残留；使用本发明控制南美棉铃虫害虫的方法，可以消除上述不良后果。

3、全生育期防治。现有技术使用的控制南美棉铃虫害虫的方法都是阶段性的，而本发明是对植物进行全生育期的保护，转基因植物(vip3aa蛋白)从发芽、生长，一直到开花、结果，都可以抵抗南美棉铃虫的侵害。

4、全植株防治。现有技术使用的控制南美棉铃虫害虫的方法大多是局部性的，如叶面喷施；而本发明是对整个植株进行保护，如转基因植物(vip3aa蛋白)的根、叶片、茎秆、果实、雄穗、雌穗、花药等都是可以抵抗南美棉铃虫侵害的。

5、效果稳定。现有技术使用的频振式杀虫灯不仅需要每天及时清理高压电网的污垢，而且在雷雨天不能使用；本发明是使所述vip3aa蛋白在植物体内进行表达，有效地克服了频振式杀虫灯的效果受外界因素影响的缺陷，且本发明转基因植物(vip3aa蛋白)的防治效果在不同地点、不同时间、不同遗传背景也都是稳定一致的。

6、简单、方便、经济。现有技术使用的频振式杀虫灯的一次性投入较大，且操作不当还有电击伤人的危险；本发明只需种植能够表达vip3aa蛋白的转基因植物即可，而不需要采用其它措施，从而节省了大量人力、物力和财力。

7、效果彻底。现有技术使用的控制南美棉铃虫害虫的方法，其效果是不彻底的，只起到减轻作用；而本发明转基因植物(vip3aa蛋白)对南美棉铃虫初孵幼虫的防治效果几乎为百分之百，极个别存活幼虫也基本上停止发育，3天后幼虫基本仍处于初孵状态，都是明显的发育不良，且已停止发育，在田间自然环境中无法存活，而转基因植物大体上只受到轻微损伤。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明杀虫蛋白的用途的含有vip3aa-01核苷酸序列的重组克隆载体dbn01-t构建流程图；

图2为本发明杀虫蛋白的用途的含有vip3aa-01核苷酸序列的重组表达载体dbn100002构建流程图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明杀虫蛋白的用途的技术方案。

第一实施例、基因的获得和合成

1、获得核苷酸序列

vip3aa-01杀虫蛋白质的氨基酸序列(789个氨基酸)，如序列表中seqidno：1所示；编码相应于所述vip3aa-01杀虫蛋白质的氨基酸序列的vip3aa-01核苷酸序列(2370个核苷酸)，如序列表中seqidno：2所示。

vip3aa-02杀虫蛋白质的氨基酸序列(789个氨基酸)，如序列表中seqidno：3所示；编码相应于所述vip3aa-02杀虫蛋白质的氨基酸序列的vip3aa-02核苷酸序列(2370个核苷酸)，如序列表中seqidno：4所示。

vip3aa-03杀虫蛋白质的氨基酸序列(789个氨基酸)，如序列表中seqidno：5所示；编码相应于所述vip3aa-03杀虫蛋白质的氨基酸序列的vip3aa-03核苷酸序列(2370个核苷酸)，如序列表中seqidno：6所示。

vip3aa-04杀虫蛋白质的氨基酸序列(789个氨基酸)，如序列表中seqidno：7所示；编码相应于所述vip3aa-04杀虫蛋白质的氨基酸序列的vip3aa-04核苷酸序列(2370个核苷酸)，如序列表中seqidno：8所示。

cry1ab杀虫蛋白质的氨基酸序列(615个氨基酸)，如序列表中seqidno：9所示；编码相应于所述cry1ab杀虫蛋白质的氨基酸序列的cry1ab核苷酸序列(1848个核苷酸)，如序列表中seqidno：10所示。

cry2ab杀虫蛋白质的氨基酸序列(634个氨基酸)，如序列表中seqidno：11所示；编码相应于所述cry2ab杀虫蛋白质的氨基酸序列的cry2ab核苷酸序列(1905个核苷酸)，如序列表中seqidno：12所示。

2、合成上述核苷酸序列

合成所述vip3aa-01核苷酸序列(如序列表中seqidno：2所示)、所述vip3aa-02核苷酸序列(如序列表中seqidno：4所示)、所述vip3aa-03核苷酸序列(如序列表中seqidno：6)、所述vip3aa-04核苷酸序列(如序列表中seqidno：8)、所述cry1ab核苷酸序列(如序列表中seqidno：10所示)和所述cry2ab核苷酸序列(如序列表中seqidno：12所示)；合成的所述vip3aa-01核苷酸序列(seqidno：2)的5’端还连接有scai酶切位点，所述vip3aa-01核苷酸序列(seqidno：2)的3’端还连接有spei酶切位点；合成的所述vip3aa-02核苷酸序列(seqidno：4)的5’端还连接有scai酶切位点，所述vip3aa-02核苷酸序列(seqidno：4)的3’端还连接有spei酶切位点；合成的所述vip3aa-03核苷酸序列(seqidno：6)的5’端还连接有scai酶切位点，所述vip3aa-03核苷酸序列(seqidno：6)的3’端还连接有spei酶切位点；合成的所述vip3aa-04核苷酸序列(seqidno：8)的5’端还连接有scai酶切位点，所述vip3aa-04核苷酸序列(seqidno：8)的3’端还连接有spei酶切位点；合成的所述cry1ab核苷酸序列(seqidno：10)的5’端还连接有kasi酶切位点，所述cry1ab核苷酸序列(seqidno：10)的3’端还连接有bamhi酶切位点；合成的所述cry2ab核苷酸序列(seqidno：12)的5’端还连接有ncoi酶切位点，所述cry2ab核苷酸序列(seqidno：12)的3’端还连接有spei酶切位点。

第二实施例、重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌

1、构建含有vip3aa基因的重组克隆载体

将合成的vip3aa-01核苷酸序列连入克隆载体pgem-t(promega，madison，usa，cat：a3600)上，操作步骤按promega公司产品pgem-t载体说明书进行，得倒重组克隆载体dbn01-t，其构建流程如图1所示(其中，amp表示氨苄青霉素抗性基因；flori表示噬菌体fl的复制起点；lacz为lacz其实密码子；sp6为sp6rna聚合酶启动子；t7为t7rna聚合酶启动子；vip3aa-01为vip3aa-01核苷酸序列(seqidno：2)；mcs为多克隆位点)。

然后将重组克隆载体dbn01-t用热激方法转化大肠杆菌t1感受态细胞(transgen，beijing，china，cat：cd501)，其热激条件为：50μl大肠杆菌t1感受态细胞、10μl质粒dna(重组克隆载体dbn01-t)，42℃水浴30s；37℃振荡培养1h(100rpm转速下摇床摇动)，在表面涂有iptg(异丙基硫代-β-d-半乳糖苷)和x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷)的氨苄青霉素(100mg/l)的lb平板(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l、琼脂15g/l，用naoh调ph至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在lb液体培养基(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l、氨苄青霉素100mg/l，用naoh调ph至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液i(25mmtris-hcl、10mmedta(乙二胺四乙酸)、50mm葡萄糖，ph8.0)悬浮；加入200μl新配制的溶液ii(0.2mnaoh、1％sds(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液iii(3m醋酸钾、5m醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度(v/v)为70％的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含rnase(20μg/ml)的te(10mmtris-hcl、1mmedta，ph8.0)溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化rna；于温度-20℃保存备用。

提取的质粒经scai和spei酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体dbn01-t中插入的所述vip3aa-01核苷酸序列为序列表中seqidno：2所示的核苷酸序列，即vip3aa-01核苷酸序列正确插入。

按照上述构建重组克隆载体dbn01-t的方法，将合成的所述vip3aa-02核苷酸序列连入克隆载体pgem-t上，得到重组克隆载体dbn02-t，其中，vip3aa-02为vip3aa-02核苷酸序列(seqidno：4)。酶切和测序验证重组克隆载体dbn02-t中所述vip3aa-02核苷酸序列正确插入。

按照上述构建重组克隆载体dbn01-t的方法，将合成的所述vip3aa-03核苷酸序列连入克隆载体pgem-t上，得到重组克隆载体dbn03-t，其中，vip3aa-03为vip3aa-03核苷酸序列(seqidno：6)。酶切和测序验证重组克隆载体dbn03-t中所述vip3aa-03核苷酸序列正确插入。

按照上述构建重组克隆载体dbn01-t的方法，将合成的所述vip3aa-04核苷酸序列连入克隆载体pgem-t上，得到重组克隆载体dbn04-t，其中，vip3aa-04为vip3aa-04核苷酸序列(seqidno：8)。酶切和测序验证重组克隆载体dbn04-t中所述vip3aa-04核苷酸序列正确插入。

按照上述构建重组克隆载体dbn01-t的方法，将合成的所述cry1ab核苷酸序列连入克隆载体pgem-t上，得到重组克隆载体dbn05-t，其中，cry1ab为cry1ab核苷酸序列(seqidno：10)。酶切和测序验证重组克隆载体dbn05-t中所述cry1ab核苷酸序列正确插入。

按照上述构建重组克隆载体dbn01-t的方法，将合成的所述cry2ab核苷酸序列连入克隆载体pgem-t上，得到重组克隆载体dbn06-t，其中，cry2ab为cry2ab核苷酸序列(seqidno：12)。酶切和测序验证重组克隆载体dbn06-t中所述cry2ab核苷酸序列正确插入。

2、构建含有vip3aa基因的重组表达载体

用限制性内切酶scai和spei分别酶切重组克隆载体dbn01-t和表达载体dbnbc-01(载体骨架：pcambia2301(cambia机构可以提供))，将切下的vip3aa-01核苷酸序列片段插到表达载体dbnbc-01的scai和spei位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体dbn100002，其构建流程如图2所示(kan：卡那霉素基因；rb：右边界；pratubi10：拟南芥ubiquitin(泛素)基因启动子(seqidno：13)；vip3aa-01：vip3aa-01核苷酸序列(seqidno：2)；tnos：胭脂碱合成酶基因的终止子(seqidno：14)；pr35s：花椰菜花叶病毒35s启动子(seqidno：15)；pat：草丁膦乙酰转移酶基因(seqidno：16)；t35s：花椰菜花叶病毒35s终止子(seqidno：17)；lb：左边界)。

将重组表达载体dbn100002用热激方法转化大肠杆菌t1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌t1感受态细胞、10μl质粒dna(重组表达载体dbn100002)，42℃水浴30s；37℃振荡培养1h(100rpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/l卡那霉素(kanamycin)的lb固体平板(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l、琼脂15g/l，用naoh调ph至7.5)上于温度37℃条件下培养12h，挑取白色菌落，在lb液体培养基(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l、卡那霉素50mg/l，用naoh调ph至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶scai和spei酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体dbn100002在scai和spei位点间的核苷酸序列为序列表中seqidno：2所示核苷酸序列，即vip3aa-01核苷酸序列。

按照上述构建重组载体dbn100002的方法，将scai和spei酶切重组克隆载体dbn02-t切下的所述vip3aa-02核苷酸序列插入表达载体dbnbc-01，得到重组载体dbn100741。酶切和测序验证重组表达载体dbn100741中的核苷酸序列含有为序列表中seqidno：4所示核苷酸序列，即vip3aa-02核苷酸序列，所述vip3aa-02核苷酸序列可以连接所述pratubi10启动子和tnos终止子。

按照上述构建重组载体dbn100002的方法，将scai和spei酶切重组克隆载体dbn03-t切下的所述vip3aa-03核苷酸序列插入表达载体dbnbc-01，得到重组载体dbn100742。酶切和测序验证重组表达载体dbn100742中的核苷酸序列含有为序列表中seqidno：6所示核苷酸序列，即vip3aa-03核苷酸序列，所述vip3aa-03核苷酸序列可以连接所述pratubi10启动子和tnos终止子。

按照上述构建重组载体dbn100002的方法，将scai和spei酶切重组克隆载体dbn04-t切下的所述vip3aa-04核苷酸序列插入表达载体dbnbc-01，得到重组载体dbn100743。酶切和测序验证重组表达载体dbn100743中的核苷酸序列含有为序列表中seqidno：8所示核苷酸序列，即vip3aa-04核苷酸序列，所述vip3aa-04核苷酸序列可以连接所述pratubi10启动子和tnos终止子。

按照上述构建重组载体dbn100002的方法，将scai和spei、kasi和bamhi分别酶切重组克隆载体dbn02-t和dbn05-t切下的所述vip3aa-02核苷酸序列和cry1ab核苷酸序列插入表达载体dbnbc-01，得到重组表达载体dbn100003。酶切和测序验证重组表达载体dbn100003中的核苷酸序列含有为序列表中seqidno：4和seqidno：10所示核苷酸序列，即vip3aa-02核苷酸序列和cry1ab核苷酸序列。

按照上述构建重组载体dbn100002的方法，将scai和spei、ncoi和spei分别酶切重组克隆载体dbn01-t和dbn06-t切下的所述vip3aa-01核苷酸序列和cry2ab核苷酸序列插入表达载体dbnbc-01，得到重组表达载体dbn100370。酶切和测序验证重组表达载体dbn100370中的核苷酸序列含有为序列表中seqidno：4和seqidno：12所示核苷酸序列，即vip3aa-01核苷酸序列和cry2ab核苷酸序列。

3、重组表达载体转化农杆菌

对已经构建正确的重组表达载体dbn100002、dbn100741、dbn100742、dbn100743、dbn100003和dbn100370用液氮法转化到农杆菌lba4404(invitrgen，chicago，usa，cat：18313-015)中，其转化条件为：100μl农杆菌lba4404、3μl质粒dna(重组表达载体)；置于液氮中10min，37℃温水浴10min；将转化后的农杆菌lba4404接种于lb试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2h，涂于含50mg/l的利福平(rifampicin)和100mg/l的卡那霉素的lb平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶对重组表达载体dbn100002、dbn100741、dbn100742、dbn100743、dbn100003和dbn100370酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体dbn100002、dbn100741、dbn100742、dbn100743、dbn100003和dbn100370结构完全正确。

第三实施例、转基因植株的获得

1、获得转基因大豆植株

按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的大豆品种中黄13的子叶节组织与第二实施例中3所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2构建的重组表达载体dbn100002、dbn100741、dbn100742、dbn100743、dbn100003和dbn100370的t-dna(包括拟南芥泛素基因的启动子序列、vip3aa-01核苷酸序列、vip3aa-02核苷酸序列、vip3aa-03核苷酸序列、vip3aa-04核苷酸序列、vip3aa-02-cry1ab核苷酸序列、vip3aa-01-cry2ab核苷酸序列、pat基因和tnos终止子序列)转入到大豆染色体组中，获得了转入vip3aa-01核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-03核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-04核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02-cry1ab核苷酸序列的大豆植株和转入vip3aa-01-cry2ab核苷酸序列的大豆植株；同时以野生型大豆植株作为对照。

对于农杆菌介导的大豆转化，简要地，将成熟的大豆种子在大豆萌发培养基(b5盐3.1g/l、b5维他命、蔗糖20g/l、琼脂8g/l，ph5.6)中进行萌发，将种子接种于萌发培养基上，按以下条件培养：温度25±1℃；光周期(光/暗)为16/8h。萌发4-6天后取鲜绿的子叶节处膨大的大豆无菌苗，在子叶节下3-4mm处切去下胚轴，纵向切开子叶，去顶芽、侧芽和种子根。用解剖刀的刀背在子叶节处进行创伤，用农杆菌悬浮液接触创伤过的子叶节组织，其中农杆菌能够将vip3aa核苷酸序列传递至创伤过的子叶节组织(步骤1：侵染步骤)在此步骤中，子叶节组织优选地浸入农杆菌悬浮液(od660＝0.5-0.8)，侵染培养基(ms盐2.15g/l、b5维他命、蔗糖20g/l、葡萄糖10g/l、乙酰丁香酮(as)40mg/l、2-吗啉乙磺酸(mes)4g/l、玉米素(zt)2mg/l，ph5.3)中以启动接种。子叶节组织与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2：共培养步骤)。优选地，子叶节组织在侵染步骤后在固体培养基(ms盐4.3g/l、b5维他命、蔗糖20g/l、葡萄糖10g/l、mes4g/l、zt2mg/l、琼脂8g/l，ph5.6)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(b5盐3.1g/l、b5维他命、mes1g/l、蔗糖30g/l、zt2mg/l、琼脂8g/l、头孢霉素150mg/l、谷氨酸100mg/l、天冬氨酸100mg/l，ph5.6)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素)，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：恢复步骤)。优选地，子叶节再生的组织块在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，子叶节再生的组织块在含选择剂(草丁膦)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，子叶节再生的组织块在有选择剂的筛选固体培养基(b5盐3.1g/l、b5维他命、mes1g/l、蔗糖30g/l、6-苄基腺嘌呤(6-bap)1mg/l、琼脂8g/l、头孢霉素150mg/l、谷氨酸100mg/l、天冬氨酸100mg/l、草丁膦6mg/l，ph5.6)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，转化的细胞再生成植物(步骤5：再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的子叶节再生的组织块在固体培养基(b5分化培养基和b5生根培养基)上培养以再生植物。

筛选得到的抗性组织块转移到所述b5分化培养基(b5盐3.1g/l、b5维他命、mes1g/l、蔗糖30g/l、zt1mg/l、琼脂8g/l、头孢霉素150mg/l、谷氨酸50mg/l、天冬氨酸50mg/l、赤霉素1mg/l、生长素1mg/l、草丁膦6mg/l，ph5.6)上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述b5生根培养基(b5盐3.1g/l、b5维他命、mes1g/l、蔗糖30g/l、琼脂8g/l、头孢霉素150mg/l、吲哚-3-丁酸(iba)1mg/l)，在生根培养上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于26℃下培养16h，再于20℃下培养8h。

第四实施例、用taqman验证转基因植株

分别取转入vip3aa-01核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-03核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-04核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02-cry1ab核苷酸序列的大豆植株和转入vip3aa-01-cry2ab核苷酸序列的大豆植株的叶片约100mg作为样品，用qiagen的dneasyplantmaxikit提取其基因组dna，通过taqman探针荧光定量pcr方法检测pat基因的拷贝数以确定vip3aa基因的拷贝数。同时以野生型大豆植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

检测pat基因拷贝数的具体方法如下：

步骤11、分别取转入vip3aa-01核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-03核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-04核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02-cry1ab核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-01-cry2ab核苷酸序列的大豆植株和野生型大豆植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；

步骤12、使用qiagen的dneasyplantminikit提取上述样品的基因组dna，具体方法参考其产品说明书；

步骤13、用nanodrop2000(thermoscientific)测定上述样品的基因组dna浓度；

步骤14、调整上述样品的基因组dna浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；

步骤15、采用taqman探针荧光定量pcr方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型大豆植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量pcr引物和探针序列分别是：

以下引物和探针用来检测pat核苷酸序列：

引物1：gagggtgttgtggctggtattg如序列表中seqidno：18所示；

引物2：tctcaactgtccaatcgtaagcg如序列表中seqidno：19所示；

探针1：cttacgctgggccctggaaggctag如序列表中seqidno：20所示；

pcr反应体系为：

所述50×引物/探针混合物包含1mm浓度的每种引物各45μl，100μm浓度的探针50μl和860μl1×te缓冲液，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。

pcr反应条件为：

利用sds2.3软件(appliedbiosystems)分析数据。

实验结果表明，vip3a-01核苷酸序列、vip3aa-02核苷酸序列、vip3a-03核苷酸序列、vip3a-04核苷酸序列、vip3aa-02-cry1ab核苷酸序列和vip3aa-01-cry2ab核苷酸序列均已整合到所检测的大豆植株的染色体组中，而且转入vip3aa-01核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-03核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-04核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02-cry1ab核苷酸序列的大豆植株和转入vip3aa-01-cry2ab核苷酸序列的大豆植株均获得了单拷贝的转基因大豆植株。

第五实施例、转基因植株的抗虫效果检测

将转入vip3aa-01核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-03核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-04核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02-cry1ab核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-01-cry2ab核苷酸序列的大豆植株、野生型大豆植株和经taqman鉴定为非转基因的大豆植株对南美棉铃虫、中国棉铃虫进行抗虫效果检测。

分别取转入vip3aa-01核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-03核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-04核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02-cry1ab核苷酸序列的大豆植株和转入vip3aa-01-cry2ab核苷酸序列的大豆植株、野生型大豆植株和经taqman鉴定为非转基因的大豆植株(v3期倒二叶)的新鲜叶片，用无菌水冲洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，然后去除叶脉，同时剪成直径约1cm的圆形，取1-3片(根据昆虫食量确定叶片数量)剪后的圆形叶片放入生测板孔内的滤纸上，所述滤纸用蒸馏水润湿，每个孔内放1头初孵幼虫加盖后，在温度26-28℃、相对湿度70-80％、光周期(光/暗)16∶8的条件下放置5天后，统计南美棉铃虫、中国棉铃虫的死亡率和叶片损伤率(叶片损伤率是指被害虫取食的叶片面积占叶片总面积的比例)指标。转入vip3aa-01核苷酸序列的共2个株系(s1、s2)，转入vip3aa-02核苷酸序列的共2个株系(s3、s4)，转入vip3aa-03核苷酸序列的共2个株系(s5、s6)，转入vip3aa-04核苷酸序列的共2个株系(s7、s8)，转入vip3aa-02-cry1ab核苷酸序列的共2个株系(s9、s10)，转入vip3aa-01-cry2ab核苷酸序列的共2个株系(s11、s12)，经taqman鉴定为非转基因的(ngm)共1个株系，野生型的(阴性对照，ck)共1个株系；从每个株系选6株进行测试，每株重复32个生测孔。转基因植株抗虫效果的实验中，南美棉铃虫的实验在南美阿根延完成。结果如表1至表4所示。

表1、转基因大豆植株接种后南美棉铃虫致死率

表2、转基因大豆植株接种后中国棉铃虫致死率

表3转基因大豆植株接种南美棉铃虫的叶片损伤情况

表4转基因大豆植株接种中国棉铃虫的叶片损伤情况

表1和表3的结果表明：转入vip3aa-01核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-03核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-04核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02-cry1ab核苷酸序列的大豆植株和转入vip3aa-015cry2ab核苷酸序列的大豆植株对南美棉铃虫均具有较好的杀虫效果，南美棉铃虫的平均死亡率在90％以上；同时，上述大豆植株大体上只受到南美棉铃虫的轻微损伤，其叶片损伤率均在10％左右；而经taqman鉴定为非转基因的大豆植株和野生型大豆植株的南美棉铃虫致死率和叶片损伤率分别为7％和47％左右。

表2和表4的结果表明：转入vip3aa-01核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-03核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-04核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02-cry1ab核苷酸序列的大豆植株和转入vip3aa-015cry2ab核苷酸序列的大豆植株对中国棉铃虫的杀虫效果属于中等抗性，中国棉铃虫的平均死亡率在78％左右；同时，上述大豆植株大体上收到中国棉铃虫的轻微损伤，其叶片损伤率在18％左右；而经taqman鉴定为非转基因的大豆植株和野生型大豆植株的中国棉铃虫致死率和叶片损伤率分别为6％和46％左右。

与此同时，表1-4的结果还表明，与中国棉铃虫相比，转入vip3aa-01核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-03核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-04核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02-cry1ab核苷酸序列的大豆植株和转入vip3aa-01-cry2ab核苷酸序列的大豆植株对南美棉铃虫初孵幼虫的致死率明显高于中国棉铃虫；且大豆植株受到南美棉铃虫叶片损伤率明显低于中国棉铃虫。

由此证明转入vip3aa-01核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-03核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-04核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02-cry1ab核苷酸序列的大豆植株和转入vip3aa-01-cry2ab核苷酸序列的大豆植株都显示出抑制南美棉铃虫的活性，这种活性足以对南美棉铃虫的生长产生不良效应从而使其在田间得以控制，且这种抑制活性不可预期的由于中国棉铃虫。

上述实验结果还表明转入vip3aa-01核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-03核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-04核苷酸序列的大豆植株、转入vip3aa-02-cry1ab核苷酸序列的大豆植株和转入vip3aa-01-cry2ab核苷酸序列的大豆植株对南美棉铃虫的控制/防治显然是因为植物本身可产生vip3aa蛋白，所以，本领域技术人员熟知的，根据vip3aa蛋白对南美棉铃虫的毒杀作用，本发明中转入vip3aa蛋白植株还可以产生至少一种不同于vip3aa蛋白的第二种杀虫蛋白质，如cry类蛋白。

综上所述，本发明杀虫蛋白的用途通过植物体内产生能够杀死南美棉铃虫的vip3aa蛋白来控制南美棉铃虫害虫；与现有技术使用的农业防治方法、化学防治方法、物理防治方法和生物防治方法相比，本发明对植物进行全生育期、全植株的保护以防治南美棉铃虫害虫的侵害，且无污染、无残留，效果稳定、彻底，简单、方便、经济。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

<110>北京大北农生物技术有限公司

<120>杀虫蛋白的用途

<130>cp1190645p-cn/cb

<160>20

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>789

<212>prt

<213>人工序列-vip3aa-01氨基酸序列(artificialsequence)

<400>1

metasnlysasnasnthrlysleuserthrargalaleuproserphe

151015

ileasptyrpheasnglyiletyrglyphealathrglyilelysasp

202530

ilemetasnmetilephelysthraspthrglyglyaspleuthrleu

354045

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65707580

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100105110

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130135140

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145150155160

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195200205

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210215220

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225230235240

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245250255

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260265270

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275280285

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290295300

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325330335

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340345350

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355360365

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370375380

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385390395400

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405410415

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435440445

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450455460

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465470475480

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485490495

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500505510

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515520525

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530535540

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565570575

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580585590

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595600605

leulysaspgluasnthrglytyrilehistyrgluaspthrasnasn

610615620

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625630635640

aspleulysglyvaltyrleuileleulysserglnasnglyaspglu

645650655

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660665670

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675680685

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690695700

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725730735

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740745750

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755760765

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770775780

aspvalserilelys

785

<210>2

<211>2370

<212>dna

<213>人工序列-vip3aa-01核苷酸序列(artificialsequence)

<400>2

atgaacaagaacaacaccaagctctccacacgggcacttccctcctttattgactacttt60

aatggcatctatgggtttgctacggggatcaaggacattatgaacatgatcttcaagaca120

gacactggcggggatcttacgctcgacgagattcttaagaatcagcaactcctgaacgat180

atctctggcaagctggacggcgtgaatgggtcacttaacgacctcatcgctcaggggaat240

ctcaacacagaactgtctaaggagatcctcaagattgcaaatgagcagaaccaagttctt300

aatgatgtgaacaataagctcgacgccatcaacacaatgcttcgcgtgtacctcccaaag360

attactagcatgctctcggacgtcattaagcagaactacgcgctgtcccttcaaattgag420

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aagaatgacgtcgatggcttcgagttttacctgaacacgttccacgacgttatggtgggc720

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gttaagacgagcggctcggaggtcgggaatgtttacaacttccttatcgtcctcaccgca840

ctccaggcccaagcgtttctcacgctgaccacctgccgcaagctcctcggcctcgcagac900

atcgattacacctccatcatgaacgagcacctgaacaaggagaaggaggagttccgcgtg960

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tccgacgaagatgcaaagatgatcgttgaggccaagcctggccatgcgctcatcgggttc1080

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gtgatcaccaagattgactttacgaagaagatgaagacactccggtacgaggtgacggct1320

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gagaaggacaacttttatatcgaactgtcccaagggaataacctctacggcggccccatt2340

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<210>3