移植有人肝细胞的非人脊椎动物及其制造方法与流程

1.本发明涉及一种移植有人肝细胞的非人脊椎动物。


背景技术：

2.为了分析人特异性肝炎病毒的感染、所给药的药剂的代谢、或人肝脏的增殖，目前，多个团队均制得了保持有人肝细胞的免疫耐受小鼠。其中，在保持外源胸苷激酶基因在该肝脏中特异性表达，且移植有人的肝细胞的小鼠中，小鼠的肝细胞被人的肝细胞取代，人肝细胞取代率良好，达80％左右(参见专利文献1)。
3.现有技术文献
4.专利文献
5.专利文献1：专利第5073836号公报


技术实现要素：

6.本发明的目的在于，提供一种人肝细胞的增殖速度比目前存在的人肝脏移植非人脊椎动物更快，且人肝细胞的取代率、组织学及生理学上的人再造性也很高的非人脊椎动物及其制造方法、以及通过该有效的作用制备更高程度重建了人肝组织的结构及生理的非人脊椎动物、及该非人脊椎动物的制造方法。
7.本发明人等针对人肝细胞的增殖速度比目前存在的人肝脏移植小鼠更快，且人肝细胞的取代率也很高的移植有人的肝细胞的小鼠的制造方法进行了潜心研究。
8.本发明人等发现，通过在向免疫缺陷小鼠移植人肝细胞时存在人il
‑
6，能够制造人肝细胞的增殖速度快，且人肝细胞的取代率也很高的移植有人的肝细胞的小鼠。此外还发现，该小鼠为具有与人肝脏非常类似的肝脏的小鼠模型，在这种人肝细胞的取代快且取代率也高的小鼠的肝脏中，组织学及生理学上均更高程度地再造了人肝组织，从而完成了本发明。
9.即，本发明如下所述。
10.[1]一种移植有人肝细胞的基因改造非人脊椎动物的制造方法，包括在体内存在人il
‑
6的状态下向对于人的免疫反应缺失或降低的非人脊椎动物中移植人肝细胞。
[0011]
[2]根据[1]的制造方法，其中，对于人的免疫反应缺失或降低的非人脊椎动物为免疫缺陷动物。
[0012]
[3]根据[1]或[2]的制造方法，其中，通过肝损伤诱导法使对于人的免疫反应缺失或降低的非人脊椎动物的肝脏产生肝损伤，使移植后的人的肝细胞代替非人脊椎动物的肝细胞在非人脊椎动物的肝脏中存活。
[0013]
[4]根据[3]的制造方法，其中，肝损伤通过以下中任意一种方法诱导：
[0014]
(i)通过在对于人的免疫反应缺失或降低的非人脊椎动物的肝脏中保持胸苷激酶基因能够表达，并向非人脊椎动物给药人肝细胞与自杀底物来诱导肝损伤；
[0015]
(ii)通过在对于人的免疫反应缺失或降低的非人脊椎动物的肝脏中保持尿激酶
型纤溶酶原激活因子基因能够表达来诱导肝损伤；
[0016]
(iii)通过使对于人的免疫反应缺失或降低的非人脊椎动物的延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fah)基因缺失来诱导肝损伤；
[0017]
(iv)通过给药以下(a)～(e)中任意一种化合物来诱导肝损伤：
[0018]
(a)四氯化碳
[0019]
(b)对乙酰氨基酚
[0020]
(c)d
‑
半乳糖胺
[0021]
(d)硫代乙酰胺
[0022]
(e)抗fas抗体；及
[0023]
(v)并用上述的(i)～(iv)中的两种、三种或四种。
[0024]
[5]根据[4]的制造方法，其中，通过在对于人的免疫反应缺失或降低的非人脊椎动物的肝脏中保持胸苷激酶基因能够表达，并向非人脊椎动物给药人肝细胞与自杀底物来诱导肝损伤。
[0025]
[6]根据[1]～[5]中任意一种制造方法，其中，通过向非人脊椎动物导入并表达人il
‑
6基因而使体内存在人il
‑
6。
[0026]
[7]根据[1]～[5]中任意一种制造方法，其中，通过向非人脊椎动物给药人il
‑
6而使体内存在人il
‑
6。
[0027]
[8]根据[1]～[5]中任意一种制造方法，其中，通过向非人脊椎动物给药并表达人il
‑
6基因表达培养细胞或表达该基因的载体分子而使体内存在人il
‑
6。
[0028]
[9]根据[4]～[8]中任意一种制造方法，其中，非人脊椎动物为通过如下工序制作的tk
‑
nog小鼠：
[0029]
(i)将人单纯疱疹病毒1型
‑
胸苷激酶(hsv
‑
tk)基因显微注射于nod/shi小鼠的受精卵；及
[0030]
(ii)使(i)工序中得到的具有人单纯疱疹病毒1型
‑
胸苷激酶(hsv
‑
tk)基因的nod/shi小鼠与nog(nod/scid/γc
null
)小鼠交配。
[0031]
[10]根据[9]的制造方法，其中，tk
‑
nog小鼠为由选自nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(alb
‑
ul23)7
‑
2/shijic、nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(ttr
‑
ul23 mutant30)4
‑
9/shijic、nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(ttr
‑
ul23 mutant30)5
‑
2/shijic小鼠及nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(ttr
‑
ul23 mutant30)10
‑
15/shijic构成的组中的基因记号所表示的小鼠。
[0032]
[11]根据[9]或[10]的制造方法，其中，所述制造方法包括下述工序：
[0033]
向[9]或[10]的小鼠、即在体内存在人il
‑
6的tk
‑
nog小鼠给药自杀底物及由人分离出的肝细胞，从而损伤小鼠肝细胞，并由人肝细胞取代小鼠肝细胞。
[0034]
[12]根据[9]或[10]的制造方法，其中，[9]或[10]的小鼠、即在体内存在人il
‑
6的tk
‑
nog小鼠为通过下述工序得到的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠：
[0035]
(i)将包含人il
‑
6cdna的dna片段显微注射于由雌性nod小鼠与雄性nog小鼠所制作的受精卵，获得人il
‑
6转基因首建小鼠；
[0036]
(ii)通过使人il
‑
6转基因首建小鼠与nog小鼠交配，得到scid及il2rg
null
的变异体；及
[0037]
(iii)使(ii)中得到的nog
‑
il
‑
6小鼠与tk
‑
nog小鼠交配。
[0038]
[13]根据[12]的制造方法，其中，得到的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠由选自由n nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg((alb
‑
ul23)7
‑
2,cmv
‑
il
‑
6)/shijic、nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(ttr
‑
ul23 mutant30)4
‑
9,cmv
‑
il
‑
6/shijic、nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(ttr
‑
ul23 mutant30)5
‑
2,cmv
‑
il
‑
6/shijic及nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(ttr
‑
ul23 mutant30)10
‑
15,cmv
‑
il
‑
6/shijic构成的组中的基因记号表示。
[0039]
[14]根据[4]～[13]中任意一种制造方法，其中，自杀底物为被胸苷激酶代谢成为毒性物质的物质。
[0040]
[15]根据[14]的制造方法，其中，被代谢成为毒性物质的物质为阿昔洛维或更昔洛韦。
[0041]
[16]根据[1]～[15]中任意一种制造方法，其中，人肝细胞为人肝细胞株。
[0042]
[17]根据[16]的制造方法，其中，人肝细胞株为hepg2、hep3b或huh
‑
7。
[0043]
[18]根据[1]～[15]中任意一种制造方法，其中，人肝细胞为经原代培养的肝细胞。
[0044]
[19]根据[4]～[18]中任意一种制造方法，其特征在于，通过将人单纯疱疹病毒1型
‑
胸苷激酶(hsv
‑
tk)基因置于白蛋白启动子、甲状腺素转运蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白启动子、lst
‑
1启动子、甲胎蛋白启动子、或α
‑
ttp启动子控制下，保持人单纯疱疹病毒1型
‑
胸苷激酶(hsv
‑
tk)基因能够在该肝脏中特异性表达。
[0045]
[20]一种移植有人的肝细胞的小鼠，小鼠的肝细胞的90％以上被人的肝细胞取代，从而重建有人肝脏，该肝脏具有人肝脏的三维的结构及人肝脏的功能，在体内存在人il
‑
6。
[0046]
[21]根据[20]的小鼠，其中，通过以下中任意一种方法损伤小鼠的肝细胞：
[0047]
(i)通过在对于人的免疫反应缺失或降低的非人脊椎动物的肝脏中保持胸苷激酶基因能够表达，并向非人脊椎动物给药人肝细胞与自杀底物来诱导肝损伤；
[0048]
(ii)通过在对于人的免疫反应缺失或降低的非人脊椎动物的肝脏中保持尿激酶型纤溶酶原激活因子基因能够表达来诱导肝损伤；
[0049]
(iii)通过使对于人的免疫反应缺失或降低的非人脊椎动物的延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fah)基因缺失来诱导肝损伤；
[0050]
(iv)通过给药以下(a)～(e)中任意一种化合物来诱导肝损伤：
[0051]
(a)四氯化碳
[0052]
(b)对乙酰氨基酚
[0053]
(c)d
‑
半乳糖胺
[0054]
(d)硫代乙酰胺
[0055]
(e)抗fas抗体；及
[0056]
(v)并用上述的(i)～(iv)中的两种、三种或四种。
[0057]
[22]根据[21]的移植有人的肝细胞的小鼠，其中，保持人单纯疱疹病毒1型
‑
胸苷激酶(hsv
‑
tk)基因能够在该肝脏中特异性表达，小鼠的肝细胞的90％以上被人的肝细胞取代，从而重建有人肝脏，该肝脏具有人肝脏的三维的结构及人肝脏的功能，体内存在人il
‑
6。
[0058]
[23]根据[20]～[22]中任意一种小鼠，其中，构建有人肝脏的肝胆管系统，该肝胆管系统具有人肝脏的功能性小叶结构，正常发挥肝脏的异物排泄功能。
[0059]
[24]根据[22]或[23]的小鼠，其中，所述小鼠为通过下述工序得到的小鼠(nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg((alb
‑
ul23)7
‑
2,cmv
‑
il
‑
6)/shijic)：
[0060]
(i)将人单纯疱疹病毒1型
‑
胸苷激酶(hsv
‑
tk)基因显微注射于nod/shi小鼠的受精卵；
[0061]
(ii)通过使(i)工序中得到的具有人单纯疱疹病毒1型
‑
胸苷激酶(hsv
‑
tk)基因的nod/shi小鼠与nog(nod/scid/γc
null
)小鼠交配制作nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(alb
‑
ul23)7
‑
2/shijic小鼠；
[0062]
(iii)将包含人il
‑
6cdna的dna片段显微注射于由雌性nod小鼠与雄性nog小鼠制作的受精卵，获得人il
‑
6转基因首建小鼠；，
[0063]
(iv)使通过使人il
‑
6转基因首建小鼠与nog小鼠交配而得到scid及il2rg
null
的变异体的工序中所得到的nog
‑
il
‑
6小鼠与(ii)的小鼠交配。
[0064]
[25]根据[20]～[24]中任意一种移植有人的肝细胞的小鼠，其中，人的肝细胞为人肝细胞株。
[0065]
[26]根据[25]的移植有人的肝细胞的小鼠，其中，人肝细胞株为hepg2、hep3b或huh
‑
7。
[0066]
[27]根据[20]～[24]中任意一种移植有人的肝细胞的小鼠，其中，人的肝细胞为经原代培养的肝细胞。
[0067]
[28]根据[20]～[27]中任意一种移植有人的肝细胞的小鼠，其中，通过将人单纯疱疹病毒1型
‑
胸苷激酶(hsv
‑
tk)基因置于白蛋白启动子、甲状腺素转运蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白启动子、lst
‑
1启动子、甲胎蛋白启动子、或α
‑
ttp启动子的控制下而保持人单纯疱疹病毒1型
‑
胸苷激酶(hsv
‑
tk)基因能够在该肝脏中特异性表达。
[0068]
[29]根据[20]～[28]中任意一种移植有人的肝细胞的小鼠，其中，进一步保持尿激酶型纤溶酶原激活因子基因能够在该肝脏中特异性表达。
[0069]
[30]根据[1]～[19]中任意一种制造方法，其中，移植后的人肝细胞的移植后的增殖速度与在体内不存在人il
‑
6时相比至少加快1.5倍。
[0070]
[31]根据[1]～[19]中任意一种制造方法，其中，进一步包括在移植人肝细胞之后给药人抗il
‑
6抗体。
[0071]
本说明书包含作为本技术的优先权的基础的日本国专利申请号2018
‑
234945号的公开内容。
[0072]
向对于人的免疫反应缺失或降低的非人脊椎动物移植人肝细胞时，通过使人il
‑
6存在，能够制造人肝细胞的增殖速度快，且人肝细胞的取代率也很高的移植有人的肝细胞的非人脊椎动物。
[0073]
由此表明，人il
‑
6具有显著促进移植至体内的人肝细胞的增殖的效果，能够用作在人以外的动物的体内使人肝细胞增殖的方法。这样所制作的具有人肝细胞的动物除用于药剂代谢及肝脏研究之外，还可以用作用于使用人肝细胞的in vitro研究的肝细胞提供资源。
附图说明
[0074]
图1为示出人白介素6基因表达单位的结构的图。
[0075]
图2为示出hsv
‑
tk mutant30(tkmut30)基因表达单位的结构的图。
[0076]
图3为示出移植有人肝细胞lhum17003的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠、及tk
‑
nog小鼠血清中的人白蛋白浓度的经时变化(平均值)的图。
[0077]
图4为针对移植有人肝细胞lhum17003的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠、及tk
‑
nog小鼠的每个个体示出推测取代指数的经时变化的图。
[0078]
图5为示出将从人肝细胞移植后的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中分离精制而得的肝脏细胞接种于涂布有1型胶原蛋白的器皿并经过48小时后的肝脏细胞的形态的图。
[0079]
图6为示出经时测定移植有人肝细胞hum4122b的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠、及tk
‑
nog小鼠血清中的人白蛋白浓度而得到的平均值的图。
[0080]
图7为示出针对移植有人肝细胞hum4122b的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠、及tk
‑
nog小鼠的每个个体经时测定推测取代指数而得到的值的图。
[0081]
图8为示出lhum17003供体细胞移植2周后的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠与tk
‑
nog小鼠的染色结果(a：h&e染色、b：hla染色)的图。
[0082]
图9为示出lhum17003供体细胞移植3周后的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠与tk
‑
nog小鼠的染色结果(a：h&e染色、b：hla染色)的图。
[0083]
图10为示出lhum17003供体细胞移植4周后的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠与tk
‑
nog小鼠的染色结果(a：h&e染色、b：hla染色)的图。
[0084]
图11为示出hum4122b供体细胞移植2周后的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠与tk
‑
nog小鼠的染色结果(a：h&e染色、b：hla染色)的图。
[0085]
图12为示出hum4122b供体细胞移植3周后的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠与tk
‑
nog小鼠的染色结果(a：h&e染色、b：hla染色)的图。
[0086]
图13为示出hum4122b供体细胞移植4周后的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠与tk
‑
nog小鼠的染色结果(a：h&e染色、b：hla染色)的图。
[0087]
图14为示出移植8周后的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠(a)与tk
‑
nog小鼠(b)的肝组织图像(h&e染色及hla染色)的图。
[0088]
图15为示出移植有人肝细胞lhum17003的tkmut30
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠与tkmut30
‑
nog小鼠的血清中的人白蛋白浓度的经时变化的图。
[0089]
图16为针对移植有人肝细胞lhum17003的tkmut30
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠与tkmut30
‑
nog小鼠的每个个体示出推测取代指数的经时变化的图。
[0090]
图17为示出人肝细胞lhum17003移植7周后的tkmut30
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠的肝组织图像(h&e染色(a)及hla染色(b))的图。
[0091]
图18为示出人肝细胞移植后的tkmut30
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠及tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠血清中人白蛋白浓度的测定结果的图。
[0092]
图19为示出tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠(a)及tk
‑
nog小鼠(b)中的人肝细胞的倍化时间的图。
[0093]
图20为示出向tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠移植人肝细胞之后给药抗il
‑
6抗体时的血中人白蛋白浓度(a)及胆碱酯酶活性(b)的测定结果的图。
具体实施方式
[0094]
下面，详细地对本发明进行说明。
[0095]
本发明为一种移植有人肝细胞的非人脊椎动物及其制造方法。
[0096]
本发明的移植有人肝细胞的基因改造脊椎动物为给药人白介素6(以下称为人il
‑
6)后的脊椎动物、或向保持人il
‑
6基因在体内能够表达的脊椎动物移植人肝细胞且人肝细胞在肝脏中存活的动物。
[0097]
脊椎动物不受限定，可列举：小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、迷你猪、猪、猴子等。猴子包括狨猴等。
[0098]
本发明中使用的移植人肝细胞的动物为不会因免疫而排除人il
‑
6及人肝细胞的动物，即，对于人的免疫反应灭火后的动物。作为这种动物，可列举免疫功能降低或缺失且对于人的免疫反应灭活后的动物，能够使用例如免疫缺陷动物或免疫耐受动物。
[0099]
免疫缺陷动物为免疫功能降低或缺失后的动物，其是缺失了t细胞、b细胞、nk细胞、树突状细胞、巨噬细胞中的一部分或全部的动物。免疫缺陷动物能够通过对全身照射x射线来制作，或者也能够使用在基因方面免疫功能缺失的动物。免疫耐受动物是指对于特定抗原的特异性免疫反应被缺失或抑制后的动物，本发明中，免疫耐受动物为免疫耐受对于人il
‑
6及人肝细胞成立的动物。作为对于人il
‑
6及人肝细胞的免疫耐受，通过向动物给药人il
‑
6或人肝细胞而使其获得免疫耐受。为了获得免疫耐受，可以向动物皮下注射人il
‑
6或人肝细胞，也可以口服给药。
[0100]
本发明中，将免疫缺陷动物及免疫耐受动物称为对于人的免疫反应缺失或降低后的动物。
[0101]
免疫缺陷动物的动物种类不受限制，能够适当地使用免疫缺陷小鼠、免疫缺陷大鼠、免疫缺陷猪等。
[0102]
作为免疫缺陷小鼠，可列举：裸鼠、nod/scid小鼠、rag2敲除小鼠、向scid小鼠给药asialo
‑
gm1抗体或tmβ1后的小鼠、x射线照射小鼠等。另外，也能够使用对于这些nod/scid小鼠或rag2敲除小鼠追加il
‑
2rγ敲除而成的敲除动物(以下称为dko(双敲除)动物)。能够使用例如dko小鼠(rag2 ko，il
‑
2r
null
)。本发明中，将以balb/c作为遗传背景的dko小鼠称为balb/c dko小鼠，将以nod作为遗传背景的小鼠称为nod dko小鼠。另外，小鼠的遗传背景不限定于此，可以为c57bl/6、c3h、dba2或iqi品系，也可以为具有scid变异与il
‑
2rγ敲除、或rag2敲除与il
‑
2rγ敲除变异的品系，另外，在il
‑
2受体的共同γ链的下游负责信号转导的jak3蛋白质的缺失的表型与il2rγ
null
相同，因此也可以为向rag2敲除小鼠追加jak3敲除而成的敲除小鼠或合并scid变异与jak3敲除的敲除小鼠、使这些交配而得到的近交系、非近交系、杂交系(f1杂交)小鼠。
[0103]
此外，为了排除该小鼠中可见的nk细胞等免疫细胞的影响，除如上所那样向scid小鼠给药使用asialo
‑
gm1抗体的方案之外，作为本发明中使用的其它小鼠，可列举基因改造免疫缺陷小鼠，在该基因改造免疫缺陷小鼠中，向il
‑
2受体γ链基因导入变异使il
‑
2受体γ链缺失，且，与t细胞及b细胞的抗原受体基因的重排相关的基因的scid变异位于两个等位基因位点。作为这样的小鼠，可列举：来自nod/scid小鼠并敲除了il
‑
2受体的相同的γ链后的小鼠即nog小鼠(nod/scid/γc
null
(nod/shi
‑
scid,il
‑
2rγko小鼠))、nsg小鼠(nod/scid/il2rγ
null
(nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rgtm1wjl/szj))、ncg小鼠(nod
‑
clone#30称为tk mutant30。hsv
‑
tk的野生型的碱基序列示于序列1，氨基酸序列示于序列号2，tk mutant30的碱基序列示于序列3，氨基酸序列示于序列号4。本发明中，在称为hsv
‑
tk的情况下，也包括tk mutant30及其它变异体。通过被胸苷激酶代谢而产生毒性的自杀底物导入了胸苷激酶的转基因，仅对具有胸苷激酶活性的细胞发挥细胞毒性，因此能够用作仅对靶细胞带来细胞损伤的选择性治疗剂。作为这种自杀底物，能够使用鸟苷类似物。更优选地，作为这些鸟苷类似物，可列举：通用作抗病毒药的更昔洛韦(ganciclovir；gcv)、缬更昔洛韦(valganciclovir；val gcv)、阿昔洛维(acyclovir)。
[0119]“保持胸苷激酶基因在小鼠的肝脏中能够表达”是指上述的胸苷激酶基因包含在小鼠的肝细胞中并在该细胞中表达。
[0120]
为了使本发明的胸苷激酶基因可以在小鼠的肝脏中表达，能够适当地使用在肝脏起作用的调控基因。作为该调控基因，使用编码在肝细胞中起作用的蛋白质的基因的调控基因。在此，“调控基因”是指作用于基因转录效率的增减的dna上的序列，包含但不限定于启动子、以及增强子、上游激活序列、沉默子、上游抑制序列及衰减子等。所述调控基因所来源的生物物种不限定于特定的生物物种。为了使胸苷激酶基可以在小鼠的肝脏中适当地表达，可以使用来自小鼠的调控基因。
[0121]
作为上述的启动子，只要为使胸苷激酶基因在肝脏中被表达的启动子，则不受特别限定。能够示例例如：白蛋白的启动子、甲状腺素转运蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白启动子、有机阴离子转运蛋白lst
‑
1的启动子、甲胎蛋白的启动子、α
‑
生育酚转运蛋白(α
‑
ttp)基因的启动子等。
[0122]
对肝脏特异性表达的基因的表达机制(基因的启动子分析)已有深入研究。即已知，在肝脏特异性表达的基因的转录起始点的5’上游区域，普遍存在的转录调节因子的结合位点及肝脏中大量存在的肝脏特异性转录因子的结合位点、响应于激素等细胞外刺激的上游激活序列被插入较为狭窄的区域。作为这样的转录因子的例子，可适当地列举：hnf
‑
1、hnf
‑
3、hnf
‑
4、hnf
‑
6、c/ebp、dbp等。本发明中，为了保持胸苷激酶基因在小鼠的肝脏中能够表达，胸苷激酶基因连接于在小鼠的肝脏中起作用的上游激活序列。
[0123]
因此，能够使用肝脏特异性转录因子所结合的上游激活序列，该肝脏特异性转录因子通过将例如上述的白蛋白的启动子、甲状腺素转运蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白启动子、有机阴离子转运蛋白lst
‑
1的启动子、甲胎蛋白的启动子、α
‑
生育酚转运蛋白(α
‑
ttp)基因的启动子区域的一定的区域用于上述的连结而潜在包含该区域。另外，在其它方案中，已经鉴定序列后的肝脏特异性上游激活序列可以通过基因重组方式作为外源性的基因而被整合。
[0124]
另外还表明，作为增大从启动子进行转录的水平的增强子，其不仅存在于上游激活序列，也存在于转录起始点的下游。例如，在具有包含5’上游1.3kb及3’下游区域的全长14kb的人血管紧张素原基因的转基因小鼠中，肝脏内可见该基因较高的表达。此外，在来自人肝脏癌的hepg2细胞中，在作为所述基因的转录起始点的下游区域的3.8kb的dna片段上确认到存在增强子。本发明中，为了使胸苷激酶基因肝脏特异性表达，也能够适当地使用这种增强子。
[0125]
此外，本发明中，为了使胸苷激酶基因肝脏特异性表达，也能够使用包含加尾信号(poly a signal)的3’非翻译序列。
[0126]
本发明中，为了保持胸苷激酶基因在小鼠的肝脏中能够表达，胸苷激酶基因连接于在小鼠的肝脏中起作用的上游激活序列。此外，也能够连接增强子或包含加尾信号的3’非翻译序列等。通过将这样连接后的基因组插入包含耐药基因等标记基因的载体，制作用于制备基因表达单位的整合载体，该基因表达单位用于保持胸苷激酶基因在宿主的肝脏中能够表达。
[0127]
能够制作导入有由该整合载体所制备的基因表达单位的转基因小鼠。例如，转基因小鼠能够按照公知的方法来制作(proc.natl.acad.sci.usa(1980)77,7380
‑
4)。
[0128]
具体而言，为了保持目标胸苷激酶基因在宿主的肝脏中能够表达而将制得的基因表达单位导入小鼠的全能细胞。作为基因所导入的全能细胞，可列举：受精卵及早期胚胎、以及具有分化多能性的es细胞、诸如ips细胞那样的培养细胞等。例如，通过使给药排卵诱发剂后的雌性小鼠与正常的雄性小鼠交配，能够适当地回收可以导入该基因表达单位的受精卵。一般通过向雄性前核显微注射来向小鼠受精卵中导入基因表达单位。受精卵细胞在体外培养后筛选认为成功导入了基因表达单位的细胞。将筛选出的细胞移植至代孕母体的输卵管，然后产生转基因嵌合小鼠。作为代孕母体，通常使用与切断输精管后的雄性进行交配而形成假孕状态的雌性。
[0129]
通过从得到的多个个体中筛选体细胞及生殖细胞中整合有导入基因的个体，能够制作目标转基因小鼠。
[0130]
作为保持胸苷激酶基因在其肝脏中能够表达的小鼠，可列举：将为了保持目标胸苷激酶基因在宿主的肝脏中能够表达而设计的基因导入所述的免疫缺陷小鼠的受精卵中所产生的转基因小鼠。除此之外，也能够使用从所述的免疫缺陷小鼠与转基因小鼠交配所诞生的后代中作为保持免疫缺陷小鼠的性状、且保持目标胸苷激酶基因在宿主的肝脏中能够表达的小鼠而选择的免疫缺陷小鼠，其中，所述转基因小鼠为向免疫功能未缺失的所述免疫缺陷小鼠的近交系小鼠的受精卵中导入上述所设计的基因而产生的。本发明中，将作为保持nog小鼠的性状、且保持目标胸苷激酶基因在宿主的肝脏中能够表达的小鼠而选择的小鼠称为tk
‑
nog小鼠。tk
‑
nog小鼠的制备法记载于专利第507836号公报。作为tk
‑
nog小鼠所保持的胸苷激酶基因，可列举：人单纯疱疹病毒1型―胸苷激酶(hsv
‑
tk)及其变异体。作为变异体，可列举例如所述的hsv
‑
tk mutant clone#30(tk mutant30)。将保持有tk mutant30的小鼠称为tkmut30
‑
nog小鼠。本发明中，在称为tk
‑
nog小鼠的情况下，包括tkmut30
‑
nog小鼠。tkmut30
‑
nog小鼠能够通过与tk
‑
nog小鼠相同的方法来制作。即，将用于制作tk
‑
nog小鼠的表达单位的alb启动子替换为甲状腺素转运蛋白启动子，并将hsv
‑
tk基因cdna(从起始密码子至终止密码子)替换为hsv
‑
tk mutant 30基因cdna(从起始密码子至终止密码子)来制作即可。作为tk
‑
nog小鼠的基因型，可列举：nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(alb
‑
ul23)7
‑
2/shijic小鼠(tk
‑
nog)、nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(ttr
‑
ul23 mutant30)4
‑
9/shijic小鼠(tkmut30
‑4‑9‑
nog)、nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(ttr
‑
ul23mutant30)5
‑
2/shijic小鼠(tkmut30
‑5‑2‑
nog) 及nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(ttr
‑
ul23 mutant30)10
‑
15/shijic小鼠(tkmut30
‑
10
‑
15
‑
nog)。
[0131]
此外，也可以使用从所述的免疫缺陷小鼠与转基因小鼠交配所诞生的后代中作为保持免疫缺陷小鼠的性状、且保持目标胸苷激酶基因在宿主的肝脏中能够表达的小鼠而选择的免疫缺陷小鼠，其中，所述转基因小鼠是向免疫功能部分缺失的该小鼠的近交系小鼠
的受精卵中导入上述所设计的基因而产生的。更具体而言，作为优选的例子，可列举：从nog小鼠与向nod/scid小鼠的受精卵中导入该基因而产生的nod/scid转基因小鼠进行交配所诞生的后代中作为保持nog小鼠的性状、且保持目标胸苷激酶基因在宿主的肝脏中能够表达的小鼠而选择的小鼠、通过使tk
‑
nog小鼠与balb/ca dko小鼠(rag
‑
2ko,il
‑
2r
null
)交配，并与balb/ca dko小鼠反复交配而制作的tk
‑
balb/ca dko小鼠(hsv
‑
tk(+),scid wild,rag
‑
2ko,il
‑
2r
null
)、或通过使tk
‑
nog小鼠与nod dko小鼠(rag
‑
2ko,il
‑
2r
null
)交配并与nod dko小鼠反复交配而制作的tk
‑
nod dko小鼠(hsv
‑
tk(+),scid wild,rag
‑
2ko,il
‑
2r
null
)、通过使tk
‑
nog小鼠与iqi/scid,il
‑
2r
null
小鼠交配所制作的tk
‑
iqi/nog f1小鼠(hsv
‑
tk(+),scid,il
‑
2r
null
)再与iqi/scid,il
‑
2r
null
小鼠反复交配而制作的tk
‑
iqi scid,il
‑
2r
null
小鼠等。
[0132]
通过向保持本发明的胸苷激酶基因在其肝脏中能够表达的小鼠给药所述的鸟苷类似物，鸟苷类似物在该小鼠的肝细胞中被代谢成为毒性物质，从而使该小鼠产生肝损伤。可以作为所述鸟苷类似物的适当的例子所列举的更昔洛韦在小鼠的肝细胞中被代谢为更昔洛韦
‑
三磷酸使小鼠产生肝损伤。向该小鼠给药鸟苷类似物的给药方法能够自由选择。能够适当地选择例如静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、皮内给药、腹腔内给药、以及向皮肤上涂布等。除通过这些常用途径向小鼠体内给药之外，也可以通过混合在饮食中或饮水中来向小鼠体内给药。鸟苷类似物的给药量不受限定，为0.1～10mg/kg体重，优选为0.5～1.5mg/kg体重。另外，也可以按照0.05～0.5mg/ml的浓度添加在饮水，并使小鼠自由饮用1天至1周。
[0133]
除上述之外，作为使保持本发明的胸苷激酶基因在其肝脏中能够表达的小鼠产生肝损伤的方法，除给药所述的更昔洛韦之外，也可列举：利用四氯化碳、d
‑
半乳糖胺、吡咯烷生物碱类或2
‑
乙酰氨基芴等公知的肝损伤诱发物质进行处理、及手术肝切除等手术处理。此外，在其它方案中，也可以通过向该小鼠给药抗小鼠fas抗体来使小鼠产生肝损伤。抗小鼠fas抗体不与在人的肝细胞中表达的fas抗原结合，而与在小鼠的肝细胞中表达的fas抗原结合，从而在小鼠肝细胞中特异性地引起细胞凋亡。
[0134]
(ii)通过在对于人的免疫反应缺失或降低的非人脊椎动物的肝脏中保持尿激酶型纤溶酶原激活因子基因能够表达来诱导肝损伤的方法
[0135]
也能够使用代替上述的胸苷激酶基因而保持尿激酶型纤溶酶原激活因子基因在其肝脏中能够表达的具有nog变异的小鼠。即，能够使用将为了保持尿激酶型纤溶酶原激活因子基因在宿主的肝脏中能够表达而制作的基因表达单位导入所述的具有nog变异的小鼠的全能细胞中所产生的转基因小鼠。作为尿激酶型纤溶酶原激活因子基因，能够使用编码小鼠的尿激酶型纤溶酶原激活因子的多核苷酸。将这种小鼠称为upa
‑
nog小鼠，能够按照suemizu h.et al.,biochme biophys res commun,377,248,2008的记载来制作。
[0136]
此外，也能够使用保持胸苷激酶基因与尿激酶型纤溶酶原激活因子基因两者在其肝脏中能够表达的具有nog变异的小鼠。通过适当地选择通过胸苷激酶的作用造成肝损伤的时期及通过尿激酶型纤溶酶原激活因子的作用造成肝损伤的时期，能够优化给药后的人肝细胞的存活。
[0137]
该小鼠能够通过例如如下方式得到：将保持胸苷激酶基因在其肝脏中能够表达的小鼠与保持尿激酶型纤溶酶原激活因子基因在其肝脏中能够表达的具有nog变异的小鼠等
适当地组合并使其繁殖，从而选择具有所需的性状的小鼠、即保持胸苷激酶基因与尿激酶型纤溶酶原激活因子基因两者在其肝脏中能够表达且具有nog变异的后代小鼠。另外，也能够通过例如如下等操作来制作：将为了保持尿激酶型纤溶酶原激活因子基因在宿主的肝脏中能够表达而制作的基因表达单位导入保持胸苷激酶基因在宿主的肝脏中能够表达的小鼠的全能细胞。
[0138]
(iii)通过使对于人的免疫反应缺失或降低的非人脊椎动物的延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fah)基因缺失来诱导肝损伤的方法
[0139]
通过使fah基因缺失来诱导肝损伤的方法记载于azuma h.et al.,nat biotechnol,25,8,2007。另外，faysal elgilano et al.,am j pathol,187,1,2017中记载了，通过crispr/cas9基因组编辑技术利用猪来制作fah基因缺失动物。
[0140]
例如，可以通过使用免疫抑制剂、或者通过crispr/cas9基因组编辑技术使有关免疫的基因缺失而容易地制作人肝嵌合猪。
[0141]
(iv)通过给药以下(a)～(e)中的任意一种化合物来诱导肝损伤的方法
[0142]
(a)四氯化碳
[0143]
(b)对乙酰氨基酚
[0144]
(c)d
‑
半乳糖胺
[0145]
(d)硫代乙酰胺
[0146]
(e)抗fas抗体。
[0147]
上述的化合物已知作为为肝脏带来损伤的化学物质。
[0148]
通过向对于人肝细胞的免疫降低的动物(基因免疫缺陷、胎儿期或新生儿期致敏而获得免疫耐受、或者免疫抑制剂)给药这些化学物质也能够诱导肝损伤，并可以通过移植人肝细胞使其存活。
[0149]
上的(i)～(iv)的方法可以单独进行，也可以并用两种、三种或四种方法。
[0150]
作为用于制作本发明的移植有人肝细胞的脊椎动物的脊椎动物，只要在上述的免疫缺陷动物中使其体内存在人il
‑
6即可。
[0151]
作为使体内存在人il
‑
6的方法，可列举如下方法：
[0152]
1.以人il
‑
6基因能够表达的方式向上述的免疫缺陷动物中导入并表达人il
‑
6基因；及
[0153]
2.向上述的免疫缺陷动物给药人il
‑
6。
[0154]
作为1.的方法，还可以列举如下方法：
[0155]
(1)使免疫缺陷动物与以人il
‑
6基因能够表达的方式向该免疫缺陷动物中导入人il
‑
6基因而成的人il
‑
6转基因动物进行交配；
[0156]
(2)通过向上述的免疫缺陷动物给药人il
‑
6基因表达培养细胞而使其具有该细胞；及
[0157]
(3)将人il
‑
6基因表达载体接种于上述的免疫缺陷动物。
[0158]
作为使免疫缺陷动物与以人il
‑
6基因能够表达的方式向该免疫缺陷动物导入人il
‑
6基因而成的人il
‑
6转基因动物进行交配的方法(1)，其能够例如通过以下的工序来进行。
[0159]
向以人il
‑
6基因能够表达的方式导入有人il
‑
6基因的人il
‑
6转基因动物中导入
人il
‑
6基因表达单位即可。人il
‑
6基因表达单位包含启动子、增强子，此外，还可以包含加尾序列等元件。将人il
‑
6表达单位的例子示于图1。
[0160]
(i)向免疫缺陷动物的受精卵中注入包含人il
‑
6cdna的dna片段的工序
[0161]
在该工序中，可以使用导入有包含人il
‑
6cdna的dna片段的载体。dna片段的注入通过例如显微注射、电穿孔等来进行即可。
[0162]
(ii)培养(i)中得到的dna片段注入受精卵以得到新生幼仔的工序
[0163]
将该工序中得到的动物称为人il
‑
6转基因首建动物。作为从受精卵得到新生幼仔的方法，可列举例如如下方法：将注入dna片段后的受精卵在体外于30～40℃培养18～24小时之后，移植于代孕母体的子宫中并使其着床，从而得到新生幼仔。
[0164]
(iii)使(ii)中得到的首建动物与免疫缺陷动物交配的工序
[0165]
在导入tk基因的情况下，进一步使导入tk基因后的动物进行交配即可。
[0166]
这样得到的动物为体内表达人il
‑
6的免疫缺陷动物。
[0167]
例如，在使用tk
‑
nog小鼠作为免疫缺陷动物的情况下，如下制备。
[0168]
(i)将包含人il
‑
6cdna的dna片段显微注射于由雌性nod小鼠与雄性nog小鼠制作的受精卵，获得人il
‑
6转基因首建小鼠。
[0169]
(ii)通过使人il
‑
6转基因首建小鼠与nog小鼠交配得到scid及il2rg
null
的变异体。将该小鼠称为nog
‑
il
‑
6。
[0170]
(iii)使nog
‑
il
‑
6小鼠与tk
‑
nog小鼠交配。在得到的小鼠中，将具有人il
‑
6转入基因及hsvtk转入基因两者的小鼠称为tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠。该小鼠由例如nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg((alb
‑
ul23)7
‑
2,cmv
‑
il
‑
6)/shijic(tk
‑
nog
‑
il
‑
6)、nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(ttr
‑
ul23mutant30)4
‑
9,cmv
‑
il
‑
6/shijic小鼠(tkmut30
‑4‑9‑
nog
‑
il
‑
6)、nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(ttr
‑
ul23 mutant30)5
‑
2,cmv
‑
il
‑
6/shijic小鼠(tkmut30
‑5‑2‑
nog
‑
il6)及nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(ttr
‑
ul23mutant30)10
‑
15,cmv
‑
il
‑
6/shijic小鼠(tkmut30
‑
10
‑
15
‑
nog
‑
il6)这些基因记号表示。
[0171]
通过向这样得到的体内具有人il
‑
6的非人脊椎动物移植人肝细胞，能够制作移植有人肝细胞的非人脊椎动物。在非人脊椎动物伴有基因改造的情况下，则称为基因改造非人脊椎动物。
[0172]
作为将人的肝细胞移植至非人脊椎动物的方法，除经由非人脊椎动物的脾脏向肝脏移植的方法之外，也能够适当地采用直接从门静脉移植的方法。另外，也可以移植于腹腔内或静脉内。一次移植的人的肝细胞的细胞数可以从1～2,000,000(2
×
106)细胞中适当选择。
[0173]
作为肝细胞，能够适当地使用在血清(例如，胎牛血清)存在下所保持(包括培养、传代、储存)的普通肝细胞、原代肝细胞，优选为确立肝细胞株。作为供移植的人的肝细胞，只要其为以人肝实质细胞为主的人肝脏中的细胞，则也可以使用来自任意种类的细胞的肝细胞。在使用普通肝细胞的情况下，能够使用从被检体的肝组织中得到的肝细胞。作为采集肝组织的方法，除手术时切除之外，还可列举公知的方法即活检(biopsy)。肝活检是指将细长的针从皮肤的表面直接刺入肝脏来采集肝脏的组织的方法。通常，针所穿刺的部位为右胸下部的肋间。术前使用超声波检查装置确认穿刺部的安全性之后，对穿刺部进行消毒。并对皮肤至肝脏的表面进行麻醉，在穿刺部的皮肤切开小口之后刺入穿刺针。此外，也能够使
用市售的冷冻人肝细胞。
[0174]
在使用原代肝细胞的情况下，通过离心分离等对使用灌注法或渗透法等公知技术分散于冰冷后的克氏液等中的细胞悬浮液进行分级，由此从所采集的肝脏或肝组织中适当地分离肝细胞。利用适当添加有牛血清的williams’e等培养基在5％的co2存在下、于37℃将得到的肝细胞培养24小时。此外，也能够使用每3天将培养基更换为asf104培养基(味之素)等并培养至1周左右而得到的细胞。除可以向培养基中添加hgf及egf等细胞增殖因子之外，也能够适当地改变培养基体或三维培养等。
[0175]
在使用确立肝细胞株的情况下，肝细胞的种类不受特别限制，可列举例如：ssp
‑
25、rbe、hepg2、tgbc50tkb、huh
‑
6、huh
‑
7、etk
‑
1、het
‑
1a、plc/prf/5、hep3b、sk
‑
hep
‑
1、c3a、thle
‑
2、thle
‑
3、hepg2/2.2.1、snu
‑
398、snu
‑
449、snu
‑
182、snu
‑
475、snu
‑
387、snu
‑
423、fl62891、dms153等。这些细胞可以从美国典型培养物保藏中心(atcc)等获得。例如，hep3b及hepg2分别以hb
‑
8064及hb
‑
8065的注册号注册于atcc，huh
‑
7以jcrb0403的注册号注册于国立研究开发法人医药基础、健康、营养研究所jcrb细胞库。
[0176]
在使用对于人的免疫反应缺失或降低的非人脊椎动物的情况下，只要通过肝损伤诱导法使该动物产生肝损伤即可。在给药人肝细胞的情况下，移植至该动物中的人的肝细胞代替引起肝损伤后的动物的肝细胞在动物的肝脏中存活。动物的肝细胞伤亡，而在动物肝脏中存活的人的肝细胞则增殖，由此能够制作人的肝细胞占一定以上的数量的嵌合动物。作为该嵌合动物，可列举：动物肝脏的50％以上，优选为70％以上，进一步优选为75％以上，进一步优选为80％以上，更优选为90％以上，特别优选为95％以上，96％以上或者97％以上的动物肝脏被人的肝细胞所取代并占有的动物。将该取代率称为嵌合率。
[0177]
在使用导入有tk基因的免疫缺陷动物或对于il
‑
6获得免疫耐受的动物的情况下，给药鸟苷类似物等即可。鸟苷类似物与人肝细胞可以同时给药于动物，也可以分别给药于动物。例如，可以将鸟苷类似物给药于动物的腹腔内或者混合在饮水中使其饮用之后，从脾脏或静脉移植人肝细胞。
[0178]
将动物的肝细胞取代为人的肝细胞称为人的肝细胞或肝脏的重建(repopulation)，将用人的肝细胞取代动物的肝细胞以再造肝脏后的动物称为人肝细胞重建嵌合动物或人肝脏重建嵌合动物。在动物为小鼠的情况下，称为人肝细胞重建嵌合小鼠或人肝脏重建嵌合小鼠。另外，将肝细胞取代为人肝细胞的肝脏称为人源化肝脏(humanized liver)。
[0179]
本发明也包括在上述的小鼠等动物中重建的人肝脏组织。该肝脏组织具有人肝脏的三维结构或功能，非人脊椎动物的肝细胞的75％以上，优选为80％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上，96％以上或者97％以上被人的肝细胞取代而重建。另外，构建有人肝脏的肝胆管系统，该肝胆管系统具有人肝脏的功能性小叶结构，正常发挥肝脏的异物排泄功能。
[0180]
例如，在比较存在人il
‑
6的情况与不存在人il
‑
6的情况的情况下，即，与使用tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠的情况、不存在人il
‑
6而使用tk
‑
nog小鼠的情况相比，人肝细胞的增殖快速，且人肝细胞的嵌合率(存活率)也很高。例如，由于小鼠中的人肝细胞数与小鼠血中的人白蛋白浓度相关，故而，在以移植有人肝细胞的小鼠的血中的人白蛋白浓度为指标来比较人肝细胞的增殖性的情况下，tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中的增殖速度在移植第2周达到tk
‑
nog小鼠中
的增殖速度的2倍，移植4周以后，该增殖速度为tk
‑
nog小鼠中的增殖速度的1.2倍以上，优选为1.3倍以上，进一步优选为1.4倍以上。另外，在tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中，嵌合率超过70％(取代指数70％)的小鼠个体数与移植有肝细胞的小鼠个体数的比例在移植第4周以后为80％以上，而在tk
‑
nog小鼠中，该比例为10％以下或者50％以下。在将嵌合率为70％以上的小鼠个体数的比例作为指标的情况下，tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中的人肝细胞的嵌合率(存活率)为tk
‑
nog小鼠的1.3倍以上，优选为1.4倍以上。
[0181]
另外，在体内存在人il
‑
6的状态下向基因改造非人脊椎动物中移植人肝细胞的情况下，非人脊椎动物体内的人肝细胞的倍化时间比向不存在il
‑
6的基因改造非人脊椎动物中移植人肝细胞时短。
[0182]
例如，在向tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中移植人肝细胞的情况下，小鼠体内的人肝细胞的倍化时间比向不存在il
‑
6的tk
‑
nog小鼠中移植人肝细胞时短。
[0183]
使用人肝嵌合小鼠时的人肝细胞的倍化时间能够通过以下的方法来求得。
[0184]
首先，通过对人肝嵌合小鼠的肝脏进行胶原酶灌注来回收全肝细胞。通过台盼蓝染色对所回收的细胞数进行计数。通过流式细胞分析求得hla阳性细胞率(人细胞率)。通过所回收的细胞数
×
hla阳性率算的所回收的人细胞数。能够通过以下的式子算得倍化时间等。
[0185]
细胞移植后经过时间(天)＝肝细胞分离回收日
‑
肝细胞移植实施日扩增率(倍)＝(所回收的细胞数
×
hla阳性率)
÷
移植的细胞数细胞分裂次数(次)＝log(扩增率,2)
[0186]
倍加时间(天)＝细胞移植后经过时间
÷
细胞分裂次数
[0187]
向tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中移植人肝细胞时小鼠体内的人肝细胞的倍化时间最短为2.4天(56.9小时)以内，优选为3天(72.0小时)以内。向tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中移植人肝细胞时小鼠体内的人肝细胞的倍化时间比向tk
‑
nog小鼠中移植人肝细胞时小鼠体内的人肝细胞的倍化时间少至少1.2倍，优选为至少1.3倍，进一步优选为至少1.4倍，特别优选为至少1.5倍。即，向tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中移植人肝细胞时增殖速度比向tk
‑
nog小鼠中移植人肝细胞时小鼠体内的人肝细胞的增殖速度快至少1.2倍，优选为至少1.3倍，进一步优选为至少1.4倍，特别优选为至少1.5倍。
[0188]
通过组织学与免疫组化学可知，在tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中，移植4周后增殖灶消失，肝细胞大部分被人肝细胞取代。tk
‑
nog小鼠中看到的肝细胞的增殖灶的结构为培养细胞增殖后的形式，而tk
‑
nog
‑
il
‑
6、及tkmut30
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中看到的肝细胞的增殖灶的结构与培养细胞增殖后的形式明显不同，其具有如下特征：可见肝窦结构，并且，肝小叶结构接近人的小叶结构，被称为门管三联的小叶间动脈
‑
小叶间静脉
‑
小叶间胆管结构也被非常良好地保存。一般认为，如此一来，本发明提供的高嵌合效率、即换句话说小鼠肝细胞的更快的消灭发挥了意外的效果，即，最终带来了实现人肝组织的组织学再造这一成效，进而，本发明在生产白蛋白这一生理学方面，也能够更高效地提供人肝脏的重建(repopulation)。
[0189]
例如在人的肝细胞移植60天左右之后向具有这些人肝细胞的嵌合动物给药被检物质。作为被检物质，可列举例如医药候选物质。医药候选物质为处于药物开发的过程中的物质，可适当列举需要预测人体中的药物相互作用的物质。这种物质可以为针对药物的药效的主成分物质，或者也可以为包含主成分物质的组合物。医药候选物质的给药量根据作为该物质的对象的疾患的种类及物质组成的种类、或者给药途径等而不同，能够从0.1mg/
kg体重至2000mg/kg体重作用的范围内适当选择。另外，给药途径还能够根据医药候选物质的种类及其所适应的剂型等从口服给药、经皮给药、皮下给药、静脉内给药或腹腔内给药等中适当选择。
[0190]
关于嵌合动物的肝脏内的医药候选物质等被检物质的代谢的程度、及代谢物，能够通过色谱法等技术领域中的规定方法适当地测定及鉴定小鼠血浆中的医药候选物质的浓度而得到。另外，测定能够通过经时测定来实施，经时测定是指在从候选物质的给药起至30分～24小时左右期间适当选择的一个或多个时间点进行测定。
[0191]
并且，能够根据该血浆中的医药候选物质的浓度、及肝脏中被药物代谢酶代谢后的物质的浓度来判断医药候选物质为容易被例如cyp2d6、cyp2c9或cyp2c19缺失者代谢的物质还是不易被代谢的物质。
[0192]
人的药物代谢酶为属于cyp组酶的cyp1a1、cyp1a2、cyp1b1、cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8、cyp2c9、cyp2c10、cyp2c18、cyp2c19、cyp2d6、cyp2e1、cyp3a3、cyp3a4、cyp3a5、cyp3a7、cyp4f1、cyp4a2、cyp4a3等，关于各自的指示化合物，例如，被cyp1a2代谢的指示化合物为咖啡因，cyp2c9为甲苯磺丁脲，cyp2d6为右美沙芬，cyp2c19为奥美拉唑，cyp3a4为红霉素等。
[0193]
在向本发明的嵌合动物给药医药候选物质之后，给药这些指示化合物的混合物，并经时测定各化合物的血浆中浓度，由此能够判定医药候选物质为促进各种酶的活性的物质还是阻碍各种酶的活性的物质。例如，在给药了医药候选物质的情况下，如果促进咖啡因的代谢，且血浆中浓度减少，则能够判断该医药候选物质为特异性促进cyp1a2的活性的物质。
[0194]
即，能够使用本发明的动物来评价给药于人的医药在人的肝脏中如何被代谢，生成何种代谢物质，即评价医药的血浆动力学、代谢物的鉴定、代谢速度等。从代谢的观点出发，可以筛选适合给药于人的医药，及预测给药于人的适当医药用量。另外，还能够用于人肝脏的增殖、再生等研究。
[0195]
候选药剂能够通过任意的多种所需方法及/或适合药剂递送的方法来给药。例如候选药剂能够通过注射(例如，静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射、或用于实现所需的作用而向组织直接注射)、口服给药、或其它任意优选的方法适当地给药。通常，体内筛选法包括：以接受不同量及浓度的候选药剂(从不给药至达到能够良好地递送至动物的量的上限的药剂量)的多种动物为对象，通过各种剂形及途径递送药剂的方法。药剂除能够单独给药之外，特别是在药剂的并用给药会产生协同效果的情况下，也能够与两种或两种以上的药剂组合后给药。
[0196]
作为所筛选的候选药剂，能够使用：合成分子、天然分子、或重组制作的分子(例如低分子量的分子；药物；肽；抗体(包括抗原结合性的抗体片段，例如带来被动免疫的片段)、或其它免疫治疗药物：真核细胞或原核细胞所含的内源因子(例如聚肽及植物提取物等)等)。对于人细胞的毒性低的药剂的筛选测定法特别重要。
[0197]
此外，作为本发明的其它目的，可列举提供一种小鼠模型，该小鼠模型能够用于探索、检测、鉴定可以用于细胞移植疗法等的将来可以变为肝脏的细胞，例如肝干细胞。肝干细胞只要将来会分化为肝细胞即可，分化为肝细胞所需的世代数等不受特别限定。即，本发明还提供一种方法，该方法对小鼠模型进行从人肝组织所获得的原代分离细胞的经脾门静
脉移植，并从存活后的肝组织中探索或者进一步进行鉴定人肝干细胞等用于细胞移植疗法等的将来可以变为肝脏的细胞。此外，还能够从存活后的肝组织中采集包含人肝干细胞等用于细胞移植疗法等的将来可以变为肝脏的细胞的细胞群。本发明还提供一种采集包含该肝干细胞等用于细胞移植疗法等的将来可以变为肝脏的细胞的细胞群的方法。也可以适当使用原位移植来代替经脾门静脉移植。也可以将在试管内于适当的条件下培养并诱导向肝细胞分化后的干细胞代替原代分离细胞适当地用于本目的。这种使用干细胞诱导向肝细胞分化的方法记载于例如，gastroenterology(2009)136,990
‑
999等。为了以增殖性为指标从肝组织中探索并鉴定肝干细胞，能够使用识别用于检测肝细胞的标记的抗原、及/或识别增殖性细胞的抗体来进行组织免疫染色。作为检测肝细胞的标记，能够从白蛋白、酪氨酸氨基转移酶(tyrosine aminotransferase)、葡萄糖
‑6‑
磷酸酶(glucose
‑6‑
phosphatase)、凝血因子(coagulation factor)(cf)vii、去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor)、细胞角蛋白(cytokeratin)8/18等中适当选择。作为细胞增殖标记，能够从ki
‑
67抗原、5
‑
溴
‑
2'
‑
脱氧尿苷(5
‑
bromo
‑2’‑
deoxyuridine)吸收能力、pcna等中适当选择。通过使用这些标记能够获得包含人肝干细胞的细胞群，此外，表达这种标记的肝细胞能够使用facs calibur(日本becton dickinson株式会社)等适当分离，分离后的肝干细胞能够适当用于细胞移植疗法等。
[0198]
如上所述，能够使用非脊椎动物的血中人白蛋白浓度作为人肝细胞存活标记来确认移植至基因改造非人脊椎动物的人肝细胞是否存活并增殖。另外，小鼠等的血液中几乎未见胆碱酯酶活性。因此，能够将血中胆碱酯酶活性作为人肝细胞存活标记来确认移植至非人脊椎动物的人肝细胞是否存活并增殖。实际上，在移植有人肝细胞的小鼠中，血中人白蛋白浓度与血中胆碱酯酶活性高度相关。
[0199]
也能够取出移植有人肝细胞的基因改造脊椎动物中所构建的人肝脏并用于筛选等，通过使用移植有人肝细胞的基因改造脊椎动物及编织的人肝脏，能够在体内(in vivo)及体外(in vitro)两者进行筛选。
[0200]
在体内存在人il
‑
6的状态下向移植有人肝细胞的基因改造非人脊椎动物进一步给药抗人il
‑
6抗体的情况下，与未给药时相比，体内人肝细胞的增殖更快。即，通过向移植有人肝细胞的基因改造非人脊椎动物给药抗人il
‑
6抗体，能够促进人肝细胞移植后的存活及增殖。一般认为这是因为，抗il
‑
6抗体在存在人il
‑
6的非人脊椎动物中用作人il
‑
6的载体蛋白质，并保护其免于分解，从而长期起作用。抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体，优选为多克隆抗体。抗人il
‑
6抗体的给药量只要为例如每个个体给药数μg～数百μg即可。在非人脊椎动物为小鼠的情况下，每个个体给药1μg～100μg即可，优选给药2μg～20μg，进一步优选给药2μg～10μg，特别优选给药2μg～5μg。
[0201]
本发明也包含移植有人肝细胞的基因改造非人脊椎动物的制造方法，其包括在体内存在人il
‑
6的状态下向对于人的免疫反应缺失或降低的非人脊椎动物中移植人肝细胞，并给药抗人il
‑
6。
[0202]
实施例
[0203]
通过以下的实施例对本发明进行具体说明，但本发明不受这些实施例限定。
[0204]
[实施例1]
[0205]
tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中的人肝脏细胞的增殖
[0206]
示出实施例，在该实施例中，通过使用人白介素6(human interleukin
‑
6)/tk
‑
nog双敲除转基因小鼠(tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠)而能够显著地使移植至小鼠体内的人肝脏细胞增殖。
[0207]
人白介素6(human interleukin
‑
6:human il
‑
6)基因表达单位如现有报道(pmid:29456539,hanazawa a,ito r,katano i,kawai k,goto m,suemizu h,kawakami y,ito m,takahashi t.(2018).generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin
‑
6transgenic nog mice.front immunol,9,152.)所述(图1)。即，将包含被human cytomegalovirus(cmv)immediate early enhancer and promote(人巨细胞病毒立即早期增强子和启动子)控制表达的human il
‑
6cdna的dna片段显微注射于由雌性nod小鼠与雄性nog小鼠制作的受精卵，获得人il
‑
6转基因首建小鼠。通过使人il
‑
6转基因首建小鼠与nog小鼠交配得到scid及il2rg
null
的变异体。所确定的小鼠的品系在公式中由nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(cmv
‑
il
‑
6)/shijic这一基因记号表示，其简称为nog
‑
il
‑
6。在nog
‑
il
‑
6小鼠与tk
‑
nog小鼠交配所生的幼仔中，具有human interleukin
‑
6转入基因及hsvtk转入基因两者的小鼠由nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg((alb
‑
ul23)7
‑
2,cmv
‑
il
‑
6)/shijic这一基因记号表示，将其简称为tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠。
[0208]
肝脏损伤的诱发
[0209]
将溶解于蒸馏水的更昔洛韦(gcv)钠(denosine
‑
iv；mitsubishi tanabe pharma)单次或者每隔一天共两次给药于小鼠腹腔内。另外，用缬更昔洛韦(valgcv)(valganciclovir hydrochloride，盐酸缬更昔洛韦；sigma
‑
ardrich,merck)代替gcv溶解于饮水中口服给药。通过生化血清检查值及病理学分析调查肝损伤的程度。gcv或者valgcv给药1周后进行肝素采血，分离血浆后，通过fuji dri
‑
chem7000(fujifilm)进行临床化学分析(丙氨酸氨基转移酶；alt)。
[0210]
人肝细胞的移植
[0211]
使用市售的冷冻人肝细胞(biopredic公司：31岁男性lhum170003，lonza公司：35岁hum4122b)作为供体细胞。通过以下的方法移植至tk
‑
nog
‑
il
‑
6及tk
‑
nog。将valgcv溶液(0.06～0.08mg/ml)作为饮水用时48小时给与6～8周龄的成年tk
‑
nog
‑
il
‑
6及tk
‑
nog受体小鼠，给药开始1周后采血并测定血浆alt值。将血浆alt值显示为600u/l以上的个体作为人肝细胞移植的受体。通过台盼蓝排除法并使用血细胞比容仪算出人肝细胞数及其成活率。使用用于胰岛素皮下给药的带有29号(gauge)针头的注射管(myjector)将悬浮于40μl的william's medium e培养基中的约1
×
106个活肝细胞给药于脾脏内。
[0212]
人白蛋白测定
[0213]
人肝细胞移植1周后起每周使用聚乙烯管从眼底静脉丛采集少量的血。用包含1％牛血清白蛋白/0.05％tween20的tbs(tris缓冲盐水)稀释至5,000～250,000倍，使用人白蛋白elisa定量试剂盒(bethyl laboratories)测定人白蛋白浓度。阈值浓度为0.016mg/ml。
[0214]
组织学及免疫组化学
[0215]
将福尔马林固定后的肝脏包埋于石蜡，制作5μm厚的切片，并进行苏木素&伊红染色。将供给免疫组化学染色的切片放入target retrieval solution(抗原修复液)(0.1m柠檬酸盐缓冲液,ph 6.0；1mm edta,ph 9.0)中高压灭菌10分钟之后，在室温下放置20分钟。
将单克隆小鼠抗人hla
‑
classi
‑
a,b,c抗体(clone emr8
‑
5；hokudo)用作一抗。使用氨基酸聚合物/过氧化物酶复合物标记抗体(histofine simple stain mouse max po(m)；nichirei bioscience)及二氨基联苯胺(dab；dojindo laboratories)基质(0.2mg/ml 3,3'
‑
二氨基联苯胺四盐酸盐,0.05m tris
‑
hcl,ph 7.6,and 0.005％h2o2)使小鼠ig可视化，以进行明场免疫组化学。使用苏木素对切片进行对比染色。使用具备axiocam hrm及axiocam mrc5 ccd cameras(carl zeiss)的立式显微镜axio imager(carl zeiss)拍摄。
[0216]
人肝细胞的分离精制
[0217]
通过两步胶原酶灌注法从人肝细胞移植5周后的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中分离肝细胞。简而言之，将27g的翼状针插入下腔静脉，用粘结剂固定之后切断门静脉。接着，用37℃的1
×
肝脏灌注培养基(thermo fisher scientific公司制造)对肝脏灌注7分钟(6ml/分)。接着，将灌注培养基更换为0.15％胶原酶培养基[360u/ml胶原酶iv型(clss4；worthington biochemical corporation，美国新泽西州莱克伍德)、140u/ml胶原酶iv型(c1889；sigma
‑
aldrich)/ml，0.6mg/ml的cacl2、10mm的hepes(ph7.4)、及10mg/ml的庆大霉素]，按照1.5ml/分灌注10分钟。摘取肝脏，移入包含含有1％胎牛血清(fbs；thermo fisher scientific)的50ml的磷酸缓冲盐水(pbs)的培养皿中，稳定地摇动，使细胞从胶原酶消化后的肝脏中分散出来。用100μm尼龙过滤器过滤肝脏细胞，按照50
×
g、4℃离心4分钟。再用含有1％fbs的冰冷pbs 50ml将细胞清洗2次。通过27％percoll(ge healthcare，buckinghamshire，uk)的密度梯度离心分离(60
×
g，7分钟)除去死细胞，用含有1％fbs的冰冷pbs 50ml在50
×
g下反复清洗3次，每次4分钟。清洗3次之后，使细胞悬浮于包含10％fbs、44mm nahco3、1mm丙酮酸钠、及两种抗生物质(50单位/ml青霉素g及50μg/ml链霉素；sigma
‑
aldrich)的杜氏改良eagle培养基(dmem；sigma
‑
aldrich))中。通过台盼蓝排除试验确定所制备的肝脏细胞(hu
‑
liver细胞)的细胞数及成活率。
[0218]
流式细胞分析
[0219]
通过使用bd facscanto(bd biosciences)的流式细胞分析求得人白血球抗原(hla)表达人细胞与小鼠h
‑
2kd表达小鼠细胞相对于分离精制后的hu
‑
liver细胞总数的比率。简而言之，利用抗hla小鼠单克隆抗体(克隆g46
‑
2.6；bd biosciences)及抗小鼠h
‑
2kd小鼠单克隆抗体(克隆sf1
‑
1.1；bd biosciences)对细胞进行染色，同时，利用碘化丙啶(bd biosciences)评价细胞成活率。数据分析使用bd facsdiva软件程序(bd biosciences)及flowjo程序(tree star，san carlos，ca，usa)。
[0220]
结果如下所述。
[0221]
向tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠移植人肝细胞(lhum17003供体细胞)
[0222]
从人肝细胞移植的第二周起至移植5周后每周通过elisa法测定tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠及tk
‑
nog小鼠的血清中的人白蛋白。将结果示于图3。专利第5073836号公报中指明，在移植有人肝细胞的tk
‑
nog小鼠的肝脏中，被人肝细胞取代的比例(推测取代指数(ri))、即人肝细胞数与血清中的人白蛋白浓度高度相关。另外，suemizu h.et al.,pest management science,74,1424,2018中指明，在tk
‑
nog小鼠的肝脏中，被人肝细胞取代的比例(推测取代指数(ri))、即人肝细胞数与血清中的丁基胆碱酯酶(che)活性也高度相关。肝细胞移植1周后，tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠的血中人白蛋白浓度与tk
‑
nog小鼠相比已经显著增高，移植2周后，tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠的血中人白蛋白浓度达到tk
‑
nog小鼠的2倍。然后，3周、4周时，tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠仍然显示出与tk
‑
nog小鼠相比显著较高的血中人白蛋白浓度。tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠在移植后5周仍具有较高的倾向，但血中人白蛋白浓度不再具有显著差异，由此表明，人肝细胞的快速增殖在移植5周后达到平台期。
[0223]
药物代谢实验的用途中通常使用推测取代指数为70％以上的具有人肝细胞的小鼠。针对移植有人肝细胞的小鼠的每个个体将血中人白蛋白浓度示于图4。在移植有人肝细胞的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中，移植4周后大部分小鼠(13只中10只,76.9％)的取代指数超过70％，而在具有人肝细胞的小鼠(tk
‑
nog小鼠)中，取代指数超过70％的非常少(17只中2只,11.8％)。移植后5周时，tk
‑
nog小鼠中，16只中9只(56.2％)的取代指数超过70％，而tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中，9只中8只(88.9％)小鼠的取代指数超过70％。由此预测，tk
‑
nog
‑
il
‑
6中，所移植的人肝细胞的增殖较早，并且，可以高效地获得取代指数为70％以上的具有人肝细胞的小鼠。
[0224]
向tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠移植人肝细胞(hum4122b供体细胞)
[0225]
自人肝细胞移植第二周起至移植5周后每周通过elisa法测定tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠及tk
‑
nog小鼠的血清中的人白蛋白。将结果示于图6。专利第5073836号公报中指明，在移植有人肝细胞的tk
‑
nog小鼠的肝脏中，被人肝细胞取代的比例(推测取代指数(ri))、即人肝细胞数与血清中的人白蛋白浓度高度相关。人肝细胞移植5周之前，若比较tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠与tk
‑
nog小鼠的血中人白蛋白浓度，则tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠始终显著较高，特别是人肝细胞移植3周后血中人白蛋白浓度达到tk
‑
nog小鼠的3倍。然后，4周、5周时，tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠仍然显示出与tk
‑
nog小鼠相比显著较高的血中人白蛋白浓度。
[0226]
药物代谢实验的用途中通常使用推测取代指数为70％以上的具有人肝细胞的小鼠。针对移植有人肝细胞的小鼠的每个个体将血中人白蛋白浓度示于图7。移植有人肝细胞的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中，移植4周后大部分小鼠(6只中5只,83.3％)的取代指数超过70％，而具有人肝细胞的小鼠(tk
‑
nog小鼠)中，没有一只取代指数超过70％(4只中0只,0.0％)。移植后5周时，tk
‑
nog小鼠中，3只中仍然没有一只(0.0％)的取代指数超过70％，而tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中，3只小鼠(100％)的取代指数全部超过70％。由此表明，tk
‑
nog
‑
il
‑
6中，移植后的人肝细胞的增殖较快，并且，tk
‑
nog小鼠中，使存活性差的细胞高效存活，从而预测可以使用广泛大量的细胞，并且，可以高效地获得取代指数为70％以上的具有人肝细胞的小鼠。
[0227]
下面，示出将人肝细胞移植2、3及4周后分别得到的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠的肝脏的组织学及免疫组化学结果。连续切片由h&e，及huma leukocyte antigen(hla)染色，并将其结果示于图8～13。图8示出lhum17003供体细胞移植2周后的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠与tk
‑
nog小鼠的染色结果，图9示出移植3周后的染色结果，图10示出移植4周后的染色结果。大部分人肝细胞在移植后2周在宿主肝组织中作为大型的增殖灶存在(图8)。移植3周，人肝细胞的增殖灶大型集合接合，从而占据宿主肝组织的一半以上(图9)。此外，移植4周后，根据血清中人白蛋白浓度所推测的人肝细胞的取代指数超过70％，实际上移植3周前可见的大型的增殖灶消失，宿主肝组织大部分被人肝细胞取代(图10)。图11示出hum4122b供体细胞移植2周后的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠与tk
‑
nog小鼠的染色结果，图12示出移植3周后的染色结果，图13示出移植4周后的染色结果。大部分人肝细胞在移植后2周在宿主肝组织中作为大型的增殖灶存在(图11)。移植3周时，人肝细胞的增殖灶大型集合接合，占据宿主肝组织的一半以上(图12)。此外，移植4周后，根据血清中人白蛋白浓度所推测的人肝细胞的取代指数超过70％，
实际上移植3周之前可见的大型的增殖灶消失，宿主肝组织大部分被人肝细胞取代(图13)。移植8周后的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠与tk
‑
nog小鼠的肝组织图像示于图14。tk
‑
nog小鼠的肝组织h&e染色时，人肝细胞无间隙地增殖，大量的人肝细胞中可见空泡，而tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠的肝组织h&e染色时，具有如下特征：肝小叶内可见索状结构，此外，被称为门管三联的小叶间动脈
‑
小叶间静脉
‑
小叶间胆管结构也示出非常接近人的结构。
[0228]
验证了高取代指数的具有人肝细胞的小鼠是否能够用作用于in vitro研究的肝细胞提供资源，其中，可以通过使用tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠在短时间内制作该小鼠。即，在人肝细胞快速增殖的移植后5周之前，通过两步胶原酶灌注法从3只tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中分离肝脏细胞。并将从人肝细胞移植后的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中分离精制肝脏细胞时的信息示于表1。所回收的肝脏细胞数为每只平均3.9
×
107个，平均成活率示出高达90.8％的值。虽然未实施人细胞的阳性选择或小鼠细胞的阴性选择，但相对于小鼠细胞混入率平均2.3％，人细胞率平均达94.4％，人细胞占据绝对优越的。接种于涂布有1型胶原蛋白的器皿，示出经过48小时后的肝脏细胞的形态(图5)。多边形的细胞以铺路石状形成为片材，另外，肝细胞中可见多个特别的双核细胞，显示出与一般的人肝细胞类似的形态。
[0229]
移植至1只的细胞数为0.1
×
107个，能够回收的细胞数达到约4
×
107个，由此表明，本发明是一项突破性技术，能够在仅仅5周内使绝对不能再试管内增殖的人肝细胞实际扩增40倍。目前，在无法定期获得的人临床材料中，不能按计划供应新鲜的人肝细胞，但通过将本发明所制作的动物作为用于in vitro研究的肝细胞提供资源，则可以按计划按需供应新鲜的人肝细胞。
[0230]
[表1]
[0231][0232]
此外，还追加病例对高取代指数的具有人肝细胞的小鼠是否能够用于用作in vitro研究的肝细胞提供资源进行了验证，其中，可以通过使用tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠在短时间内制作小鼠。即，在人肝细胞(biopredic公司：31岁男性lhum170003，5岁男性lhum170003，lonza公司：30岁女性hum4119f，0.9岁男性hum4282、12岁女性hum181001b)快速增殖的移植后5周之前，通过两步胶原酶灌注法从43只tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中分离肝脏细胞。并将从人肝细胞移植后的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中分离精制肝脏细胞时的信息(代表性的5例)示于表2。从43只所回收的肝脏细胞数为每只平均11.7
×
107个，平均成活率示出高达87.8％的值。虽然
未实施人细胞的阳性选择或小鼠细胞的阴性选择，但相对于小鼠细胞混入率平均2.9％，人细胞率达平均95.3％，人细胞占据绝对优势。
[0233]
移植至1只的细胞数为0.03
×
107个，能够回收的细胞数达约11.6
×
107个，由此表明，本发明是一项突破性的技术，能够在仅仅5周内使绝对不能在试管内增殖的人肝细胞实际扩增370倍。
[0234]
[表2]
[0235][0236]
向tkmut30
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠移植人肝细胞(lhum17003供体细胞)
[0237]
此外，还示出了通过使用将人单纯疱疹病毒1型
‑
胸苷激酶(hsv
‑
tk)基因的变异株
tk mutant30置于甲状腺素转运蛋白启动子控制下的tkmut30
‑
nog小鼠与人白介素6(human interleukin
‑
6)的双敲除转基因小鼠(tkmut
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠)，能够使移植至小鼠体内的人肝脏细胞显著增殖的实施例。
[0238]
作为人单纯疱疹病毒1型
‑
胸苷激酶基因变异株(hsv
‑
tk mutant30)表达单位(图2)，将包含通过小鼠甲状腺素转运蛋白基因启动子控制表达的hsv
‑
tkmutant30 cdna的dna片段显微注射于由雌性nod小鼠与雄性nog小鼠制作的受精卵，获得hsv
‑
tkmutant30转基因首建小鼠。通过使hsv
‑
tkmutant30转基因首建小鼠与nog小鼠交配，得到scid及il2rg
null
的变异体。所确定的小鼠的品系在公式中由nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg(ttr
‑
ul23(通称tk)mutant30)/shijic这一基因记号表示，其简称为tkmut30
‑
nog。在tkmut30
‑
nog小鼠与nog
‑
il
‑
6小鼠交配所生的幼仔中，具有human interleukin
‑
6转入基因及hsvtk mutant30转入基因两者的小鼠由nod.cg
‑
prkdc
scid
il2rg
tm1sug
tg((ttr
‑
ul23 mutant30),cmv
‑
il
‑
6)/shijic这一基因记号表示，将其简称为tkmut30
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠。
[0239]
肝脏损伤的诱发
[0240]
将溶解于蒸馏水的缬更昔洛韦(valgcv)(valganciclovir hydrochloride，盐酸缬更昔洛韦；sigma
‑
ardrich,merck)以0.05～0.5mg/ml的浓度添加在饮水中，用时24～72小时通过自由饮水口服给药。另外，用更昔洛韦(gcv)钠(denosine
‑
iv；mitsubishi tanabe pharma)代替valgcv单回或者每隔1天共2次给药于小鼠腹腔内。通过生化血清检查值及病理学分析调查肝损伤的程度。gcv或者valgcv给药1周后进行肝素采血，分离血浆后，通过fuji dri
‑
chem7000(fujifilm)进行临床化学分析(丙氨酸氨基转移酶；alt)。
[0241]
人肝细胞的移植
[0242]
使用市售的冷冻人肝细胞(biopredic公司：31岁男性lhum170003)作为供体细胞。通过以下的方法移植至tkmut30
‑
nog
‑
il
‑
6及tkmut30
‑
nog。将valgcv溶液(0.4mg/ml)作为饮水用时72小时给与6～8周龄的成年tkmut30
‑
nog
‑
il
‑
6及tkmut30
‑
nog受体小鼠，给药开始1周后采血并测定血浆alt值。将血浆alt值显示为600u/l以上的个体作为人肝细胞移植的受体。通过台盼蓝排除法并使用血细胞比容仪算出人肝细胞数及其成活率。使用用于胰岛素皮下给药的带有29号针头的注射管(myjector)将悬浮于40μl的william's medium e培养基中的约1
×
106的活肝细胞给药于脾脏内。
[0243]
人白蛋白测定
[0244]
人肝细胞移植1周后起每周适当地使用聚乙烯管从眼底静脉丛采集少量的血液。用包含1％牛血清白蛋白/0.05％tween20的tbs(tris缓冲盐水)稀释至5,000～250,000倍，使用人白蛋白elisa定量试剂盒(bethyl laboratories)测定人白蛋白浓度。阈值浓度为0.016mg/ml。
[0245]
人肝细胞移植4周后，通过elisa法测定tkmut30
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠的血清中的人白蛋白。另外，人肝细胞移植4.7周后，通过elisa法测定tkmut30
‑
nog小鼠的血清中的人白蛋白。将结果示于图15。专利第5073836号公报指明，在移植有人肝细胞的tk
‑
nog小鼠的肝脏中，被人肝细胞取代的比例(推测取代指数(ri))、即人肝细胞数与血清中的人白蛋白浓度高度相关，一般认为，tkmut30
‑
nog小鼠中人肝细胞数与血清中的人白蛋白浓度高度相关。在人肝细胞移植5周之前的时刻，比较tkmut30
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠与tkmut
‑
nog小鼠的血中人白蛋白浓度时，由于实施数量较少，故而不能进行显著差检验，但在tkmut30
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中示出
与tk
‑
nog
‑
il
‑
6一样高的存活性，达到tkmut30
‑
nog小鼠的5倍。
[0246]
药物代谢实验的用途中通常使用推测取代指数为70％(图16,70％chimeric)以上的具有人肝细胞的小鼠。针对移植有人肝细胞的小鼠的每个个体将推测取代指数示于图16。移植有人肝细胞的tkmut30
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中，移植4.7周后移植的全部的小鼠(2只中2只,100％)的取代指数超过70％，而在不表达人il
‑
6的tkmut30
‑
nog小鼠中，不存在取代指数超过70％的小鼠(22只中0只,0.0％)。
[0247]
图17示出lhum17003供体细胞移植7周后的tkmut30
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠的染色结果。宿主肝组织大部分被人肝细胞取代(图17)。此外，h&e染色时，与tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠相同地，具有如下特征：肝小叶内可见索状结构，并且，被称为门管三联的小叶间动脈
‑
小叶间静脉
‑
小叶间胆管结构也示出非常接近人的结构。
[0248]
图18中示出从人肝细胞移植第二周起至移植5周后每周通过elisa法测定表达人il
‑
6的tkmut30
‑
nog小鼠(tkmut30
‑
nog
‑
il
‑
6)及tk
‑
nog小鼠(tk
‑
nog
‑
il
‑
6)血清中的人白蛋白而得到的结果。并显示，在作为人单纯疱疹病毒1型
‑
胸苷激酶基因采用人单纯疱疹病毒1型
‑
胸苷激酶基因变异株(hsv
‑
tk mutant30)，且，由小鼠甲状腺素转运蛋白基因启动子控制表达的小鼠中，也与tk
‑
nog小鼠相同地，通过人il
‑
6的存在而得到了相同的效果。需要说明的是，关于tkmut30
‑
nog小鼠，未获得经过2、3及4周时的数据。
[0249]
这种在短时间内被人肝细胞取代是体内存在人il
‑
6的小鼠特有的现象，不具有人il
‑
6tg的tk
‑
nog小鼠及tkmut30
‑
nog小鼠中未见这种现象。由此表明，人il
‑
6具有显著促进移植至体内的人肝细胞增殖的效果，能够用作在人以外的动物的体内使人肝细胞增殖的方法。这样制作的具有人肝细胞的动物除能够用于药剂代谢及肝脏研究之外，也能够用作用于使用人肝细胞进行in vitro研究的肝细胞提供资源。
[0250]
[实施例2]
[0251]
移植至tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠的人肝细胞的倍化时间的测定
[0252]
移植至小鼠的人肝细胞增殖后，肝脏达到一定大小时，停止增殖。细胞增殖停止之后，经过时间与增殖细胞数将不再相关，因此，需要在细胞停止增殖以前获得，最少的倍加时间即该细胞的最大增殖速度。因而，在人肝细胞移植后的不同经过天数时，通过上述方法从tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠、tk
‑
nog小鼠中分离肝细胞，并通过台盼蓝排除试验确定细胞数及成活率。再通过流式细胞分析确定hla阳性细胞率(人细胞率)。由以下的式子确定移植至小鼠的人肝细胞的倍加时间，由横轴上绘制细胞移植后经过的时间、纵轴上绘制倍加时间而得到的图来确定最少倍加时间。
[0253]
倍加时间(天)＝细胞移植后经过时间
÷
细胞分裂次数
[0254]
细胞移植后经过时间(天)＝肝细胞分离回收日
‑
肝细胞移植实施日
[0255]
细胞分裂次数(次)＝log(扩增率,2)
[0256]
扩增率(倍)＝(所回收的细胞数
×
hla阳性率)
÷
移植细胞数
[0257]
1.材料与方法
[0258]
(1)人肝细胞的分离精制
[0259]
通过两步胶原酶灌注法从人肝细胞移植第7天以后的tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠、tk
‑
nog小鼠中分离肝细胞。简而言之，将27g的翼状针插入下腔静脉，用粘结剂固定之后切断门静脉。接着，用37℃的1
×
肝脏灌注培养基(thermo fisher scientific公司制造)对肝脏灌注7分
钟(6ml/分)。接着，将灌注培养基更换为0.15％胶原酶培养基[360u/ml胶原酶iv型(clss4；worthington biochemical corporation，美国新泽西州莱克伍德)、140u/ml胶原酶iv型(c1889；sigma
‑
aldrich)/ml，0.6mg/ml的cacl2、10mm的hepes(ph7.4)、及10mg/ml的庆大霉素]，按照1.5ml/分灌注10分钟。摘取肝脏，移入包含含有1％胎牛血清(fbs；thermo fisher scientific)的50ml磷酸缓冲盐水(pbs)的培养皿中，稳定地摇动，使细胞从胶原酶消化后的肝脏中分散出来。用100μm尼龙过滤器过滤肝脏细胞，按照50
×
g、4℃离心4分钟。再用含有1％fbs的冰冷pbs 50ml将细胞清洗2次。通过台盼蓝排除试验确定所制备的肝脏细胞(hu
‑
liver细胞)的细胞数及成活率。在成活率低于70％的情况下，通过27％percoll(ge healthcare，buckinghamshire，uk)的密度梯度离心分离(60
×
g，7分钟)除去死细胞，用含有1％fbs的冰冷pbs 50ml在50
×
g下反复清洗3次，每次4分钟。清洗3次之后，使细胞悬浮于包含10％fbs、44mm nahco3、1mm丙酮酸钠、及两种抗生物质(50单位/ml青霉素g及50μg/ml链霉素；sigma
‑
aldrich)的杜氏改良eagle培养基(dmem；sigma
‑
aldrich))中。通过台盼蓝排除试验确定所制备的肝脏细胞(hu
‑
liver细胞)的细胞数及成活率。
[0260]
(2)流式细胞分析
[0261]
通过使用bd facscanto(bd biosciences)的流式细胞分析求得人白血球抗原(hla)表达人细胞与小鼠h 2kd表达小鼠细胞相对于分离精制后的hu
‑
liver细胞的总数的比率。简而言之，利用抗hla小鼠单克隆抗体(克隆g46
‑
2.6；bd biosciences)及抗小鼠h
‑
2kd小鼠单克隆抗体(克隆sf1
‑
1.1；bd biosciences)对细胞进行染色，同时，利用碘化丙啶(bd biosciences)评价细胞成活率。数据分析使用bd facsdiva软件程序(bd biosciences)及flowjo程序(tree star，san carlos，ca，usa)。
[0262]
2.结果
[0263]
图19a示出移植至tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠的人肝细胞的倍加时间的测定结果，图19b示出移植至tk
‑
nog小鼠的人肝细胞的倍加时间的测定结果。
[0264]
tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中的人肝细胞的最少倍加时间为2.4天，另一方面，tk
‑
nog小鼠中的人肝细胞的最少倍加时间为3.6天。由此判断，通过使用tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠使人肝细胞增殖快1.5倍。
[0265]
虽然本实施例中，使用免疫缺陷小鼠作为非人脊椎动物，但如果考虑人肝细胞的存活的机理，则预测即使在使用小鼠以外的免疫缺陷非人脊椎动物的情况下，也与使用小鼠是相同地能够起到人il
‑
6的效果。
[0266]
[实施例3]
[0267]
抗il
‑
6中和抗体对tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中的人肝细胞的增殖的影响
[0268]
如实施例1所示，在人以外的哺乳类中使人肝细胞增殖时，人il
‑
6有效地起作用，tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠中所移植的人肝细胞的增殖加快。
[0269]
有报告指出“抗细胞因子抗体通过在in vivo作为细胞因子的载体蛋白质其作用，并防止分解而长期起作用”(fd finkelman et al.,j immunol,1993aug 1,151(3),1993,pp.1235
‑
44:may lt.et al.,j immunol,1993sep 15,151(6),pp.3225
‑
36)，因此探讨了，通过向tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠移植人肝细胞之后给药对于人il
‑
6的中和抗体是否能够增强人il
‑
6的效果。
[0270]
1.材料与方法
[0271]
(1)肝脏损伤的诱发与人肝细胞的移植
[0272]
如实施例1所述，向tk
‑
nog
‑
il
‑
6小鼠给药更昔洛韦，给药1周后进行肝素采血，分离血浆后，通过fuji dri
‑
chem7000(fujifilm)进行临床化学分析(丙氨酸氨基转移酶；alt)
[0273]
使用市售的冷冻人肝细胞(lonza公司：11个月的例子hum4282)作为供体细胞。通过以下的方法将该供体细胞移植至tk
‑
nog
‑
il
‑
6。将valgcv溶液(0.27mg/ml)作为饮水用时72小时给与6～8周龄的成年tk
‑
nog
‑
il
‑
6受体小鼠，给药开始1周后采血并测定血浆alt值。将血浆alt值显示为300u/l以上的个体作为人肝细胞移植的受体。通过台盼蓝排除法并使用血细胞比容仪算得人肝细胞数及其成活率。使用用于胰岛素皮下给药的带有29号针头的注射管(myjector)将悬浮于40μl的william's medium e培养基中的约1
×
106个活肝细胞给药至脾脏内。
[0274]
(2)抗人il
‑
6抗体的给药组与非给药组的分组
[0275]
将人肝细胞移植前所测得的alt活性从较高的个体起进行排列，从而交互分组(每组4只雌性)，通过显著差检验(mann
‑
whitney test)确定2组间的alt活性平均值无差异。进一步确定该2组之间的抗体给药前的平均体重没有显著差异(mann
‑
whitney test)。任意选择的组作为抗体给药组。
[0276]
(3)抗人il
‑
6抗体的给药与采血时间表
[0277]
在人肝细胞移植1周后的周二，皮下给药抗人il
‑
6抗体(两种抗体等量混合：2μg sino biological、il6/il
‑
6neutralizing antibody、clone mhk23、及2μg invitrogen il
‑
6antibody、monoclonal,505e9a12a3)，每只4μg，每日一次，连续4天给药(周二、周三、周四、周五)，停药2天(周六、周日)后，按照相同用量连续5天(周一、周二、周三、周四、周五)皮下给药，并在停药2天(周六、周日)后，再按照相同用量连续5天(周一、周二、周三、周四、周五)皮下给药，停药2天(周六、周日)后，按照相同用量进行一次(周一)皮下给药(共计15次)。从移植2周后的周二起至移植第5周，每周二进行采血。
[0278]
(4)人白蛋白测定
[0279]
使用聚乙烯管从眼底静脉丛采集少量血液，并分离血浆。用包含1％牛血清白蛋白/0.05％tween20的tbs(tris
‑
buffered saline)将血浆稀释至5,000～250,000倍，使用人白蛋白elisa quantitation kit(bethyl laboratories)测定人白蛋白浓度。
[0280]
(5)胆碱酯酶活性测定
[0281]
使用聚乙烯管从眼底静脉丛采集少量血液，并分离血浆。通过fuji dri
‑
chem7000(fujifilm)对血浆进行临床化学分析(cholinesterase；che)。由于小鼠血浆中几乎没有胆碱酯酶活性，故而，所检测到的胆碱酯酶活性是由人肝细胞所产生分泌的，有报道称该酶活性与人白蛋白浓度高度相关，可以作为代替人白蛋白的人肝细胞存活标记(suemizu et al.2018,pest manage sci,74,1424
‑
1430)。
[0282]
2.结果
[0283]
图20a中示出血中人白蛋白浓度的测定结果，图20b示出胆碱酯酶活性的测定结果。
[0284]
如图20a所示，人抗il
‑
6抗体给药组中，从人肝细胞移植2周后起至5周后，人白蛋白量与抗体非给药组相比为较高值。其中，人肝细胞移植3周后、4周后，人白蛋白量为较高
值，具有统计学显著差。关于胆碱酯酶，如图20b所示，人抗il
‑
6抗体给药组中，在从人肝细胞移植2周后起至5周后的整个期间，其与抗体非给药组相比均为较高值，具有统计学显著差。由此判断，给药人抗il
‑
6抗体会促进人肝细胞移植后的存活及增殖。
[0285]
工业实用性
[0286]
本发明的非人脊椎动物为肝脏细胞被人肝脏细胞取代后的非人脊椎动物，是具有人的肝脏的结构或功能的非人动物。可以使用本发明的非人动物开发针对人的肝脏疾患的医药及回收人肝细胞。
[0287]
本说明书中所引用的全部刊物、专利及专利申请均直接通过引用并于本说明书。