生物活性物质及其制造方法，以及将其用作生物组织保护剂的用途

生物活性物质及其制造方法，以及将其用作生物组织保护剂的用途
1.本发明涉及一种从至少一种肉眼可见的食用菌中获得的生物活性物质，涉及一种制造生物活性物质的方法及其用作生物组织保护剂的用途。
2.生物组织是指生物体的包膜，它是生物体和外部环境之间的直接界面，因此必须保护其不受到任何外源性物质的攻击。
3.因此，提到生物物质，我们便可以想到植物组织，例如植物的地上部分、藤蔓、小麦、水果、西红柿、马铃薯等，以及人类或动物的皮肤。
4.植物组织容易受到病原体(例如病毒、细菌、真菌或昆虫)的攻击，并且可通过发育，特别是通过所谓的诱导剂/修复剂化合物的作用，对这些攻击做出反应，生理或代谢自然防御反应如下：
5.‑
通过刺激植物细胞壁的木质化来增强预先存在的细胞屏障；
6.‑
植物合成具有抗菌活性的化合物，例如植物抗毒素；
7.‑
合成可以攻击病原体壁的酶蛋白，例如几丁质酶或葡聚糖酶。
8.人或动物的皮肤是人与其环境之间的直接界面。因此，必须保护皮肤不受到外部攻击，但它也会遭受与此环境相关的损害。这种损害可能很严重，例如伤口或烧伤，但也可能是慢慢出现的“轻微”问题，例如皱纹。
9.皱纹出现的机制涉及内在和外在因素。在诱发皱纹形成的内在因素中，有几种机制：水分减少；iii型胶原蛋白的产生减少，而更坚硬的i型胶原蛋白占主导地位，越来越多；细胞更新减少50％；由于角质细胞向表皮表面迁移的能力下降，角质细胞变得稀少。
10.此外，身体有自己的防御系统来中和自由基的伤害，但随着年龄的增长，该系统的有效性会下降，我们对抗氧化剂的需求也会增加。
11.除了这种基因决定的衰老之外，还存在加速衰老的环境因素：气候和病理性攻击等。行为也会对皮肤的外观产生重大影响：吸烟、饮酒等。皮肤科医生估计，90％的皮肤老化是由于这些外因导致的。
12.一般来说，皮肤修复过程必须涉及几个因素，例如真皮和表皮细胞的增殖；细胞外基质的合成和/或重塑；和抵御自由基。
13.本发明人在寻找一种有利地为天然来源且易于制造的生物活性物质，其可以有效地保护任何生物组织，特别是在生物组织为植物组织的情况下起诱导剂/修复剂的作用，以及在生物组织为皮肤的情况下起到保护性化妆品成分的作用。
14.通过这项研究，他们从一种肉眼可见的食用菌中发现了一种生物物质，证明这种物质对所有这些生物组织都具有保护作用。
15.因此，本发明的主题首先是通过以下方式获得或能够通过以下方式获得的生物活性物质：
16.‑
在存在至少一种还原剂的情况下，使用至少一种碱的水溶液对磨成粉末的至少一种肉眼可见的食用菌进行碱提取，以获得具有液体部分和固体部分的混合物，所述液体部分含有可溶性提取物，所述固体部分由不溶性固体颗粒形成；
17.‑
过滤所得混合物以除去所述固体部分并可选地净化所述液体部分；
18.‑
使用至少一种阳离子交换树脂中和所述液体部分并且可选地过滤/净化如此中和的收缩液体部分以获得水相生物活性物质；以及
19.‑
处理所得水相，该处理选自在水中稀释、浓缩、脱水和冻干以获得生物活性物质，所述生物活性物质分别在稀释度更高的水中，在更浓缩的水溶液中，脱水成粉末或冻干。
20.提取的菇类可以选自以下组，组中包括：平菇、高大环柄菇和白蘑菇。
21.碱可以选自羟基化的碱，如氢氧化钠、氢氧化钾等；还原剂可选自碱金属硼氢化物，如硼氢化钠或硼氢化钾；阳离子交换树脂可选自具有磺酸基、磷基、羧甲基、羧基的树脂。
22.所述生物活性物质每100重量份包含以下干物质：
23.‑
30至75重量份的总糖，其中：
24.‑
9至25重量份的β
‑
葡聚糖；和
25.‑
0.8至2.4重量份的葡糖胺和/或乙酰化葡糖胺；
26.‑
7至36重量份的总肽/总蛋白质；
27.‑
其余为矿物质，
28.基于平均分子大小，80％至100％的有机化合物尤其具有20至45kda的质量。
29.本发明还涉及一种制造生物活性物质的方法，其特征在于它包括以下连续步骤：
30.(a)在存在至少一种还原剂的情况下，通过至少一种碱的水溶液对至少一种磨成粉末的肉眼可见的食用菌进行碱提取，以获得具有液体部分和固体部分的混合物，液体部分含有可溶性提取物，固体部分由不可溶性固体颗粒形成；
31.(b)过滤所得混合物以除去混合物中的固体部分，随后可选地进行净化；
32.(c)用至少一种阳离子交换树脂中和液体部分，任选随后过滤/净化如此中和的液体部分以获得水相中的生物活性物质；以及
33.(d)任选地，对所得水相进行进一步处理，该处理选自在水中稀释、浓缩、脱水和冻干以获得生物活性物质，这种生物活性物质，在稀释度更高的水中，在溶度更高的水溶液中，以粉末形式脱水或冻干。
34.步骤(b)中的操作可以去除大于1μm的固体颗粒。
35.步骤(c)中的任何过滤/净化旨在去除可能保留在水相中的任何阳离子交换树脂颗粒。
36.可以使用选自平菇、高大环柄菇和白蘑菇的蘑菇，蘑菇粉尤其占至少一种碱的水溶液的5
‑
15wt％。
37.在碱提取操作中，可以使用氢氧化钠或氢氧化钾作为碱，并使用碱性硼氢化物，例如硼氢化钠或硼氢化钾作为还原剂，还原剂的用量特别是至少一种碱的水溶液的0.05至1g/100ml；并且，在中和操作中，可以使用至少一种离子交换树脂，其选自具有磺酸基、磷基、羧甲基、羧基的树脂。
38.可以通过在至少一种还原剂的存在下，将至少一种碱的水溶液边搅拌边加热至25至100℃的温度至少2小时来进行碱提取。
39.本发明还涉及如上定义的或通过如上定义的方法制备的生物活性物质作为保护生物组织免受至少一种外源性物质攻击的试剂的用途。
40.生物组织可以是植物组织，外源性物质可以是病原真菌、细菌、病毒、昆虫和/或物理攻击剂，例如雨、霜、温度和环境压力，保护剂可以是所述植物组织的诱导剂/修复剂，特别是在农艺学上对观赏类植物有用的诱导剂/修复剂，特别用于预防性处理隐花病和细菌病害，尤其指选自果实贮藏病害，葡萄藤、果树、蔬菜作物和谷物的疾病。这些隐花病和细菌性疾病的例子有
41.‑
霜霉病(plasmopara viticola)；
42.‑
白粉病(erysiphe necator)；
43.‑
由黄单胞菌和丁香假单胞菌引起的疾病；
44.‑
火疫病(解淀粉欧文氏菌)；
45.‑
灰霉病(灰葡萄孢菌)；
46.‑
马铃薯晚疫病(马铃薯晚疫病菌)；
47.‑
黄锈病(壳针孢属，颖枯壳针孢)；
48.‑
小麦的赤霉病(禾谷镰刀菌)和苹果黑星病(苹果黑星菌)；
49.‑
苹果贮藏病害(扩展青霉)；
50.‑
念珠菌病(苹果褐腐病菌)；
51.‑
球孢子菌(neofabrea sp.、glomerella sp.、nectria sp.)。
52.本发明还涉及一种用于处理保护植物组织的组合物，其特征在于它由如上定义的或通过如上定义的方法制备的生物活性物质组成，这种生物活性物质在特别是为浓度8至140g/l的水性介质中获得，可选地稀释，可选地浓缩或脱水或冻干，可选地与至少一种相容的配制剂、抗植物病原体剂组合，其特别选自杀真菌剂、抗菌剂、抗病毒剂、杀虫剂和生物防治剂、植物营养素和水果/蔬菜涂层剂形成涂层蜡。
53.本发明还涉及一种处理保护植物组织的方法，其特征在于该方法包括当组合物在水相中时，特别是在被稀释50至400次后，用生物活性物质来施加如上定义的组合物，其中施加组合物的方式有如下几种：在植物生长早期阶段和/或成熟期和营养生长和生殖期，以重复间隔，特别是每隔2天至30天，将组合物喷涂在植物的地上部分，施加一次或多次，最多施加40次，或者将收获的产品，例如采摘的水果和蔬菜，浸泡在水相的所述组合物中，或者通过浇灌根，或者当它是涂层蜡的形式时，涂覆水果/蔬菜。
54.本发明还涉及一种用途，其特征在于生物组织是人或动物的皮肤，外源性物质是氧化剂、化学产品和/或物理攻击剂，保护剂是皮肤美容治疗的试剂，特别是治疗有待减少皱纹的老化皮肤或有待改善柔软度和弹性的年轻皮肤的试剂。
55.本发明还涉及一种用于人或动物皮肤保护性处理的组合物，其特征在于它由水介质或粉末形式的如上定义的或通过如上定义的方法制备的生物活性物质组成，生物活性物质和至少一种化学品佐剂组合，便于将其分布在皮肤上。
56.本发明还涉及一种用于保护人或动物皮肤的处理方法，其特征在于它包括通过将如上定义的组合物，特别是霜剂或溶液的形式的组合物，散布或喷洒在待处理的皮肤区域上，以获得保护皮肤的效果，其中每次涂抹的生物活性物质的比例尤其为每100g组合物0.005g
‑
100g。
57.本发明的生物物质通过增加成纤维细胞的增殖和促进基质成分的合成来促进皮肤代谢。这种对细胞外基质的活动促进了皮肤的弹性和胶原蛋白的产生。这个动作有助于
抚平皮肤的上小突起，同时减少皱纹。
58.这种小突起的减少，连同刺激细胞外基质合成的活性，有助于获得用本发明的生物物质观察到的张量效应。
59.此外，本发明的生物物质由于其抗氧化活性而具有保护活性。它可以恢复部分抗氧化资本，从而限制自由基造成的损害。
60.由于其在细胞增殖、细胞外基质合成和抗自由基方面的特性，本发明的生物物质因此有助于加速该组织修复过程。
61.以下实施例说明本发明，但不限制其范围。在这些实施例中，除非另有说明，否则百分比均按重量计。
62.实施例1:冻干形式的平菇提取物的制备
63.原料为三月采收的整株平菇。在0.5％(w/v)硼氢化钠存在下，将200g干燥和压碎的平菇(<10mm)分散在2l 2％的氢氧化钠中。在机械搅拌下，在50℃下进行萃取8小时。
64.不溶于naoh/nabh4的部分通过200μm过滤去除。获得的滤液随后通过连续深度过滤至1μm进行净化。
65.通过与阳离子交换树脂(purolite c150h)接触来中和由此获得的净化提取物。
66.中和的提取物通过1μm过滤净化。
67.由此获得净化的液体提取物，其在冻干后可以回收53g构成提取物的米色粉末。
68.所得提取物的组成报告于下表1中
69.表1
70.提取物中的主要化合物百分比百分比(％w/w)总糖(7)45,0其中中性糖(1)29,2其中β
‑
葡聚糖(2)13,6其中葡萄糖胺(3)2,1总蛋白(4)30,1其中蛋白质>3000da(5)7,8矿物质(6)24,9mn(kda)(8)提取物中有机化合物大于95％部分，25kda<<35kda
71.(1)根据dubois等人(dubois,gille,hamilton,rebers,smith,用于测定糖类和相关物质的比色法,analytical chemistry 28,350
‑
356)(1956))，通过苯酚
‑
硫酸法测定中性糖的量。
72.(2)通过分析试剂盒(k
‑
ybgl 09/14，megazyme)测定β
‑
葡聚糖。
73.(3)根据smith等人(smith&gilkerson:quantitation of glycosaminoglycan hexosamine using 3
‑
methyl
‑2‑
benzothiazolone hydrazone hydrochloride,analytical biochemistry 98,478
‑
480(1979))，通过mbth测定法进行葡糖胺的定量。
74.(4)总蛋白量用凯氏定氮法评估，所得值乘以6.25。
75.(5)大于3000da的蛋白质通过bradford方法测定(bradford，a rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein
‑
dye binding，analytical biochemistry 72,
248
‑
254(1976))。
76.(6)在650℃下煅烧后对矿物质进行定量。
77.(7)总糖量按矿物质和总蛋白质的差值计算。
78.(8)平均分子大小通过空间排阻色谱分析结合光散射和粘度测定法确定。
79.实施例2：水相平菇提取物的制备
80.原料为五月采收的整株平菇。在0.5％(w/v)硼氢化钠存在下，将200g干燥和压碎的平菇(<10mm)分散在2l 2％氢氧化钠中。在机械搅拌下，在50℃下进行萃取8小时。
81.不溶于naoh/nabh4的部分通过200μm过滤去除。获得的滤液随后通过连续深度过滤至1μm进行净化。
82.通过与阳离子交换树脂(purolite c150h)接触来中和由此获得的净化提取物。中和的提取物通过1μm过滤净化。获得含有34.7g/l构成提取物的干物质的净化液体提取物。
83.所得提取物的组合物报告于下表2中。组合物结果是用相同原材料制作的2次重复的平均值。
84.表2
[0085][0086][0087]
实施例3：用实施例1的提取物刺激西红柿的天然防御能力
[0088]
在植物上测试根据实施例1的平菇提取物以评估在用平菇提取物进行预防性处理后在病原体侵袭的情况下植物防御的诱导情况。
[0089]
所使用的模型是通过在园艺盆栽土里种上幼苗，在温室里长大的番茄植物模型。治疗时植物已有1个月大。
[0090]
它们首先经过预处理，包括对待测产品进行3次叶面喷洒。每隔天喷洒一次，直到径流。然后，在第一次喷洒后7天，以每毫升0.05％吐温80溶液100,000个分生孢子的比率，以灰葡萄孢菌孢子悬浮液的叶浸润形式接种病原体。这是由西部列塔尼学校提供的灰葡萄孢菌菌株(参考ubocc
‑
a
‑
101100)。
[0091]
又过了7天，收获植物，将植物在液氮中进行冷冻并在分析前储存在
‑
20℃的温度下。
[0092]
根据j.s.j.s.shindler,r.e.childs和w.g.bardsley.peroxidase，human cervical mucus:the isolation and characterization.eur.j.biochem.65,325
‑
331(1976)中所述的方案来评估过氧化物酶活性。过氧化物酶参与氧化应激的调节，被归类为pr蛋白(病理相关蛋白)。
[0093]
两种产品应用于植物，即：
[0094]
‑
fb：对应于本领域技术人员已知的溶液的制剂空白，例如由与防腐剂相关的表面
活性剂组成的组合物，其在蒸馏水中制备；
[0095]
‑
根据实施例1获得的平菇提取物(35g干物质/l)，其稀释在fb中。
[0096]
下面的表3示出了按照以下两种方式中的其中一种方式量化预处理的番茄植物中的过氧化物酶活性：
[0097]
‑
按制剂空白量化；
[0098]
‑
或按照平菇提取物(实施例1)量化。
[0099]
活性表示为对照组(fb制剂空白)测得的活性的百分比。星星对应于在1％水平上明显不同的结果(克鲁斯卡尔
‑
沃利斯检验，平均值，n＝27)。结果是3次独立实验的平均值。
[0100]
表3
[0101]
番茄的天然防御刺激活动过氧化物酶(％活性)制剂空白100制得的平菇提取物161,9**
[0102]
表3中显示的结果证明，与对照组相比，平菇提取物对过氧化物酶标记物的影响为+61.9％。
[0103]
因此，提前用平菇提取物进行预处理的植物刺激了防御能力，使它们能够更好地抵抗病原体的攻击。
[0104]
实施例4：来自实施例2的平菇提取物在田间试验中减轻葡萄藤上的霜霉病(霜霉病菌)症状的功效
[0105]
2018年期间在法国西南部就梅洛葡萄品种(vitis vinifera)的葡萄树进行了田间试验，以确定单实施例2中的平菇提取物这一种物质或其结合使用波尔多混合液bbrsr dispers nc(upl europe ltd；750g cu/ha)，在防治霜霉病(霜霉病菌)方面的功效。在试验小区上，每个处理条件有4个微小区统计分布。
[0106]
根据叶面积的增加，处理在26/04/18和14/06/18之间进行，喷洒量范围为200l/ha至300l/ha。未经处理的对照组上喷的是水；波尔多混合液处理包括从开花期开始施用等效剂量的750g/cu/ha(下表4)。根据实施例2获得的平菇提取物作为用表面活性剂和防腐剂配制的水溶液施用，提取物以35g/ha的剂量单独使用或与波尔多混合物液一起使用。还测试了单独的波尔多混合液的部分对照，以了解平菇提取物在此类项目中的作用。
[0107]
下面的表4显示了不同方式的处理计划表。
[0108]
表4
[0109][0110]
bbrsr：波尔多混合液
[0111]
ome平菇提取物；
[0112]
‑
水处理
[0113]
附图中的[图1]显示了用平菇提取物处理(或未用平菇提取物处理)以及波尔多混合液(平菇提取物/bbrsr)处理后遭受霜霉病侵袭的葡萄藤的病害强度(％)。图1中显示的评级是在6月13日在bbch 71上进行的。根据受到疾病侵袭的葡萄藤束的表面来估计侵袭的强度。
[0114]
与用水处理的对照组相比，单独的平菇提取物(ome)可使霉菌侵袭的症状减少约78％。在使用波尔多混合液的程序中，与单独使用波尔多混合液的部分对照组相比，平菇提取物的有效性为68％。该ome/bbrsr程序在减少葡萄霉病引起的症状方面的效率为78％。
[0115]
实施例5：来自实施例2的平菇提取物在田间试验中减轻葡萄藤上霜霉病(霜霉病菌)症状的功效
[0116]
2018年期间在法国西北部就香瓜葡萄品种(vitis vinifera)的葡萄树进行了田间试验，以确定单实施例2中的平菇提取物这一种物质或其结合使用化学覆盖程序(以下处理的表5)，在防治霜霉病(霜霉病菌)方面的功效。在试验小区上，每个处理条件有4个微小区统计分布。
[0117]
根据叶面积的增加，处理在26/04/18和27/07/18之间进行，喷撒量在130l/ha到200l/ha之间。没有对未经处理的对照组进行喷洒；化学覆盖处理包括施用bbch 14阶段的3种常规产品(下表5)。将根据实施例2获得的平菇提取物作为用表面活性剂和防腐剂配制的水溶液施用，提取物以35g/ha的剂量单独使用或与常规产品一起使用，并与完整的常规程序进行比较。
[0118]
表5显示了不同方式的处理计划表。
[0119]
表5
[0120][0121][0122]
ome:平菇提取物(35g/l)；
[0123]
lbg01f34：磷酸钾(730g/l)；
[0124]
代森联df：代森联(700g/kg)；
[0125]
mikal flash：乙膦酸/灭菌丹(500/250g/kg)；
[0126]
dithane neotec:代森猛锌
[0127]
附图中的[图2]显示了用平菇提取物处理(或未用平菇提取物处理)以及波尔多混
合液(平菇提取物/conv)处理后遭受霜霉病侵袭的葡萄藤的病害强度(％)。图2中显示的评级是在2018年7月24日在bbch 79阶段上进行的。根据受到疾病侵袭的葡萄藤束的表面来估计侵袭的强度。
[0128]
与未经处理的对照组相比，单独的平菇提取物(ome)可使霉菌侵袭的症状减少约48％。在开花前，施用3次配制的平菇提取物，而不是施用2次2中化学物质(lbg 01f34和代森联df)，所提供的保护水平在统计上而言与总的常规覆盖相当(conventional)。这个ome/conv程序在减轻葡萄藤霉病引起的症状方面有84％的效率。
[0129]
实施例6：来自实施例2的平菇提取物在田间试验中对减少小麦中脓毒症(septoriatritici)症状的功效
[0130]
2018年期间在法国西北部就advisor品种的普通小麦(triticum aestivum)进行了田间试验，以确定单实施例2中的平菇提取物这一种物质或其结合使用化学覆盖程序(参见处理的表6)，在保护软质小麦出现脓毒病方面的功效。在试验小区上，每个处理条件有5个微小区统计分布。
[0131]
处理在22/03/18和03/05/18之间进行，喷撒量为200l/ha。未经处理的对照组用水喷洒；化学覆盖处理包括施用bbch 29阶段的2种常规产品(表6)。将根据实施例2中获得的平菇提取物作为用表面活性剂和防腐剂配制的水溶液施用，提取物以35g/ha的剂量单独使用或与常规产品一起使用，并与完整的常规程序进行比较。
[0132]
表6显示了不同方式的处理计划表。
[0133]
表6
[0134][0135]
ome：配置的平菇提取物(35g/l)
[0136]
cherokee：丙环唑/环丙唑/百菌清(62,5/50/375g/l)；
[0137]
adexar:氟环唑/氟唑菌酰胺(62.5/62.5g/l)；
[0138]
‑
水处理。
[0139]
附图中的[图3]显示了在用平菇提取物处理(或未用平菇提取物处理)，以及在在常规覆盖(ome/conv)程序处理后，软质小麦的f1叶片上的病害强度(％)。图3中显示的评级是在2018年6月18日在bbch 75阶段上进行的。根据受病害侵袭的叶子表面来估计侵袭强度。
[0140]
因此，与用水处理的对照组相比，单独的评估提取物(ome)可使脓毒症症状减少约50％。用施用2次配制的平菇提取物代替施用一次(cherokee)所提供的保护水平在统计上而言与总的常规覆盖相当(conventional)。这个ome/conv程序在减轻小麦菌斑病引起的症状方面有95.5％的功效。
[0141]
实施例7：来自实施例1和2的提取物的抗氧化活性
[0142]
原则：
[0143]
通过orac(氧自由基抗氧化能力)方法来评估抗氧化活性。该方法包括测量给定分子防止荧光素(cas 518
‑
47
‑
8)被稳定自由基aaph(2,2'
‑
偶氮双(2
‑
脒基
‑
丙烷)二盐酸盐)(cas 2997)氧化的保护作用
‑
92
‑
4)。
[0144]
下表7中报告的结果与参考抗氧化剂trolox(cas 53188
‑
07
‑
1)提供的保护有关。
[0145]
标准范围：0.002m trolox储备溶液(50ml磷酸盐缓冲液中为25mg)。
[0146]
样品稀释：在ph 7.4的磷酸盐缓冲液中进行。
[0147]
表7
[0148][0149]
可以看出，通过制得根据本发明的提取物使得可以获得抗氧化活性。
[0150]
实施例8：评价实施例1的提取物对成纤维细胞增殖的影响
[0151]
目的是评估根据实施例1获得的平菇提取物对皮肤组织修复的影响。通过与未经处理的对照组进行比较来进行该评估。
[0152]
在dmem glutamax培养基中稀释实施例1中获得的干平菇提取物以获得1mg/ml储备处理溶液，然后将储备处理溶液以0.2μm过滤以去除任何微生物污染。
[0153]
操作协议如下：
[0154]
44岁人类皮肤成纤维细胞(paf 08052)的原代培养物以每孔10,000个细胞接种在48孔微孔板中，培养基体积(dmem glutamax)为500μl。细胞粘附在孔的底部24小时。然后将培养基替换为根据实施例1获得的提取物，在培养基中稀释提取物，然后过滤提取物，并进行未经处理的对照组(dmem glutamax)试验。将在每孔500μl下测试多个浓度，并在37℃下在含有5％co2(体积)的气氛中孵育48小时。然后用胰蛋白酶分离细胞并在malassez载玻片上对细胞进行计数。重复分析了6次。
[0155]
下表8中显示的结果表示为与未经处理对照组相比的增殖百分比。通过wilcoxon
‑
mann
‑
withney检验对结果进行统计分析以确定值的显著性。显著性星号表示显著性程度，即*p<0.05；***p<0.001。
[0156]
表8
[0157]
提取物浓度增殖百分比未经处理的对照组100,050μg/ml133,5***200μg/ml127,5*250μg/ml161,9***450μg/ml125,0*
650μg/ml133,3*750μg/ml133,3*900μg/ml137,5*
[0158]
发现根据实施例1获得的提取物与未经处理的对照组相比显著促进了成纤维细胞增殖，因此在250μg/ml时具有更好活性的组织修复。
[0159]
实施例9:评价来自实施例1的提取物对角质细胞增殖的影响
[0160]
目的是评估根据实施例1获得的平菇提取物对表皮修复的影响。通过与未经处理的对照组进行比较来进行该评估。
[0161]
在kgm gold培养基中稀释实施例1中获得的干平菇提取物以获得1mg/ml储备处理溶液，然后将储备处理溶液以0.2μm过滤以去除任何微生物污染。
[0162]
操作协议如下：
[0163]
将43岁人类皮肤角质细胞(nhek 33228)的原代培养物以每孔10,000个细胞接种在48孔微孔板中，500μl kgm gold培养基体积为500μl。细胞粘附在孔的底部48小时。然后用在培养基中稀释并过滤的根据实施例1获得的提取物替换培养基；此外，将进行未经处理(仅培养基)的对照试验。将在每孔500μl的速率下测试多个浓度，并在37℃下在富含5％co2(体积)的气氛中培养48小时。测试一式三份进行。然后用胰蛋白酶
‑
edta分离细胞并在malassez载玻片上对细胞进行计数。
[0164]
下表9中显示的结果表示为与未经处理对照组相比的百分比。通过wilcoxon
‑
mann
‑
withney检验对结果进行统计分析以确定值的显著性。显著性星号表示显著性程度，即*p<0.05；**p<0.01。
[0165]
表9
[0166]
提取物浓度增殖百分比未经对照的控制组100,050μg/ml90,0100μg/ml140,0*300μg/ml150,0**750μg/ml160,0*
[0167]
发现根据实施例1获得的提取物与未经处理的对照组相比，从100μg/ml开始显著促进了角质细胞增殖，因此在750μg/ml时具有更好活性的组织修复。
[0168]
实施例10：专利wo 2018/069497和实施例1提取物处理后番茄过氧化物酶活性比较
[0169]
该研究表明，在灰葡萄孢菌存在下，不同平菇提取物对番茄防御能力的刺激作用：
[0170]
‑
第一种提取物(提取物b1)对应于根据专利wo 2018/069497从平菇中获得的提取物。
[0171]
‑
第二种提取物(提取物b2)根据实施例1中描述的方法从平菇中获得。
[0172]
‑
在同一试验中测试两种提取物，其与单独的辅助制剂(制剂空白)和仅含有蒸馏水(dw)的对照组进行比较。
[0173]
‑
所使用的模型是通过在园艺盆栽土里种上幼苗，在温室里长大的marmande番茄植物模型。处理时植物已有1个月大。
[0174]
在t＝0时，通过叶面喷洒试验产品处理植物(喷洒1次至流出水溶液)。在t＝2天和t＝5天重复该操作。对照试验是用制剂空白或蒸馏水处理。
[0175]
在第一次施用后的t＝7天，以每毫升0.05％tween 80溶液100,000个分生孢子的比率，以灰葡萄孢菌孢子悬浮液的叶浸润形式接种病原体。这是由西部列塔尼学校提供的灰葡萄孢菌菌株(参考ubocc
‑
a
‑
101100)。
[0176]
在t＝14天时，通过从每株植物中取出叶盘来收获与接种叶不同的经处理叶，将叶盘冷冻在液氮中并在分析前储存在
‑
20℃的温度下。
[0177]
根据j.s.shindler,r.e.childs和w.g.bardsley.peroxidase，human cervical mucus:the isolation and characterization.eur.j.biochem.65,325
‑
331(1976)中所述的方案来评估过氧化物酶活性。过氧化物酶参与氧化应激的调节，被归类为pr蛋白(病理相关蛋白)。
[0178]
比酶活性表示为对照组(蒸馏水dw)测得的活性的百分比。
[0179]
表10显示了从用3次喷雾处理的番茄植物中提取的过氧化物酶活性：
[0180]
平菇提取物1(35克干物质/升)，在fb中稀释，
[0181]
平菇提取物2(35克干物质/升)，在fb中稀释，
[0182]
蒸馏水(对照组)
[0183]
制剂空白
[0184]
然后接种灰葡萄孢。
[0185]
处理过氧化物酶(％of dw对照组)蒸馏水100
±
22,76制剂空白118
±
21,02平菇提取物1132
±
25,90平菇提取物2195
±
25,07
[0186]
在这些处理条件下，用制剂空白处理没有诱导番茄植物中过氧化物酶活性的显著增加。用平菇提取物1处理得到的结果也是如此，尽管平均活性高于对照组和制剂空白。另一方面，在用平菇提取物2预处理番茄植物后，观察到过氧化物酶活性得到了强烈刺激；根据kruskal wallis统计检验，以及与提取物1的处理相比，活性与对照组(x 1.48)相比增加(x 1.9)。