本发明属于生物技术领域，具体涉及一种野生棱柄马鞍菌的人工栽培方法。
背景技术：
马鞍菌（helvella）属子囊菌亚门（ascomyzcotina）、盘菌纲（discomycetes）、盘菌目（pezizales）、马鞍菌科（helvllaceae）。一般呈散生或群生状，多见于夏、秋季的林地上。马鞍菌子实体菌盖形如马鞍，表面平滑或卷曲，边缘与柄分离，颜色呈蛋壳色至近黑色。菌柄呈圆柱状，长4–9cm，粗0.6–0.8cm，颜色呈蛋壳色至灰色。菌肉柔软、味道鲜美，富含多糖、必需氨基酸、不饱和脂肪酸（十八烯酸、亚油酸、亚麻酸等）、膳食纤维、锌等多种营养成分，不仅是纯天然的绿色食品，同时还是珍稀名贵的野生食用菌。马鞍菌野生资源分布于欧洲、北美洲和亚洲等地区。我国曹晋忠先生上个世纪70年代曾在山西省发现野生马鞍菌，可惜未保留活体。随着人们对野生马鞍菌研究的不断深入，许多学者将研究范围从针对马鞍菌单一菌种的种质资源的研究扩大到对整个属的研究。通过rdna序列lsu对马鞍菌属基因进行分析，确定其系统分类学地位，对马鞍菌属现有种类进行了形态学描述和比对分析。棱柄马鞍菌营养丰富，口感较好，深受当地人们青睐。
由于马鞍菌非常稀有，同时受限于地理环境、气候因素、极短的采收期、产量低、较难采集以及孢子弹射方式特别，不好收集等条件，目前关于马鞍菌的研究主要集中在子实体的营养价值、次生代谢产物的抗氧化、抗肿瘤、清除自由基等方面。有关马鞍菌人工驯化栽培的研究不多。2001年，何培新等对皱马鞍菌（helvellacrisper）的母种、原种和栽培种在不同碳源、氮源、温度和酸碱度的培养基中的生长情况进行了研究，其结果为：该菌种菌丝体生长的最适氮源为蛋白栋；最适碳源为d-果糖；菌丝体生长温度范围为5–38℃，最适为25℃；ph为3–10，最适ph为7–8；基物为麦粒、棉籽壳、木屑等。2007年，王俊明等对其进行液体发酵培养，研究结果发现最适培养条件为：小麦粉20g/l、硫酸氨2g/l、mgso40.5g/l、kh2po40.46g/l、k2hpo41g/l，最适ph5.5–6.5，装液量300–400ml/l，接种量5ml培养菌液，温度26–28℃；摇床转速100r/min，培养时间7d。但其子实体人工栽培的研究未见报道。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种野生棱柄马鞍菌的人工栽培方法，本发明从菌种分离到人工驯化生产出子实体，研发出配套的野生棱柄马鞍菌的栽培技术，通过人工栽培手段获得了野生棱柄马鞍菌的子实体。
本发明是通过如下技术方案实现的。
一种野生棱柄马鞍菌的人工栽培方法，包括如下步骤:
（1）菌种分离选取成熟、子实体肉质较厚、无病虫害的新鲜棱柄马鞍菌子实体，除去基部土壤，无菌水冲洗3-4次，75%酒精浸泡15s，重复3次，吸水纸轻轻吸取残留液体，置于超净工作台，在菌盖和菌柄交界处用无菌解剖器切取直径3-5mm的小块，置于松针琼脂培养基，25℃培养7天，选择无污染、生长旺盛、粗壮、颜色洁白的菌丝为母种。
（2）制备液体菌种在（1）制备的固体母种中用无菌打孔器挑取直径3-5mm、5块母种，接种至含有液体培养基的三角瓶中，25℃，135r/min，暗培养3d，待颗粒菌球出现，制成液体菌种。
（3）人工栽培
室温下，用（2）制备的液体菌种向栽培袋接种，每栽培袋接种10ml，然后将栽培袋置于25℃环境下避光培养，观察菌丝生长情况，菌丝长满后，继续培养一周，然后转入出菇房，横排摆放，菌袋开口，表面覆盖2cm厚的松树下腐殖土，出菇期间环境条件：温度25–30℃，昼夜温差10–12℃，湿度60%–80%，待子实体成熟，没有“孢子云”形成之前就进行采摘，采摘后要迅速将子实体根部带培养料部分进行消除。
所述的松针琼脂培养基的配方及制作方法称取棱柄马鞍菌子实体5g、马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g、松针30g，鱼蛋白胨2g；将棱柄马鞍菌子实体和马铃薯切块、松针切成1cm小段，加蒸馏水l000ml煮沸10–15min，6层纱布过滤，然后在滤液中加入上述葡萄糖及琼脂，搅拌融化，定容至l000ml。
所述液体培养基的配方是：棱柄马鞍菌子实体5g、马铃薯200g、松针200g、葡萄糖20g、鱼蛋白胨1.5g、kh2po41g、nahco31g、mgso40.5g、维生素b10.01g，自来水1000ml，自然ph，培养基灭菌条件：121℃，灭菌25min。
所述人工栽培料配方及制作方法人工栽培料配方由如下原料的重量份组成，松木屑28-40份、棉籽壳50-62份、麸皮6-8份、葡萄糖1-2份、石膏1-2份，ph6–7；将松木屑粉碎成直径1cm的小碎块，与棉籽壳一起在水中浸泡20-24h，沥干水分，加入麸皮、葡萄糖、石膏和水，搅拌均匀，然后装入栽培袋中，每袋装料400-500g，栽培袋于121℃灭菌2h。
本发明的栽培方法能够将野生棱柄马鞍菌通过人工驯化，培养出野生棱柄马鞍菌子实体。
实施例1
2017年3月份，在山西省农业科学院食用菌研究所进行人工栽培，方法如下：
（1）菌种分离选取成熟、子实体肉质较厚、无病虫害的新鲜棱柄马鞍菌子实体，用毛刷轻轻除去基部土壤，无菌水冲洗3次，75%酒精浸泡15s，重复3次，吸水纸轻轻吸取残留液体，置于超净工作台，在菌盖和菌柄交界处用无菌解剖器切取直径5mm的小块，置于松针琼脂培养基，25℃培养7天，选择无污染、生长旺盛、粗壮、颜色洁白的菌丝为母种。所述的松针琼脂培养基的配方及制作方法称取棱柄马鞍菌子实体5g、马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g、松针30g，鱼蛋白胨2g；将棱柄马鞍菌子实体和马铃薯切块、松针切成1cm小段，加蒸馏水l000ml煮沸10–15min，6层纱布过滤，然后在滤液中加入上述葡萄糖及琼脂，搅拌融化，定容至l000ml，ph自然。
（2）制备液体菌种在（1）制备的固体母种中用无菌打孔器挑取直径5mm、5块母种，接种至含有液体培养基的250ml三角瓶中，25℃，135r/min，暗培养3d，待颗粒菌球出现，制成液体菌种。所述液体培养基的配方是：棱柄马鞍菌子实体5g、马铃薯200g、松针200g、葡萄糖20g、鱼蛋白胨1.5g、kh2po41g、nahco31g、mgso40.5g、维生素b10.01g，自来水1000ml，自然ph，培养基灭菌条件：121℃，灭菌25min。
（3）人工栽培室温下，用（2）制备的液体菌种向栽培袋接种，每栽培袋接种10ml，然后将栽培袋置于25℃环境下避光培养，观察菌丝生长情况，菌丝长满后，继续培养一周，然后转入出菇房，横排摆放，菌袋开口，表面覆盖2cm厚的松树下腐殖土，出菇期间环境条件：温度25–30℃，昼夜温差10–12℃，湿度60%–80%，待子实体成熟，没有“孢子云”形成之前就进行采摘，采摘后要迅速将子实体根部带培养料部分进行消除。
所述的松针琼脂培养基的配方及制作方法称取棱柄马鞍菌子实体5g、马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g、松针30g，鱼蛋白胨2g；将棱柄马鞍菌子实体和马铃薯切块、松针切成1cm小段，加蒸馏水l000ml煮沸10–15min，6层纱布过滤，然后在滤液中加入上述葡萄糖及琼脂，搅拌融化，定容至l000ml。
所述液体培养基的配方是：棱柄马鞍菌子实体5g、马铃薯200g、松针200g、葡萄糖20g、鱼蛋白胨1.5g、kh2po41g、nahco31g、mgso40.5g、维生素b10.01g，自来水1000ml，自然ph，培养基灭菌条件：121℃，灭菌25min。
所述人工栽培料配方及制作方法人工栽培料配方由如下原料的重量份组成，松木屑28-40份、棉籽壳50-62份、麸皮6-8份、葡萄糖1-2份、石膏1-2份，ph6–7；将松木屑粉碎成直径1cm的小碎块，与棉籽壳一起在水中浸泡20-24h，沥干水分，加入麸皮、葡萄糖、石膏和水，搅拌均匀，然后装入栽培袋中，每袋装料400-500g，栽培袋于121℃灭菌2h。
本发明的栽培方法能够将野生棱柄马鞍菌通过人工驯化，培养出野生棱柄马鞍菌子实体。
实施例1
2017年3月份，在山西省农业科学院食用菌研究所进行人工栽培，方法如下：
（1）菌种分离选取成熟、子实体肉质较厚、无病虫害的新鲜棱柄马鞍菌子实体，用毛刷轻轻除去基部土壤，无菌水冲洗3次，75%酒精浸泡15s，重复3次，吸水纸轻轻吸取残留液体，置于超净工作台，在菌盖和菌柄交界处用无菌解剖器切取直径5mm的小块，置于松针琼脂培养基，25℃培养7天，选择无污染、生长旺盛、粗壮、颜色洁白的菌丝为母种。所述的松针琼脂培养基的配方及制作方法称取棱柄马鞍菌子实体5g、马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g、松针30g，鱼蛋白胨2g；将棱柄马鞍菌子实体和马铃薯切块、松针切成1cm小段，加蒸馏水l000ml煮沸10–15min，6层纱布过滤，然后在滤液中加入上述葡萄糖及琼脂，搅拌融化，定容至l000ml，ph自然。
（2）制备液体菌种在（1）制备的固体母种中用无菌打孔器挑取直径5mm、5块母种，接种至含有液体培养基的250ml三角瓶中，25℃，135r/min，暗培养3d，待颗粒菌球出现，制成液体菌种。所述液体培养基的配方是：棱柄马鞍菌子实体5g、马铃薯200g、松针200g、葡萄糖20g、鱼蛋白胨1.5g、kh2po41g、nahco31g、mgso40.5g、维生素b10.01g，自来水1000ml，自然ph，培养基灭菌条件：121℃，灭菌25min。
（3）人工栽培
人工栽培料配方及制作方法人工栽培料配方由如下原料的重量份组成，松木屑28份、棉籽壳50份、麸皮6份、葡萄糖1份、石膏1份，ph6.8；将松木屑粉碎成直径1cm的小碎块，与棉籽壳一起在水中浸泡20h，沥干水分，加入麸皮、葡萄糖、石膏和水，搅拌均匀，然后装入栽培袋中，每袋装料400g，制作菌棒100个，栽培袋于121℃灭菌2h。栽培袋冷却后，室温下，用（2）制备的液体菌种向栽培袋接种，每栽培袋接种10ml，然后将栽培袋置于25℃环境下避光培养，观察菌丝生长情况，菌丝长满后，继续培养一周，然后转入出菇房，横排摆放，菌袋开口，表面覆盖2cm厚的松树下腐殖土，出菇期间环境条件：温度25–27℃，昼夜温差10–12℃，湿度60%–70%，待子实体成熟，没有“孢子云”形成之前就进行采摘，采摘后要迅速将子实体根部带培养料部分进行消除。在培养期间，及时监测病虫害发生情况，鉴别蚊蝇种类、数量，然后采取相应的控制措施。最后得到新鲜子实体5.2kg。
实施例2
2017年10月份，在山西省农业科学院食用菌研究所进行人工栽培，具体步骤如下：
（1）菌种分离同实施例1。
（2）制备液体菌种同实施例1。
（3）人工栽培人工栽培料配方及制作方法人工栽培料配方由如下原料的重量份组成，松木屑40份、棉籽壳62份、麸皮8份、葡萄糖2份、石膏2份，ph7；将松木屑粉碎成直径1cm的小碎块，与棉籽壳一起在水中浸泡20h，沥干水分，加入麸皮、葡萄糖、石膏和水，搅拌均匀，然后装入栽培袋中，每袋装料500g，制作菌棒100个，栽培袋于121℃灭菌2h。栽培袋冷却后，室温下，用（2）制备的液体菌种向栽培袋接种，每栽培袋接种10ml，然后将栽培袋置于25℃环境下避光培养，观察菌丝生长情况，菌丝长满后，继续培养一周，然后转入出菇房，横排摆放，菌袋开口，表面覆盖2cm厚的松树下腐殖土，出菇期间环境条件：温度28-30℃，昼夜温差10–12℃，湿度70%–80%，待子实体成熟，没有“孢子云”形成之前就进行采摘，采摘后要迅速将子实体根部带培养料部分进行消除。在培养期间，及时监测病虫害发生情况，鉴别蚊蝇种类、数量，然后采取相应的控制措施。最后得到新鲜子实体5.8kg。
实施例3
2018年10月份，在山西省农业科学院食用菌研究所进行人工栽培，具体步骤如下：
（1）菌种分离同实施例1。
（2）制备液体菌种同实施例1。
（3）人工栽培人工栽培料配方及制作方法人工栽培料配方由如下原料的重量份组成，松木屑35份、棉籽壳55份、麸皮7份、葡萄糖1.5份、石膏1.5份，ph6.5，其他同实施例2，最后得到新鲜子实体5.6kg。