一种利用枯草芽孢杆菌提高怀山药产量的方法与流程

本申请属于作物栽培技术领域，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌提高怀山药产量的方法专利申请。

背景技术：

现有农作物栽培过程中，由于大量农药、化肥等人工合成物的应用，造成了较为严重的负面影响，例如，农作物品质出现明显下降，同时农作物的生长皆处于亚健康状态，病根、病苗、病杆、病穗等现象较为普遍；另一方面，大量农药、化肥的使用，对于生态环境造成了较为严重的负面影响，同时土壤板结、酸化、有机质下降、肥效降低等问题也日益严重。因此，对于农业栽培方式的更新和改良势在必行。

现有技术中，配合各种营养元素的微生物菌剂，由于其环保、无污染、作用效果持久等优点，在部分大田作物、果树、蔬菜等多种作物的栽培上表现出较好的应用前景。而且由于部分微生物菌剂具有抑制病原菌、增强植物抗病能力等技术效果，因此，微生物菌剂的应用对于降低农药和化肥使用量具有十分重要的技术意义。

怀山药（dioscoreaoppositathunb.）是薯蓣科、薯蓣属的一种多年生缠绕草质藤本植物，其中为全国著名的“四大怀药”之一的铁棍山药（d.oppositacv.tiegun）是怀山药中的极品。怀山药生长分布广泛，但道地药食兼优的铁棍山药主产于河南省的温县和武陟。怀山药因其具有营养丰富、蛋白质含量高、糖分含量较低特点，加之具有降糖、降脂、健脾、补肺等多种功效，因此属于国家首批公布的有较强食用和药用功能的食品之一，广受人们关注和喜爱。而为满足人们日益增产的消费需求，对于如何提高怀山药的种植产量，显然极有必要进行深入研究。

技术实现要素：

本申请目的在于提供一种提高怀山药产量的方法，为实现此目的，本申请提供了一种微生物菌剂复配组合物，基于此复配组合物来达到提高怀山药产量的目的。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种用于提高怀山药产量的微生物菌剂复配组合物，该组合物为液体形态，其组分由枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）zwca02菌液和愈创木酚钠构成；以质量体积比计，

枯草芽孢杆菌zwca02菌液：愈创木酚钠=1000ml：0.1g；

所述枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）zwca02菌液，为枯草芽孢杆菌zwca02菌株发酵液，菌液od600值为0.3~0.7；最终微生物菌剂复配组合物成品中有效活菌数应≥5×10⁸cfu/ml；

所述枯草芽孢杆菌zwca02菌株，已于2019年6月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：cgmccno.17889，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

所述愈创木酚钠为硝基愈创木酚钠，愈创木酚是一种基于天然成分的人工合成植物生长调节剂，其cas#为67233-85-6，化学名称为2-甲氧基-5-硝基苯酚钠，分子式为c7h6no4na，英文名称为sodium5-nitroguaiacolate或2-methoxy-5-nitrophenolsodiumsalt；本申请中所采用愈创木酚钠有效成份含量以98%计。

所述用于提高怀山药产量的微生物菌剂复配组合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）枯草芽孢杆菌zwca02菌液制备

采用液体培养方式，以枯草芽孢杆菌zwca02菌株为发酵菌株，发酵至od600值为0.3-0.7备用；

（2）混合制备菌剂复配组合物

在步骤（1）所制备菌液中加入愈创木酚钠，混合均匀即可，此即为本申请所提供微生物菌剂复配组合物。

所述用于提高怀山药产量的微生物菌剂复配组合物在怀山药栽培中的应用，用于提高怀山药产量，具体应用时，在怀山药幼苗期，按每株幼苗1~3g用量均匀洒施用于幼苗根部土壤。

本申请所采用的枯草芽孢杆菌zwca02菌株，分离于自然环境的天然土壤中。初步研究认为，该菌株在侵染植物根茎部后，能够诱导植物产生生长激素，改变植物相关生理生化特征和遗传性能，表现为根部产生大量不定根，植株生长迅速、生长量增大，从而提高植物的养份吸收效率和生长发育能力。

本申请所涉及的愈创木酚钠(5－硝基愈创木酚钠、2-甲氧基-5-硝基苯酚钠)是一种生长调节剂和细胞赋活剂，具有较强的渗透作用，能激活枯草芽孢杆菌微生物细胞，促进原生质流动。常被用于调节植物的生长发育，促进动物的营养吸收，增强动物、植物和微生物对环境的抵抗力和免疫力。

怀山药作为一种根茎类作物，其整个生长期的旺盛程度和最终的产量很大程度上依赖于怀山药的根系发育状况，所以促进怀山药根系的生长也是提高怀山药产量的关键。基于此，本申请以特定的枯草芽孢杆菌zwca02菌株和愈创木酚钠作为主要调节物，同时复配以具有良好土壤结构改良作用的腐植酸，能够显著的刺激怀山药的根系生长、提高怀山药的养份吸收效率和运输转化，从而促进怀山药的生长发育，进而实现提高怀山药产量的发明目的。进一步对于怀山药品质测定结果表明，采用本申请所提供微生物菌剂复配组合物后，怀山药品质也得到了进一步提升。

总之，本申请通过相关微生物菌株筛选和应用，配合相关生产工艺技术、生产体系优化，制备了一种特定用于提高怀山药产量的微生物菌剂复配组合物。初步实验效果表明，应用该组合物后，不仅可以有效提高怀山药产量，同时也进一步改善了怀山药的品质和改善了作物的重茬效应，加上微生物菌剂复配组合物作用效果较为持久，可以持续改善土壤微生态环境，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。

附图说明

图1枯草芽孢杆菌zwca02在固体培养基中的菌落形状和颜色，其中a为28℃培养箱生长24h结果；b为28℃培养箱生长72h结果；

图2为不同实验组别产量统计结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。

实施例1

首先需要介绍说明的是，本申请涉及一株特定有益微生物菌株草芽孢杆菌（bacillussubtilis）zwca02菌株的应用实验，因此，本实施例首先就该菌株的筛选获得过程简要介绍说明如下。

在申请人所使用的试验基地（申请人河南中威化工有限公司在河南新乡平原新区所设基地）内，发明人发现同一地块内的部分土壤板结情况相交其他地块板结情况较轻，且作物产量相对较高，发明人为此猜测其土壤中相关优势微生物菌株对于土壤改良、作物生长具有一定有益效果，为此，发明人对此地块土壤进行了采样，并就优势微生物菌株进行筛选、培养，具体过程简要介绍如下。

采用稀释平板法，对从试验基地土壤中所采集土样在室内用无菌水溶解后，将上清液依次稀释涂布平板，挑取单个菌进行平板划线纯化，逐渐进行初筛和复筛，以挑选优势菌株，并进行鉴定。需要说明的是，菌株筛选和培养过程中，采用yepd酵母膏胨葡萄糖培养基（yepd平板培养基的制备方式为：溶解10g酵母膏，20g蛋白胨，加入20g琼脂粉，121℃下灭菌20min，加入100ml20%灭菌葡萄糖溶液，在每个培养皿倒入10-15ml培养基冷却凝固后，接种菌株）28℃条件进行培养。培养24h和72h的生长情况分别如图1的a图和b图所示。

进一步理化特性鉴定结果汇总如下表所示：

。

综合相关菌落形态及理化特性等结果，发明人鉴定其为：枯草芽孢杆菌，因此将该菌株命名为：枯草芽孢杆zwca02。而鉴于该菌株可能的土壤改良应用及作物增产应用，发明人进一步将其进行了微生物保藏，即，发明人于2019年6月3日将枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）zwca02菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：cgmccno.17889，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2

在实施例1筛选所得菌株基础上，发明人进一步将其进行了发酵，制备成发酵液，以便应用，本实施例就具体发酵过程简要说明如下。

挑取固体平板上保藏培养的单个枯草芽孢杆zwca02菌落，接种到5ml液体lb培养基中，在温度为28℃、转速200r/min的恒温摇床上，振荡培养18h作为种子液；

所述lb培养基的制备是在950ml的去离子水中加入酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，nacl10g，摇动直至溶质完全的溶解；然后用5mol/l的naoh调节其ph至7.0，用去离子水定容至一升；最后在15psi的高压下进行蒸汽灭菌21分钟；

随后，按1%体积比的接种比例，将摇瓶培养后种子液转接如发酵培养基中，28℃、通风比1:1有氧条件下、180转/分钟培养至od600值为0.6左右备用。

所述发酵培养基，每公斤培养基中含有：

玉米粉13g，葡萄糖5g，豆粉20g，炭酸钙caco37g，硫酸铵(nh4)2so41g，磷酸钾k2hpo40.3g，氯化钾kcl0.4g，硫酸镁mgso4·7h2o0.2g，硫酸锰mnso4·h2o0.2g；培养基ph=7.0~7.2。

实施例3

在实施例2发酵液基础上，发明人进一步制备了用于提高怀山药产量的微生物菌剂复配组合物。具体制备时：在实施例2中所制备菌液中加入愈创木酚钠，混合均匀即可，此即为本申请所提供微生物菌剂复配组合物。

需要说明的是，本实施例所采用的愈创木酚钠为中威高科技化工有限公司的硝基愈创木酚钠产品，纯度为98%。

具体用量方面，以质量体积比计：

枯草芽孢杆菌zwca02菌液：愈创木酚钠=1000ml：0.1g；

最终微生物菌剂复配组合物成品中有效活菌数5×10⁸cfu/ml左右。

为确定该微生物菌剂复配组合物的具体应用效果，发明人进行了进一步栽种实验，具体实验过程简介如下。

种植地点：

种植地点位于河南省焦作市温县垆土地山药种植基地，属于怀山药主产区，种植地块为连作重作三年的山药种植基地；

种植品种选择怀山药新铁二号品种；

种植前，测定种植地块的土壤有机质平均含量为6.5/kg、碱解氮25.3mg/kg、速效磷7.1mg/kg、速效钾59.8mg/kg、微生物总量3×10⁵/g。

实验设置：

种植时，选取健壮山药苗，每个处理200棵，分设4个处理，每处理20m²，4次重复：

实验组1：枯草芽孢杆菌菌液+愈创木酚（枯草芽孢杆菌zwca02菌液1000ml，愈创木酚钠0.1g）；

实验组2：枯草芽孢杆菌菌液（枯草芽孢杆菌zwca02菌液1000ml）；

实验组3：愈创木酚（0.1g愈创木酚钠/1l水溶液）。

空白对照组：清水。

具体应用方式为，按每株幼苗1.2ml用量（栽种密度为，10株/m²），均匀施用于幼苗周围土壤耕作层。

正常水肥管理，直至山药收获。

栽种结束后，对山药根系生长情况进行观察，结果表明，采用菌液的实验组（实验组1、实验组2、实验组3）的地下根系普遍发达，要优于未采用菌液的对照组。

对`每试验小区山药产量情况进行统计。结果如下表所示（产量以每公顷计，单位kg）：

为便于比较，进一步绘图如图2所示。

从图2及上表结果对比可以看出，无论单独采用愈创木酚、还是单独采用本申请特定的枯草芽孢杆菌zwca02菌液，其均表现出一定增产效果，但将两者进行复配应用后，两者进一步表现出一定协同作用（需要说明的是，实际实验过程中，复配后不同用量（分别实验了1.2ml、2.4ml、3ml）情况下总产量没有明显差异，故此上述实验数据并未展示），可以进一步提高怀山药产量，表现出了较好的应用前景。