一种脂肪组织保护液及其应用的制作方法

本发明涉及一种细胞的分离方法，尤其涉及一种脂肪源干细胞的分离制备方法。

背景技术：

脂肪源干细胞(adiposederivedstemcells,adsc)具有自我更新与多种分化潜能,通过分离培养可以在体外稳定增殖,在特定的诱导条件下,可以被分化诱导为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞等。新鲜分离的adsc在组织工程、再生医学及修复中有着广泛的应用，如应用于股骨头坏死组织工程技术修复、辅助脂肪移植、面部年轻化、促进毛发生长、皮肤烧伤、糖尿病足、骨缺损修复、神经损伤修复以及炎症性疾病等的治疗。

新鲜分离的adsc是来源于脂肪组织的脂肪血管基质细胞(脂肪血管基质组分，stromalvascularfraction，svf)的主要组成部分之一(adiposetissue-derivedstromalvascularfractioninregenerativemedicine:abriefreviewonbiologyandtranslation.stemcellresther.201715；8(1):145.)。2018年复旦大学汤其群教授将从脂肪组织中分离的svf作为adsc的一种。clinicaltrials.gov网站上登记的众多相关临床研究中，有很多研究者直接使用新鲜分离的adsc进行临床研究。

cd34作为间充质干细胞的主要阴性标记，研究发现在新鲜分离的adsc中可以检测到cd34，而且会随着不断的传代而逐渐消失，adiposetissue-derivedstromalvascularfractioninregenerativemedicine:abriefreviewonbiologyandtranslation.(stemcellresther.201715；8(1):145.)一文cd34可作为新鲜分离的adsc纯度的评价指标之一，且有众多其他研究学者将cd34视为前脂肪细胞和祖细胞的标志物，以cd34的检测结果来判断新鲜分离的adsc纯度。

从脂肪中分离adsc的方法尚未达成共识，而且纯度不高，目前adsc的制备方法主要有两种：一是使用蛋白酶水解消化脂肪组织的酶消化法；二是不使用蛋白水解酶的物理机械法，如常鹏于2014年8月12申请的授权号为cn203999585u的专利“一种富集脂肪源干细胞自动提取装置”公开了一种自动提取装置分离富集脂肪源干细胞的方法，使用物理机械法分离脂肪源干细胞耗时很长，有些方法需要三天左右，同时细胞得率、活性以及纯度较低，很难满足临床需求。。

酶消化法常采用ⅰ型胶原酶或混合胶原酶与脂肪组织按一定比例混合，消化1～3小时，随后离心过滤得到脂肪源干细胞，细胞得率、活性和物理机械法相比虽然有一定程度的提高，但是仍有较大的改进和提升空间。

申请公布号为cn104560868a的发明专利“一种脂肪干细胞的原代分离培养方法”，公开了一种使用ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶的混合液体分离脂肪干细胞的方法，每毫升脂肪分离的细胞量为3.79×10⁶，该方法使用了来源于动物的胰蛋白酶，用于临床时增加感染的风险。申请号为cn110241078a的发明专利“一种脂肪干细胞的提取和注射方法”，公布了一种将脂肪组织破碎后使用ⅰ和ⅱ胶原酶混合液消化分离脂肪干细胞的方法，该方法细胞得率低，50ml脂肪分离的细胞总量为2.13～2.21×10⁶，且活率低于80％。申请公布号为cn109652367的发明专利“一种制备临床级脂肪干细胞的方法”，公布了将脂肪组织机械破碎后使用ⅰ型胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶ⅰ和胰蛋白酶混合液消化分离脂肪干细胞的方法，该方法分离过程中引入大量外源物质，1ml脂肪分离的细胞量仅有0.6～0.8×10⁶，且活率低于90％。申请公布号为n107475190a的发明专利“一种脂肪svf细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途”，公开了一种脂肪svf细胞临床级高效制备方法，所得细胞中单核细胞含量较低仅有17％～30％，采用cd34进行纯度分析的结果可知纯度达不到60％。申请公布号为cn110129260a的发明专利“一种脂肪组织中的血管基质成分的提取方法及应用”，公开了一种采用0.2％的胶原酶进行低温酶解的方法处理脂肪组织，从而提高细胞的得率，该方法虽然得率高，但消化时间长达3小时，而且cd34+细胞的比例低，仅为32.82％，限制了其在临床上的应用。

综上所述，新鲜分离的adsc应用范围广，且分离方法不完善，主要问题有：(1)安全性未得到保证，使用的消化酶为非临床级或有动物源性物质引入，增加感染风险；(2)adsc得率低；(3)制备的adsc中单核细胞含量少、纯度低。这些问题限制了adsc临床应用，影响临床使用效果。因此需要开发出一种安全的、高效的、可制备高得率、高活率和高纯度adsc的方法。

技术实现要素：

本发明所解决的技术问题是提供一种脂肪组织保护液，用于保存脂肪组织，然后可通过使用该保护液保存脂肪组织，分离获得大量高纯度的优质临床级adsc，提高分离效率和adsc的活率和数量。

本发明提供一种脂肪组织保护液，所述脂肪组织保护液由人血白蛋白注射液、丙酮酸钠、生理盐水、青霉素、链霉素组成。

上述人血白蛋白注射液和生理盐水的体积比为5～10:90～95。

上述丙酮酸钠浓度为1～3mg/ml，青霉素和链霉素的浓度为100units/ml。

上述丙酮酸钠浓度为2mg/ml.

本发明第二方面还提供上述脂肪组织保护液的应用，所述脂肪组织保护液用于保存脂肪组织。

本发明第三方面，还提供上述脂肪组织保护液用于分离制备脂肪源干细胞。

本发明的突出优点：

1.在保护液中加入人血白蛋白为组织代谢提供氮源、维持细胞渗透压；

2.保护液中加入丙酮酸钠，为组织代谢提供碳源、同时具有抗氧化作用，维持细胞活性，减少细胞的凋亡；

3.adsc活性高、数量大，1ml脂肪组织可分离1.27～5.16*10⁶的adsc，是现有方法的20倍左右，adsc活率＞90％；

4.本发明提供的保护液大幅度提高了adsc的活率和纯度，分离adsc中单核细胞量为32.8％～65.49％，是现有技术的2倍左右，以检测细胞表面的cd34含量判断adsc的纯度，adsc纯度为51.01％～90.73％，是现有技术的1～3倍。

本发明因分离的svf中大部分为adsc，因此将分离的细胞统称为adsc。

本发明共采集20批数据，在具体实施例中包括以下步骤：

步骤一：对供者身体健康状况进行检查，供者身体状态良好，无遗传病家族病史、无恶性肿瘤、自身免疫性疾病、急慢性传染病、先天性疾病、无血液系统疾病和无其他影响手术抽脂疾病史。人源性特定病毒(hiv、hbv、hcv、htlv、ebv、cmv等)为阴性、梅毒螺旋体阴性，如果供者的相关检查结果为阳性，需在独立的操作空间和空调系统下完成，避免交叉污染的发生；

步骤二：配制脂肪组织保护液，脂肪组织保护液含人血白蛋白注射液、丙酮酸钠(原料药)、生理盐水、青霉素(注射用)、链霉素(注射用)，人血白蛋白和生理盐水的比例为5～10:95～90，丙酮酸钠浓度为1～3mg/ml，青霉素和链霉素的浓度为100units/ml；

步骤三：通过吸脂术获取的脂肪组织，且脂肪采集在层流手术室进行，将脂肪组织保存在脂肪组织保护液中，运送至gmp车间；

步骤四：用生理盐水配制一定活力的注射用胶原酶溶液，并预热至37℃；

步骤五：将通过吸脂术获得的脂肪组织离心，分为四层，即油脂层、脂肪组织层、液体层和底部沉淀；

步骤六：弃去油脂层、液体层和底部沉淀，保留脂肪组织；

步骤七：加入脂肪组织3～4倍体积的生理盐水，用力震荡混匀后离心，离心后分四层，即少量油脂层、脂肪组织层、液体层和底部沉淀，弃去油脂层、液体层和底部沉淀，保留脂肪组织；

步骤八：重复第七步的操作，用生理盐水清洗脂肪组织2～3次，离心后无油脂层和底部沉淀，即可进行后续操作

步骤九：在清洗后的脂肪组织加入一定体积步骤四配制的注射用胶原酶溶液，在恒温气浴培养振荡器消化一定时间；

步骤十：将第九步消化后的脂肪组织离心，分别收集底部的细胞沉淀和上层脂肪组织；

步骤十一：将细胞沉淀重悬在含人血白蛋白的生理盐水中，备用；

步骤十二：在第十步所得的脂肪组织中继续加入一定体积的注射用胶原酶溶液，在恒温气浴培养振荡器消化一定时间；

步骤十三：将第十二步消化后的脂肪组织离心，弃去上层脂肪组织和中间液体层，收集底部的细胞沉淀；

步骤十四：将细胞沉淀重悬在含一定浓度人血白蛋白的生理盐水中，与第十步所得的细胞悬液混合，用70μm的滤网过滤上述细胞悬液，离心；

步骤十五：弃上清，并用含人血白蛋白的生理盐水重悬细胞，离心，重复操作两次，尽可能的去除红细胞；

步骤十六：用适量含人血白蛋白的生理盐水重悬细胞并取样，台盼蓝法计数并检测细胞活率，利用流式细胞仪检测cd34的含量；

步骤十七：根据临床要求制备相应浓度的adsc制剂直接使用，临床级adsc制剂仅含有adsc、人血白蛋白和生理盐水；或冻存于-196℃备用，冻存液为临床级冻存液和人血白蛋白注射液，体积比为5:95。

附图说明

图1：本发明工艺流程图；

图2：a为对比例1分离的adsc中有核细胞含量检测结果，b为实施例2和实施例4分离的adsc中有核细胞最高含量，c为实施例3、实施例5和实施6分离的adsc中有核细胞最低含量，d实施例3、实施例5和实施6分离的adsc中有核细胞最高含量；

图3：a为对比例1cd34检测结果，b为实施例2cd34检测结果，c为实施例3cd34检测结果，d为实施例4cd34检测结果，e为实施例5cd34检测结果，f为实施例6cd34检测结果。

具体实施方式

以下，参照实施例对本发明进行更详细和具体地描述，但下述实施例并不意在限制本发明。

通过以下实施例进一步说明本发明，而非限制本发明，本发明中百分比浓度为体积百分比浓度，本发明中adsc为新鲜分离制备的adsc。

实施例1对比例临床级adsc细胞的制备

采用目前公开的制备临床级adsc的方法制备adsc，对比例和实施例每毫升脂肪分离细胞量和活率对比见表1

1.对供者身体健康状况进行检查，供者身体状态良好，无遗传病家族病史、无恶性肿瘤、自身免疫性疾病、急慢性传染病、先天性疾病、无血液系统疾病和无其他影响手术抽脂疾病史。人源性特定病毒(hiv、hbv、hcv、htlv、ebv、cmv等)为阴性、梅毒螺旋体阴性；

2.配制常规脂肪组织保护液，0.9％生理盐水+100ug/ml青霉素+100ug/ml链霉素；

3.配制消化液：20％的人血白蛋白25ml、0.9％生理盐水75ml、5mg的混合胶原酶、145μl的200mg/ml的氯化镁溶液；

4.配制洗涤液：5ml20％的人血白蛋白注射用加入500ml生理盐水中；

5.通过吸脂术获取的脂肪组织，且脂肪采集在层流手术室进行，将脂肪组织保存在常规脂肪组织保护液中，运送至gmp车间；

6.脂肪组织清洗后，加入与脂肪组织等体积的消化酶，混匀后置于37℃水浴锅内，每间隔1min摇匀一次，消化20～30min，观察无大块脂肪组织时终止消化；

7.18℃、400g离心7min，弃去上层液体和脂肪组织，保留底部沉淀，用洗涤液重悬后，使用100μm细胞滤网过滤，补加洗涤液后，18℃、400g离心7min，弃上清，保留adsc沉淀；

8.用适量洗涤液重悬细胞，取样计数、检测细胞活率、单核细胞含量以及细胞纯度。

实施例2本发明分离方法制备优质临床级脂肪源干细胞制剂1

采用目前公开的制备临床级adsc的方法制备adsc，其主要步骤具体同实施例1，但是保护液采用本发明保护液，具体配方为，人血白蛋白和生理盐水的体积比为5:95，丙酮酸钠浓度为2mg/ml，青霉素和链霉素的浓度为100units/ml。脂肪组织保护液与脂肪组织比例为1:1。

实施例3本发明分离方法制备优质临床级脂肪源干细胞制剂2

一种从脂肪组织中高效分离制备优质临床级脂肪源干细胞的方法，其主要步骤包括：

1.对供者身体健康状况进行检查，供者身体状态良好，无遗传病家族病史、无恶性肿瘤、自身免疫性疾病、急慢性传染病、先天性疾病、无血液系统疾病和无其他影响手术抽脂疾病史。人源性特定病毒(hiv、hbv、hcv、htlv、ebv、cmv等)为阴性、梅毒螺旋体阴性，如果供者的相关检查结果为阳性，需在独立的操作空间和空调系统下完成，避免交叉污染的发生；

2.配制脂肪组织保护液，含人血白蛋白注射液、丙酮酸钠(原料药)、生理盐水、青霉素(注射用)、链霉素(注射用)，具体配方为：人血白蛋白和生理盐水的体积比为10:90，丙酮酸钠浓度为2mg/ml，青霉素和链霉素的浓度为100units/ml；

3.在层流手术室中通过吸脂术采集脂肪组织，并将脂肪组织保存在脂肪组织保护液中，脂肪组织保护液与脂肪组织比例为1:1，运送至gmp车间；

4.用生理盐水配制注射用胶原溶液，酶活力为62.5～250.0u/ml，并预热至37℃；

5.脂肪组织在400g条件下离心10min，分为四层，即油脂层、脂肪组织层、液体层和底部沉淀；

6.弃去油脂层、液体层和底部沉淀，保留脂肪组织，在脂肪组织中，加入脂肪组织3～4倍体积的生理盐水，用力震荡充分摇匀，400g离心10min；

7.重复第6步的操作，用生理盐水清洗脂肪组织2～3次，离心后无油脂层和底部沉淀，即可进行后续操作；

8.在清洗后的脂肪组织中加入酶活力为62.5～250.0u/ml的注射用胶原酶溶液，脂肪组织与胶原酶溶液的体积比为1:0.25～1:1；

9.混匀后，置于恒温气浴培养振荡器中，恒温气浴培养振荡器转速80～100rpm，消化10～30min，观察无大块状脂肪组织，停止消化；

10.400g×10min离心，分别收集底部的细胞沉淀和上层脂肪组织；

11.用含终浓度为2％～4％人血白蛋白的生理盐水(生理盐水和20％人血白蛋白的体积比为9:1～4:1)重悬细胞沉淀，备用；

12.在第10步所得的脂肪组织中继续加入酶活力为62.5～250.0u/ml的胶原酶溶液，脂肪组织与胶原酶溶液的体积比为1:0.25～1:1；

13.混匀后，置于恒温气浴培养振荡器中，恒温气浴培养振荡器转速80～100rpm，消化10～20min，观察脂肪组织为乳状时，停止消化；

14.400g离心10min，弃去上层脂肪组织和中间液体层，收集底部细胞沉淀；

15.用含终浓度2％～4％人血白蛋白的生理盐水(生理盐水和20％人血白蛋白的体积比为9:1～4:1)重悬细胞沉淀，并与第10步所得的细胞悬液混合；

16.用70μm的滤网过滤上述细胞悬液，400g离心10min；

17.弃上清，用含终浓度2％～4％人血白蛋白的生理盐水清洗adsc，重悬细胞沉淀后，400g离心10min；

18.重复第17步的操作，清洗细胞2到3次。

19.弃上清，细胞沉淀用适量含2％～4％人血白蛋白的生理盐水重悬取样，利用台盼蓝法检测细胞数量、活率，用流式细胞仪检测单核细胞含量和cd34含量。

20.根据临床要求制备相应浓度的adsc制剂直接使用，临床级adsc制剂仅含有adsc、人血白蛋白和生理盐水；或冻存于-196℃液氮中备用，冻存液的配方是临床级dmso和人血白蛋白的体积比为5:95，使用程序降温仪进行降温。

21.adsc复苏率和复苏后细胞活率检测：从-196℃液氮中取出冻存的adsc，在37～40℃水浴锅中快速震荡进行复苏，时间少于1min，然后转移至含终浓度2％～4％人血白蛋白的生理盐水中，400g离心10min，弃上清，细胞沉淀用适量含终浓度2％～4％人血白蛋白的生理盐水重悬，取样用台盼蓝法计数并检测复苏后细胞活率，计算复苏率，由检测结果可知，复苏率都高于90％，且细胞活率大于90％，可满足临床应用需求

实施例4本发明分离方法制备优质临床级脂肪源干细胞制剂3

一种从脂肪组织中高效分离制备优质临床级脂肪源干细胞的方法，其主要步骤具体同实施例3，但是保护液采用常规脂肪组织保护液，具体配方为，0.9％生理盐水+100ug/ml青霉素+100ug/ml链霉素。

实施例5本发明分离方法制备优质临床级脂肪源干细胞制剂4

保存时，脂肪组织保护液与脂肪组织比例为1:1，脂肪组织保护液的具体配方为：人血白蛋白和生理盐水的体积比为5:95，丙酮酸钠浓度为3mg/ml，青霉素和链霉素的浓度为100units/ml；其余步骤同实施例3。

实施例6本发明分离方法制备优质临床级脂肪源干细胞制剂5

保存时，脂肪组织保护液与脂肪组织比例为1:1，脂肪组织保护液具体配方为：人血白蛋白和生理盐水的体积比为10:90，丙酮酸钠浓度为3mg/ml，青霉素和链霉素的浓度为100units/ml；其余步骤同实施例3。

各实施例每毫升脂肪分离细胞量和活率数据的实验结果如表1所示。

表1各实施例每毫升脂肪分离细胞量和活率对比

从以上结果可以看出，采用同样的分离方法，不同脂肪组织保护液，本发明脂肪组织保护液的效果均优于普通脂肪组织保护液，且如采用本发明分离方法和本发明脂肪组织保护液，则分离的细胞量和纯度均大大优于普通方法和普通脂肪组织保护液。

此外，应理解，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围和实质的情况下，可以对本发明的技术方案进行各种修改或者等同替换。