一种诱导朝鲜淫羊藿再生芽的繁殖方法与流程

本发明属于植物的繁殖技术领域，具体涉及一种诱导朝鲜淫羊藿再生芽的繁殖方法。

背景技术：

朝鲜淫羊藿(epimediumkoreanumnakai)是小檗科淫羊藿属多年生宿根草本植物，集中分布在中国东北长白山地区。多生林下或灌丛中，海拔400-1500米，喜生于土壤疏松、土质肥沃、腐殖质含量较高的地方。朝鲜淫羊藿是中国传统的补益类中药材，《中华人民共和国药典》有收载，称其具有温补肾阳，强筋骨，祛风湿等功效，属长白山道地性中药材，可用于治疗阳萎遗精、早泄、小便失禁、关节冷痛、月经不调等症。淫羊藿药用成分为：淫羊藿苷、淫羊藿素、大黄素、甘草素、金丝桃苷、槲皮素、三十一烷、甾醇、棕榈酸、银杏醇、木兰花碱、花色素、咖啡酸等；其功能为：扩张冠状动脉血管、降血压镇咳、祛痰、平喘、抗菌、抗病毒及抗炎，治疗阳痿早泄、风湿性关节炎及妇科病。现代医学研究则指出，朝鲜淫羊藿除具有传统医学价值及使用范围以外，还有许多新的药理作用和用途，比如抗衰老、促进骨骼生长、改善造血系统障碍等等，因此，它的制品是现代医学及食品领域里最热门的产品之一，是极具开发价值的一种植物类药材。

目前，入药的朝鲜淫羊藿药材主要以野生资源采收为主，未发现人工栽培。由于其药性独特，药品生产商需求量逐年增加，使价格从每斤0.5元一路攀升至7.5元。朝鲜淫羊藿荚果于6月中下旬方可成熟，此时种子中的胚处在球形胚阶段，需要极其麻烦的后熟过程。况且，经过逐年采收，野生资源受到极大破坏，又因药商的抢收，药农多在开花前后就开始抢采，很难采集到种子，导致人工种子繁育失败。在现有技术中，利用植物组织培养技术在试管内进行繁育的技术多数处于实验研究领域，也未见有大量种苗的繁育和人工规模化栽培生产。

技术实现要素：

为了解决上述随着朝鲜淫羊藿需求量的增大，采集和消耗量已超过自然资源的再生能力，导致物种濒危以及朝鲜淫羊藿人工培养繁殖系数低、成本高、速度慢、可操作性差等问题。本发明提供一种诱导朝鲜淫羊藿再生芽的繁殖方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种诱导朝鲜淫羊藿再生芽的繁殖方法，包括以下步骤：

s1.材料选择与预处理：取春季5月上旬的朝鲜淫羊藿根部休眠芽，用无菌水将休眠芽上的泥土冲洗干净后，用70％乙醇涮洗20-30s，用饱和次氯酸钠溶液浸泡5-7min，再用无菌水冲洗6-8次，最后用无菌滤纸吸干休眠芽表面水分后作为接种外植体备用；

s2.培养基制备：以马铃薯熬制的上清液作为基本培养基，附加油菜花提取液、kh2po4溶液、赤霉素溶液中的一种或多种，再添加白糖、琼脂条，并调节培养基的ph；

s3.诱导培养：将s1中外植体接种于s2中培养基中，并置于适宜的环境条件下培养30-40天，使得朝鲜淫羊藿根部的休眠芽形成再生芽；

s4.继代增殖培养：步骤s3中朝鲜淫羊藿休眠芽再生芽后，剥离丛生芽上的单芽，再次转接到诱导朝鲜淫羊藿再生芽的培养基中，并置于适宜的环境条件下，使得朝鲜淫羊藿获得相应数目单芽。

进一步的，步骤s2中基本培养基中马铃薯熬制的上清液的浓度为10-50g·l^-1。

进一步的，培养基中油菜花提取液的质量浓度为80-220g·l^-1、kh2po4的质量浓度为160-270mg·l^-1、赤霉素的质量浓度为0.40-1.70mg·l^-1。

进一步的，培养基油菜花提取液的质量浓度为150-220g·l^-1、kh2po4的质量浓度为200-270mg·l^-1、赤霉素的质量浓度为1.00-1.70mg·l^-1。

进一步的，培养基中油菜花提取液的质量浓度为190-220g·l^-1、kh2po4的质量浓度为240-250mg·l^-1、赤霉素的质量浓度为1.10-1.70mg·l^-1。

进一步的，培养基中白糖的质量浓度为5-20g·l^-1，琼脂条的质量浓度为2.5-10g·l^-1。

进一步的，培养基中白糖的质量浓度15g·l^-1，琼脂条的质量浓度为7.5g·l^-1。

进一步的，培养基的ph为5.8-6.8。

进一步的，培养基的ph为6.2。

进一步的，步骤s3和s4中适宜的环境条件为温度26±2℃、光照强度500-600lx、光照周期7-9h·d^-1。

本发明提供一种诱导朝鲜淫羊藿再生芽的繁殖方法，具有以下有益效果：

1、通过以朝鲜淫羊藿根部休眠芽为材料，利用植物组织培养技术，通过诱导休眠芽形成再生芽的方式对朝鲜淫羊藿进行再生芽；解决了种子后熟时间长和分根繁殖破坏野生资源等不利因素，同时克服了以往利用植物组织培养方法步骤复杂、诱导率低和遗传性状可能发生变化等缺点。

2、朝鲜淫羊藿休眠芽直接诱导再生芽的诱导率最高，平均再生率达96％以上；年产芽总数量极大，生根后成活率达90％以上。

3、本方法可应用于朝鲜淫羊藿的工厂化繁育，对朝鲜淫羊藿的人工规模化栽培、开发利用和长白山濒危药用植物种子资源保护具有重大的意义。

附图说明

图1为朝鲜淫羊藿在试管内再生芽的结构图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

如图1所示，一种诱导朝鲜淫羊藿再生芽的繁殖方法，包括以下步骤：

s1.材料选择与预处理：取春季5月上旬的朝鲜淫羊藿根部休眠芽，用无菌水将休眠芽上的泥土冲洗干净后，用70％乙醇涮洗20-30s，用饱和次氯酸钠溶液浸泡5-7min，再用无菌水冲洗6-8次，最后用无菌滤纸吸干休眠芽表面水分后作为接种外植体备用；

s2.培养基制备：以马铃薯熬制的上清液作为基本培养基，附加油菜花提取液、kh2po4溶液、赤霉素溶液中的一种或多种，再添加白糖、琼脂条，并调节培养基的ph；

其中，基本培养基中马铃薯熬制的上清液的浓度为10-50g·l^-1；油菜花提取液的质量浓度为80-220g·l^-1、kh2po4的质量浓度为160-270mg·l^-1、赤霉素的质量浓度为0.40-1.70mg·l^-1；白糖的质量浓度为5-20g·l^-1，琼脂条的质量浓度为2.5-10g·l^-1；且培养基的ph为5.8-6.8。

本实施例中培养基成份和使用量：马铃薯熬制的上清液30g·l^-1作为基本培养基，附加油菜花提取液80～150g·l^-1、kh2po4130～200mg·l^-1和赤霉素ga30.3～1.0mg·l^-1，添加食用白糖15g·l^-1，琼脂条7.5g·l^-1，使得培养基的ph为6.2，促使朝鲜淫羊藿根部的休眠芽更易形成再生芽；

s3.诱导培养：将s1中外植体接种于s2中培养基中，并置于适宜的环境条件下培养30-40天，使得朝鲜淫羊藿根部的休眠芽形成再生芽；

即外植体接种于培养基后置于温度26±2℃、光照强度500-600lx和光照周期8h·d^-1环境下培养，使得朝鲜淫羊藿根部的休眠芽形成再生芽。为统计朝鲜淫羊藿再生芽的诱导率，采用均匀设计法进行试验设计，选用u8(8³)均匀表，每个处理接种休眠芽数为10个，重复3次，筛选确定油菜花提取液、kh2po4和赤霉素ga3对朝鲜淫羊藿再生芽诱导的最佳浓度配比。休眠芽培养35d统计再生芽诱导率，以休眠芽基部组织形成再生芽5以上个为准。计算公式为：再生芽诱导率＝产生5个以上再生芽的休眠芽数/接种的休眠芽总数×100％；

s4.继代增殖培养：步骤s3中朝鲜淫羊藿休眠芽再生芽后，剥离丛生芽上的单芽，再次转接到诱导朝鲜淫羊藿再生芽的培养基中，并置于适宜的环境条件下，使得朝鲜淫羊藿获得相应数目单芽；

即待休眠芽再生的芽形成5-7个芽时，剥离丛生芽上的单芽，再次转接到附加油菜花提取液、kh2po4和赤霉素的马铃薯熬制的上清液培养基中进行继代增殖培养(此培养基成分为已优化的最佳培养基)，每瓶试管内朝鲜淫羊藿具有3-5个单芽，统计并计算每瓶试管的增殖倍数和周期。

s5.数据分析与处理

采用均匀设计法进行全回归性分析处理数据，应用均匀设计软件(uniformdesign3.0v)。

通过研究发现油菜花提取液、kh2po4和赤霉素ga3对朝鲜淫羊藿休眠芽再生芽诱导具有重要影响。以下主要分析油菜花提取液、kh2po4和赤霉素ga3对朝鲜淫羊藿休眠芽再生芽诱导的影响。

s51.油菜花提取液、kh2po4和赤霉素ga3对朝鲜淫羊藿休眠芽再生芽诱导的影响

表1影响朝鲜淫羊藿休眠芽再生芽形成的因素筛选的u8(8³)试验设计与结果

培养35d后可得表1中的数据，数据经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为y＝30.1+0.226x1+0.136x2+12.7x3，显著性水平α＝0.05，复相关系数r＝0.9874，剩余标准差s＝1.06，检验值ft＝51.78﹥临界值f(0.05,3,4)＝6.591，回归方程显著，说明油菜花提取液、kh2po4和赤霉素对朝鲜淫羊藿休眠芽再生芽诱导的影响具有显著性。通过计算油菜花提取液、kh2po4和赤霉素对朝鲜淫羊藿休眠芽再生芽诱导的贡献值和贡献率可知，u1＝165，u1/u＝94.0％；u2＝60.3，u2/u＝34.3％；u3＝52.2，u3/u＝29.7％，说明赤霉素对朝鲜淫羊藿休眠芽再生芽诱导的贡献最小，因此对其进行显著性检验可知检验值f3＝46.15﹥临界值f(0.05,1,4)＝7.709，此因素对朝鲜淫羊藿休眠芽再生芽诱导具有显著性。又因油菜花提取液、kh2po4和赤霉素对朝鲜淫羊藿休眠芽再生芽诱导率呈正相关。由此推测，油菜花提取液、kh2po4和赤霉素质量浓度分别高于150g·l^-1、200mg·l^-1和1.00mg·l^-1时，对朝鲜淫羊藿休眠芽再生芽诱导率可能更高。为验证此推测，又以油菜花提取液质量浓度为150、160、170、180、190、200、210和220g·l^-1，kh2po4质量浓度为200、210、220、230、240、250、260和270mg·l^-1，赤霉素质量浓度为1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6和1.7mg·l^-1开展8个水平的补充验证试验，重复3次。结果发现，油菜花提取液质量浓度为190～200g·l^-1、kh2po4质量浓度为240～250mg·l^-1和赤霉素质量浓度为1.10～1.50mg·l^-1时，对朝鲜淫羊藿休眠芽再生芽诱导率最高，平均诱导率达96％以上，均高于表1所列8个处理的诱导率。当油菜花提取液和赤霉素质量浓度分别高于200g·l^-1和1.50mg·l^-1时再生芽细弱且诱导率下降，当kh2po4质量浓度高于250mg·l^-1时再生芽基部粗壮而芽体变形(即不能形成明显的芽体)。

因此，通过以上实验数据处理和分析可知，油菜花提取液质量浓度为190～200g·l^-1、kh2po4质量浓度为240～250mg·l^-1和赤霉素质量浓度为1.10～1.50mg·l^-1时，对朝鲜淫羊藿休眠芽再生芽诱导率最高，平均诱导率达96％以上。

s52.朝鲜淫羊藿再生芽的继代增殖

待休眠芽再生的芽形成5-7个芽时，剥离丛生芽上的单芽，再次转接到附加油菜花提取液质量浓度为190～200g·l^-1、kh2po4质量浓度为240～250mg·l^-1和赤霉素质量浓度为1.10～1.50mg·l^-1的马铃薯熬制的上清液培养基中进行继代增殖培养，培养条件为温度26±2℃、光照强度500-600lx和光照周期8h·d^-1，每瓶3-5个单芽。经初步统计，芽增殖倍数为5，周期为35天，以100个休眠芽为基源计算，年产芽数为：∑年产芽数＝(100×5¹⁰×96％)株，按生根后90％成活计算，可以满足朝鲜淫羊藿工厂化繁育和规模化人工栽培的需要。

因此，朝鲜淫羊藿休眠芽再生芽诱导的最佳培养基成分及使用量为：马铃薯熬制的上清液30g·l^-1作为基本培养基，附加油菜花提取液质量浓度为190～200g·l^-1、kh2po4质量浓度为240～250mg·l^-1和赤霉素质量浓度为1.10～1.50mg·l^-1，添加食用白糖15g·l^-1，琼脂条7.5g·l^-1，ph6.2。外植体接种后置于温度26±2℃、光照强度500-600lx和光照周期8h·d^-1环境下培养，培养35d休眠芽可形成5-7个再生芽，诱导率达96％以上。

待休眠芽再生的芽形成5-7个芽时，剥离丛生芽上的单芽，再次转接到朝鲜淫羊藿再生芽诱导的最佳培养基中，置于温度26±2℃、光照强度500-600lx和光照周期8h·d^-1环境下培养，年产芽数为：∑年产芽数＝(100×5¹⁰×96％)株，按生根后90％成活计算，可以满足朝鲜淫羊藿工厂化繁育和规模化人工栽培的需要。。

本发明以朝鲜淫羊藿休眠芽材料，采用植物组织培养技术对朝鲜淫羊藿开展了再生芽的诱导技术研究，旨在获得一种朝鲜淫羊藿试管内成本低、快速简捷的再生芽诱导方法，经过近3年的实验确定了快速简捷方案，此方案可应用于朝鲜淫羊藿工厂化育苗和人工规模化生产栽培。同时，对朝鲜淫羊藿种群的扩增具有重要的保护和生态意义。

上述仅为本发明的优选具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。