本发明涉及一种川贝母的组织培养方法，具体是涉及一种川贝母类圆球茎的诱导培养方法。
背景技术：
川贝母(fritillariacirrhosad.don)属百合科植物，生长在海拔3500m～4500m的高度，主产于四川、西藏、云南等省区。川贝母喜冷凉气候条件，具有耐寒、喜湿、怕高温、喜荫蔽的特性。气温达到30℃或地温超过25℃，植株就会枯萎，在海拔低和气温高的地区不能生存。川贝母药材具有清热润肺，化痰止咳之功效，用于肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，咯痰带血等症状；由于川贝母药材价格昂贵，加之近年来无计划盲目的采挖，自然资源日趋枯竭，预计在近几十年内也难以缓解。组织培养技术具有生长周期短，繁殖率高，不受季节、气候的影响，条件均一等优点，因此应用组织培养方法进行川贝母快速繁殖是解决川贝母药材资源短缺问题的有效方法之一。
类圆球茎细胞具有潜在的分裂能力，可进一步形成植物鳞茎、胚状体和愈伤组织等多种器官结构，具有增殖效率高、生长周期短和可实现大规模化生产的特点，并具备与原植物同样的物质代谢潜能。利用组培技术诱导培养类圆球茎对川贝母植物的保护、再生和合理利用具有重要意义。目前还未见有利用组培技术诱导培养川贝母类圆球茎的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供一种川贝母类圆球茎的的培养方法。
为达到上述目的，本发明采用的解决方案是：
一种川贝母类圆球茎的诱导培养方法，包括如下步骤：
(1)愈伤组织的诱导培养：选取川贝母组培苗上生长的地上茎作为外植体，切取后将其正接于愈伤组织诱导培养基ms+kt0.5～1.0mg·l-1+2,4-d0.5～1.5mg·l-1+naa0.5～1.0mg·l-1+琼脂6.5～7.0g·l-1中，先在温度为5～8℃、无光照的条件下培养7天，再转放在温度为18～22℃、无光照的条件下进行愈伤组织的诱导培养；
(2)类圆球茎的诱导培养：选取步骤(1)中游离在培养基表面的地上茎上端产生的质地疏松、颜色为黄白色的愈伤组织，按0.4～0.8g的质量大小接入改良b5+6-ba1.0～3.0mg·l-1+naa0.1～0.5mg·l-1+尿素1.0～3.0g·l-1+琼脂3.0～5.0g·l-1的类圆球茎诱导培养基中，在培养温度为16～20℃、每天光照3～6小时、光照强度为400～800lx的条件下进行类圆球茎的诱导培养；所述改良b5的肌醇改为50mg·l-1；
(3)类圆球茎的增殖培养：选取步骤(2)中诱导出的直径为0.2～0.4cm的白色、圆形类圆球茎，以1.0～2.0g/100ml的接种量接入类圆球茎增殖培养基ms+6-ba1.0～3.0mg·l-1+naa0.1～0.5mg·l-1+腺嘌呤10～30mg·l-1+活性炭1.0～3.0g·l-1中，在培养温度为20～25℃、每天光照6～10小时、光照强度1000～1500lx、每分钟振荡8～12次的条件下进行振荡培养；
上述所有培养基的ph值为5.8～6.2，蔗糖10～20g·l-1。
进一步地，步骤(1)中地上茎的切取长度为1.0～2.0cm。
进一步地，步骤(1)中所述正接是指将地上茎形态学下端插入愈伤组织诱导培养基，形态学上端游离在愈伤组织诱导培养基表面。
本发明选取川贝母组培苗上生长的地上茎为外植体，先诱导培养出质地较疏松、颜色为黄白色的愈伤组织，再进一步诱导愈伤组织产生颜色为白色、形状为圆形和直径为0.2～0.4cm的类圆球茎。川贝母类圆球茎的诱导培养，可为川贝母植物的器官形态建成、植株高效再生、遗传转化和其次生代谢物质的生产研究提供大量的实验材料和理论基础，从而能为当前存在的川贝母资源短缺问题提供一条新的解决途径。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本实施例提供的一种川贝母类圆球茎的诱导培养方法包括如下步骤：
(1)愈伤组织的诱导培养：选取川贝母组培苗上生长的地上茎作为外植体，在超净工作台上切成1.5cm的长度后，将地上茎的形态学下端插入愈伤组织诱导培养基ms+kt0.8mg·l-1+2,4-d1.0mg·l-1+naa0.8mg·l-1+琼脂6.8g·l-1中，其形态学上端游离在培养基表面，先在温度为6℃、无光照的条件下培养7天，再转放在温度为20℃、无光照的条件下进行愈伤组织的诱导培养；培养30天统计，愈伤组织的诱导率为100％；
(2)类圆球茎的诱导培养：选取步骤(1)中游离在培养基表面的地上茎上端产生的质地疏松、颜色为黄白色的愈伤组织，按0.6g的质量大小接入改良b5+6-ba2.0mg·l-1+naa0.3mg·l-1+尿素2.0g·l-1+琼脂4.0g·l-1的类圆球茎诱导培养基中，在培养温度为18℃、每天光照5小时、光照强度为600lx的条件下进行类圆球茎的诱导培养，所述改良b5的肌醇改为50mg·l-1；培养40天统计，类圆球茎的诱导率为62.32％；
(3)类圆球茎的增殖培养：选取步骤(2)中诱导出的颜色为白色、形状为圆形和直径为0.3cm的类圆球茎，以1.5g/100ml的接种量接入类圆球茎增殖培养基ms+6-ba2.0mg·l-1+naa0.3mg·l-1+腺嘌呤20mg·l-1+活性炭2.0g·l-1中，在培养温度为22℃、每天光照8小时、光照强度1200lx和每分钟振荡10次的条件下进行振荡培养；培养25天统计，类圆球茎的增殖倍数为3.25倍；
上述所有培养基的ph值为6.0，蔗糖15g·l-1。
实施例2
本实施例提供的一种川贝母类圆球茎的诱导培养方法包括如下步骤：
(1)愈伤组织的诱导培养：选取川贝母组培苗上生长的地上茎作为外植体，在超净工作台上切成1.0cm的长度后，将地上茎的形态学下端插入愈伤组织诱导培养基ms+kt0.5mg·l-1+2,4-d0.5mg·l-1+naa0.5mg·l-1+琼脂6.5g·l-1中，其形态学上端游离在培养基表面，先在温度为5℃、无光照的条件下培养7天，再转放在温度为18℃、无光照的条件下进行愈伤组织的诱导培养；培养30天统计，愈伤组织的诱导率为84.62％；
(2)类圆球茎的诱导培养：选取步骤(1)中游离在培养基表面的地上茎上端产生的质地疏松的黄白色愈伤组织，按0.4g的质量大小接入改良b5+6-ba1.0mg·l-1+naa0.1mg·l-1+尿素1.0g·l-1+琼脂3.0g·l-1的类圆球茎诱导培养基中，在培养温度为16℃、每天光照3小时、光照强度为400lx的条件下进行类圆球茎的诱导培养；所述改良b5的肌醇改为50mg·l-1；培养40天统计，类圆球茎的诱导率为50.62％；
(3)类圆球茎的增殖培养：选取步骤(2)中诱导出的颜色为白色、形状为圆形和直径为0.2cm的类圆球茎，以1.0g/100ml的接种量接入类圆球茎增殖培养基ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.1mg·l-1+腺嘌呤10mg·l-1+活性炭1.0g·l-1中，在培养温度为20℃、每天光照6小时、光照强度1000lx和每分钟振荡8次的条件下进行振荡培养；培养25天统计，类圆球茎的增殖倍数为2.32倍；
上述所有培养基的ph值为5.8，蔗糖10g·l-1。
实施例3
本实施例提供的一种川贝母类圆球茎的诱导培养方法包括如下步骤：
(1)愈伤组织的诱导培养：选取川贝母组培苗上生长的地上茎作为外植体，在超净工作台上切成2.0cm的长度后，将地上茎的形态学下端插入愈伤组织诱导培养基ms+kt1.0mg·l-1+2,4-d1.5mg·l-1+naa1.0mg·l-1+琼脂7.0g·l-1中，其形态学上端游离在培养基表面，先在温度为8℃、无光照的条件下培养7天，再转放在温度为22℃、无光照的条件下进行愈伤组织的诱导培养；培养30天统计，愈伤组织的诱导率为96.73％；
(2)类圆球茎的诱导培养：选取步骤(1)中游离在培养基表面的地上茎上端产生的质地较疏松、颜色为黄白色的愈伤组织，按0.8g的质量大小接入改良b5+6-ba3.0mg·l-1+naa0.5mg·l-1+尿素3.0g·l-1+琼脂5.0g·l-1的类圆球茎诱导培养基中，在培养温度为20℃、每天光照6小时、光照强度为800lx的条件下进行类圆球茎的诱导培养；所述改良b5的肌醇改为50mg·l-1；培养40天统计，类圆球茎的诱导率为57.53％；
(3)类圆球茎的增殖培养：选取步骤(2)中诱导出的颜色为白色、形状为圆形和直径为0.4cm的类圆球茎，以2.0g/100ml的接种量接入类圆球茎增殖培养基ms+6-ba3.0mg·l-1+naa0.5mg·l-1+腺嘌呤30mg·l-1+活性炭3.0g·l-1中，在培养温度为25℃、每天光照10小时、光照强度1500lx和每分钟振荡12次的条件下进行振荡培养；培养25天统计，类圆球茎的增殖倍数为2.93倍。
上述所有培养基的ph值为6.2，蔗糖20g·l-1。
比较实施例1
在实施例1步骤(1)中，将外植体改为川贝母组培苗上生长的绿色叶片，其它步骤同实施例1，培养30天统计，愈伤组织的诱导率为0％。
比较实施例2
在实施例1步骤(1)中，将先放在6℃的无光照条件下培养7天的步骤取消，其它步骤同实施例1，培养30天统计，愈伤组织的诱导率为53.52％；观察发现诱导出的愈伤组织质地较为致密，颜色为黄色且易产生褐变，在之后转入步骤(2)的类球茎诱导培养基中诱导培养40天后统计，类圆球茎的诱导率为0％。
比较实施例3
在实施例1步骤(2)中，改选地上茎形态学下端插入培养基部分产生的致密愈伤组织接入类圆球茎诱导培养中，其它步骤同实施例1，诱导培养40天统计，类圆球茎的诱导率为0％。
比较实施例4
在实施例1步骤(2)中，愈伤组织改为按0.2g质量大小接入类圆球茎的诱导培养基中，其它步骤同实施例1，诱导培养40天统计，类圆球茎的诱导率为6.75％。
比较实施例5
在实施例1步骤(2)中，愈伤组织改为按1.0g质量大小接入类圆球茎的诱导培养基中，其它步骤同实施例1，诱导培养40天统计，类圆球茎的诱导率为21.75％。
比较实施例6
在实施例1步骤(2)中，将类圆球茎诱导培养基改为b5+6-ba2.0mg·l-1+naa0.3mg·l-1+琼脂7.0g·l-1，其它步骤同实施例1，诱导培养40天统计，类圆球茎诱导率为9.29％。
比较实施例7
在实施例1步骤(2)中，将培养条件改为培养温度为28℃、每天光照12小时和光照强度为1500lx，其它步骤同实施例1，诱导培养40天统计，类圆球茎的诱导率为12.25％。
比较实施例8
在实施例1步骤(3)中，改选直径为0.1cm的类圆球茎进行增殖培养，其它步骤同实施例1，振荡培养25天统计，类圆球茎的增殖数为0倍，观察发现增殖的类圆球茎全部出现褐化。
比较实施例9
在实施例1步骤(3)中，改选直径为0.6cm的类圆球茎进行增殖培养，其它步骤同实施例1，振荡培养25天统计，类圆球茎的增殖数为1.61倍。
比较实施例10
在实施例1步骤(3)中，将接种量改为0.5g/100ml，其它步骤同实施例1，振荡培养25天统计，类圆球茎的增殖数为1.86倍。
比较实施例11
在实施例1步骤(3)中，将类圆球茎增殖培养基改为ms+6-ba2.0mg·l-1+naa0.3mg·l-1，其它步骤同实施例1，振荡培养25天统计，类圆球茎的增殖数为1.32倍。
比较实施例12
在实施例1步骤(3)中，改为在培养温度为15℃、每天光照4小时、光照强度400lx和每分钟振荡20次的条件下进行振荡培养，其它步骤同实施例1，振荡培养25天统计，类圆球茎的增殖数为1.83倍。