一种箭叶淫羊藿叶柄组培快繁方法与流程

本发明涉及植物组织培养技术领域，更具体涉及一种箭叶淫羊藿叶柄组培快繁方法。

背景技术：

淫羊藿是我国的大宗常用中药材传统中药，具有补肾阳、强筋骨、提高免疫力、抗癌、保护神经等作用，以其为原料的药品涉及各种剂型，有几十种之多。《中国药典》收录了5种淫羊藿属植物，箭叶淫羊藿是其中分布最为广泛的物种，广布于我国的华东、华中和西南诸省，使用量较大。随着对箭叶淫羊藿野生资源掠夺式采挖，其野生资源破坏严重，人工种植迫在眉睫。但是，传统的箭叶淫羊藿繁殖方式主要是地下根茎的分株繁殖和种子繁殖，分株繁殖繁殖系数低，种子繁殖周期长，难以满足箭叶淫羊藿规模化种植对种苗的需求。

植物组织培养技术是最有效的繁殖技术，已经广泛应用于作物、园林、药用植物的快速繁殖。目前，组培技术在箭叶淫羊藿种苗生产上应用较少，关于箭叶淫羊藿叶柄为外植体组培快繁的方法还未见报道。

本发明提供了一套箭叶淫羊藿叶柄为外植体组培快繁方法，可以为箭叶淫羊藿规模化种植奠定良好的基础。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种箭叶淫羊藿叶柄组培快繁方法，以箭叶淫羊藿叶柄为外植体，进行箭叶淫羊藿的组培快繁，该方法易于操作，取材时间长，低成本，高成活率，为箭叶淫羊藿的规模化生产提供了参考。

为进一步实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种箭叶淫羊藿叶柄组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)叶柄消毒：采自中国科学院武汉植物园过渡圃的箭叶淫羊藿植株上采集新鲜健康无病害的叶柄，截成约2-2.5cm小段，将外植体材料置于1:800的百菌清可湿性粉剂水溶液中浸泡15分钟，然后捞出叶柄移至500ml的大烧杯盖上纱布置于自来水下冲洗1小时后沥干，最后转入超净工作台中用75％的酒精溶液消毒25-35s，期间不断用灭过菌的镊子轻轻搅拌，取出用无菌水漂洗3-4次除去残留的酒精；接着用0.1％升汞消毒8分钟，无菌水漂洗3-4次，然后置于灭过菌的滤纸除去残留的水分备用。

(2)诱导外植体生成愈伤组织：在超净台中将消过毒的叶柄用灭过菌的解剖刀切去两端充分消毒(同步骤(1)消毒过程)创口，切成1.5-2cm茎段，将茎段用解剖刀沿叶柄纵向划伤2-3处创口(创口一般与茎段等长，深度为叶柄直径的1/3)，然后将创口轻贴于愈伤组织诱导培养基，确保创口处能够充分吸收营养成分；在光强1000-2000lux，12h/天光照条件下进行培养，培养温度22-26℃；约20天即可长出愈伤组织，每25天更换一次培养基，所换的继代培养基配方与原培养基一致，进行愈伤组织的增殖，25天统计一次愈伤组织诱导率与增长率。

(3)诱导愈伤组织分化出不定芽或丛生芽：将诱导产生的愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，在光强1500-3000lux，12h/天光照条件下进行培养，培养温度22-26℃，约20天可看到诱导不定芽的形成，30天后统计一次不定芽诱导率。

芽的增殖培养：切取单个不定芽接种到丛生芽增殖培养基中，进行芽的增殖培养，在光强1500-3000lux，12h/天光照条件下进行培养，培养温度22-26℃，诱导形成丛生芽，30天后统计一次丛生芽增殖系数。

(4)诱导芽体形成须根：无菌条件下切取单个粗壮芽体，接种于生根培养基，在光强1500-3000lux，12h/天光照条件下进行培养，培养温度22-26℃，25天之后形成白色须根，30天后统计一次生根率。

(5)炼苗、育苗：挑选长势良好，根系相对发达的组培苗，在炼苗准备室，揭去组培瓶的盖子，在光强1500-3000lux，12h/天光照条件下进行培养，培养温度22-26℃，空气湿度65％-80％条件下，炼苗5-7天，期间注意喷水保湿；洗净培养基，栽种到田园土：蛭石：泥炭土：腐殖土＝3:1:2:2混合后的基质中，荫棚炼苗30-60天；炼苗结束后移栽至育苗圃，移栽前对苗圃土壤采用百菌清75％可湿性粉剂按500-700倍液进行消毒，施适量的有机肥后耙平，以每株距18-25cm进行定植，覆土压实后浇足水，与此同时架设遮阳率为60％-70％的遮阳网，并注意防虫、防旱涝，60天后统计成活率。

在本发明中，步骤(1)所采用的叶柄消毒过程是先洗去表面尘土及大部分细菌，再用流动水反复冲洗，冲去残留药物及部分细菌，确保在用酒精及升汞之前洗去大多杂质及细菌，使消毒过程更加严谨，干净。

在本发明中，步骤(1)采用纱布是为了防止因水流过快将叶柄冲出烧杯。

在本发明中，基于愈伤组织在伤口处形成，步骤(2)适当增加创口促进多生成愈伤，愈伤组织不仅能在中间划伤部分长出愈伤，且在两端也能生长，能够有效地增加愈伤组织的生长量。

在本发明中，组培苗从完全无菌的环境中转入大田，其中会掺杂很多细菌及真菌，步骤(5)中炼苗5-7天，可让组培苗慢慢适应其有菌的环境，有效地增加移栽成活率；从完全无菌的组培苗到下地移栽中需要缓冲过程，炼苗30-60天，期间以使幼苗从土壤中吸收养分。

在本发明中，步骤(5)基质中所述蛭石用于土壤疏松透气，防止土壤板结，由于淫羊藿的生长环境为土壤肥沃，疏松透气的林下腐殖土，本发明所用田园土量多是为保证水分不过多流失；本发明采用的基质关键在于保持一定的湿度、营养性的情况下又不致使土壤粘结，最大程度的模仿淫羊藿在自然环境下的生长情况。

在本发明中，步骤(5)移栽前给苗圃施适量的有机肥，基于有机肥营养成分较高，用量不宜过多，过多则易导致“烧苗”，应与传统复合肥合理搭配使用。

在本发明中，步骤(5)所述遮阳网是为了模拟箭叶淫羊藿在自然状态下生于林下等遮阴较高的地方，防止晒伤。

上述步骤(1)、(2)、(3)为本次发明的关键步骤，首先在外植体的选择上：对叶柄的组培快繁技术鲜有报道，其次叶柄的采集不受季节时令的限制，在植物组织细胞的全能性方面以革质化叶片为外植体材料诱导愈伤组织较难，通常只能采用的是春季新萌发未革质化叶片进行愈伤组织诱导实验，但利用其叶柄诱导愈伤组织较易，四季均可取材。本发明不仅简化了利用叶柄愈伤组织的操作流程，且大大提高愈伤组织及芽分化的诱导效率，缩短其育种周期，并延长了取材时间，为淫羊藿的组培育种奠定了良好的基础。

上述步骤(2)所述的愈伤组织诱导培养基为：ms4.74g/l+6-ba(1mg/ml)0.5-1.0ml/l+naa(1mg/ml)0.05-0.1ml/l+zt(1mg/ml)0.1-0.2ml/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7.5g/l，ph调节至6.5。

上述步骤(3)所述的不定芽诱导培养基为：ms4.74g/l+6-ba(1mg/ml)0.5-1.0ml/l+naa(1mg/ml)0.5-1.0ml/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7.5g/l，ph调节至6.5。

上述步骤(3)所述的丛生芽增殖培养基为：ms4.74g/l+6-ba(1mg/ml)0.5-1.0ml/l+iba(1mg/ml)0.5-1.0ml/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7.5g/l，ph调节至6.5。

在本发明中，步骤(3)所采用的不定芽诱导培养基是为了促进愈伤组织再分化形成不定芽，所采用的丛生芽诱导培养基是为了促进不定芽扩繁。

上述步骤(4)所述的生根培养基为：1/2ms4.74g/l+6-ba(1mg/ml)0.5-1.0ml/l+iba(1mg/ml)0.5-1.0ml/l+活性炭0.4-0.6g/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7.5g/l，ph调节至6.5。

在本发明中，步骤(4)所采用的生根培养基中含有一定浓度的6-ba，在一定程度上也可促进根的生长，生出的根系更加粗壮，有利于炼苗生长。

在本发明中，ms指的是组织培养一般作物用培养基的基本配方。

在本发明中，6-ba指的是6-苄氨基腺嘌呤。

在本发明中，naa指的是α-萘乙酸。

在本发明中，iba指的是吲哚乙酸。

在本发明中，zt指的是玉米素。

在本发明中，愈伤组织诱导率＝形成愈伤组织的外植体数/(接种的外植体总数-污染的外植体数)×100％。

在本发明中，愈伤组织增长率＝(愈伤组织的鲜重-接种时愈伤组织的鲜重)/接种时愈伤组织的鲜重×100％。

在本发明中，不定芽诱导率＝形成不定芽的愈伤组织数/愈伤组织接种数×100％。

在本发明中，丛生芽增殖系数＝增殖的芽数量/接种时芽的数量。

在本发明中，生根率＝生根苗数/接种苗数×100％。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：本发明提供的箭叶淫羊藿叶柄组培快繁方法，培育的无菌苗稳定遗传母本优良性状、高繁殖率、低成本、易于取材操作，为箭叶淫羊藿的产业化种植提供了参考。

附图说明

图1显示本发明实施例1叶柄诱导产生的愈伤组织；

图2显示本发明实施例2由叶柄愈伤组织分化形成的丛生苗；

图3显示本发明实施例1诱导丛生苗产生根系；

图4显示本发明实施例2叶柄形成的组培苗在荫棚炼苗。

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

实施例1:一种箭叶淫羊藿叶柄组培快繁方法，其步骤如下：

(1)叶柄消毒：采自中国科学院武汉植物园过渡圃的箭叶淫羊藿植株上采集新鲜健康无病害的叶柄，截成约2或2.2或2.5cm小段，将外植体材料置于1:800的百菌清可湿性粉剂水溶液中浸泡15分钟，然后捞出叶柄移至500ml的大烧杯盖上纱布置于自来水下冲洗1小时后沥干，最后转入超净工作台中用75％的酒精溶液消毒25或30或35s，期间不断用灭过菌的镊子轻轻搅拌，取出用无菌水漂洗3或4次除去残留的酒精；接着用0.1％升汞消毒8分钟，无菌水漂洗3或4次，然后置于灭过菌的滤纸除去残留的水分备用。

(2)诱导外植体生成愈伤组织：在超净台中将消过毒的叶柄用灭过菌的解剖刀切去两端充分消毒(同步骤(1)消毒过程)创口，切成1.5cm茎段，将茎段用解剖刀沿叶柄纵向划伤2或3处创口，创口与茎段等长，深度为叶柄直径的1/3，然后将创口轻贴于愈伤组织诱导培养基，确保创口处能够充分吸收营养成分，愈伤组织诱导培养基配方：ms4.74g/l+6-ba(1mg/ml)0.75ml/l+naa(1mg/ml)0.075ml/l+zt(1mg/ml)0.1ml/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7.5g/l，ph调节至6.5；在光强1000lux，12h/天光照条件下进行培养，培养温度22℃；每25天更换一次培养基，所换培养基配方与原培养基一致，诱导生成愈伤组织，25天统计一次愈伤组织诱导率与增长率，愈伤组织诱导率为86.32％，愈伤组织增长率为170.15％。

(3)诱导愈伤组织分化出不定芽或丛生芽：诱导产生的愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，不定芽诱导培养基配方：ms4.74g/l+6-ba(1mg/ml)0.75ml/l+naa(1mg/ml)0.75ml/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7.5g/l，ph调节至6.5，在光强1500lux，12h/天光照条件下进行培养，培养温度22℃，诱导不定芽的形成，30天后统计一次不定芽诱导率为81.52％。

芽的增殖培养：切取单个不定芽接种到丛生芽增殖培养基中，丛生芽增殖培养基配方：ms4.74g/l+6-ba(1mg/ml)0.75ml/l+iba(1mg/ml)0.75ml/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7.5g/l，ph调节至6.5，进行芽的增殖培养，在光强1500或2000或2500或3000lux，12h/天光照条件下进行培养，培养温度22或24或26℃，诱导形成丛生芽，30天后统计一次丛生芽增殖系数，增殖系数为5.71。

(4)诱导芽体形成须根：无菌条件下切取单个粗壮芽体，接种于生根培养基，生根培养基配方：1/2ms4.74g/l+6-ba(1mg/ml)0.75ml/l+iba(1mg/ml)0.75ml/l+活性炭0.4g/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7.5g/l，ph调节至6.5。在光强1500lux，12h/天光照条件下进行培养，培养温度22℃，25天后形成白色须根，30天后统计一次生根率，生根率为70.14％。

(5)炼苗、育苗：挑选长势良好，根系相对发达的组培苗，在炼苗准备室，揭去组培瓶的盖子，在光强1500lux，12h/天光照条件下进行培养，培养温度22℃，空气湿度65％条件下，炼苗5天，期间注意喷水保湿；洗净培养基，栽种到田园土：蛭石：泥炭土：腐殖土＝3:1:2:2混合后的基质中，荫棚炼苗30天；炼苗结束后移栽至育苗圃，移栽前对苗圃土壤采用百菌清75％可湿性粉剂按500或600或700倍液进行消毒，施适量的有机肥后耙平(施用量：有机肥400kg/亩，史丹利复合肥按n-p2o5-k2o以15-15-1530kg/亩)，以每株距18cm进行定植，覆土压实后浇足水，与此同时架设遮阳率为60％或65％或70％的遮阳网，并注意防虫：定植前2周采用16000iu/mg的苏云金杆菌可湿性粉剂1000g稀释2000倍对定植土壤进行喷施，防旱涝：旱季时大田定时喷灌田间土壤干湿交替，使幼苗根系迅速生长，雨季来临前种植田一定要挖好排水沟，发现田间有积水时，应及时排出，避免幼苗根系缺氧死亡。60天后统计幼苗成活率，幼苗成活率在85％。

实施例2:一种箭叶淫羊藿叶柄组培快繁方法，其步骤如下：

(1)叶柄消毒：采自中国科学院武汉植物园过渡圃的箭叶淫羊藿植株上采集新鲜健康无病害的叶柄，截成约2或2.3或2.5cm小段，将外植体材料置于1:800的百菌清可湿性粉剂水溶液中浸泡15分钟，然后捞出叶柄移至500ml的大烧杯盖上纱布置于自来水下冲洗1小时后沥干，最后转入超净工作台中用75％的酒精溶液消毒25或30或35s，期间不断用灭过菌的镊子轻轻搅拌，取出用无菌水漂洗3或4次除去残留的酒精；接着用0.1％升汞消毒8分钟，无菌水漂洗3或4次，然后置于灭过菌的滤纸除去残留的水分备用。

(2)诱导外植体生成愈伤组织：在超净台中将消过毒的叶柄用灭过菌的解剖刀切去两端充分消毒(同步骤(1)消毒过程)创口，切成1.5cm茎段，将茎段横放于无菌滤纸之上，再将茎段用解剖刀沿叶柄纵向划伤2或3处创口，创口与茎段等长，深度为叶柄直径的1/3，然后将创口轻贴于愈伤组织诱导培养基，确保创口处能够充分吸收营养成分，愈伤组织培养基配方为：ms4.74g/l+6-ba(1mg/ml)1.0ml/l+naa(1mg/ml)0.1ml/l+zt(1mg/ml)0.2ml/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7.5g/l，ph调节至6.5；在光强2000lux，12h/天光照条件下进行培养，培养温度26℃；每25天更换一次培养基，所换培养基配方与原培养基一致，诱导生成愈伤组织，25天后统计愈伤组织诱导率与增长率，愈伤组织诱导率为85.7％，愈伤组织增长率为175.41％。

(3)诱导愈伤组织分化出不定芽或丛生芽：诱导产生的愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，不定芽诱导培养基配方为：ms4.74g/l+6-ba(1mg/ml)1.0ml/l+naa(1mg/ml)1.0ml/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7.5g/l，ph调节至6.5，在光强3000lux，12h/天光照条件下进行培养，培养温度26℃，诱导不定芽的形成，30天后统计不定芽诱导率，不定芽诱导率为83.74％。

芽的增殖培养：切取单个不定芽接种到丛生芽增殖培养基，丛生芽增殖培养基配方为：ms4.74g/l+6-ba(1mg/ml)1.0ml/l+iba(1mg/ml)0.75ml/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7.5g/l，ph调节至6.5，进行芽的增殖培养，在光强3000lux，12h/天光照条件下进行培养，培养温度26℃，诱导形成丛生芽，30天后统计丛生芽增殖系数，增殖系数为5.82。

(4)诱导芽体形成须根：无菌条件下切取单个粗壮芽体，接种于生根培养基，生根培养基配方为：1/2ms4.74g/l+6-ba(1mg/ml)1.0ml/l+iba(1mg/ml)0.75ml/l+活性炭0.5g/l+蔗糖30g/l+卡拉胶7.5g/l，ph调节至6.5。在光强3000lux，12h/天光照条件下进行培养，培养温度26℃，25天后形成白色须根，30天后统计愈伤组织生根率，生根率为72.08％。

(5)炼苗、育苗：挑选长势良好，根系相对发达的组培苗，在炼苗准备室，揭去组培瓶的盖子，在光强3000lux，12h/天光照条件下进行培养，培养温度26℃，空气湿度80％条件下，炼苗7天，期间注意喷水保湿；洗净培养基，栽种到田园土：蛭石：泥炭土：腐殖土＝3:1:2:2混合后的基质中，荫棚炼苗60天；炼苗结束后移栽至育苗圃，移栽前对苗圃土壤采用百菌清75％可湿性粉剂按500或550或600或650或700倍液进行消毒，施适量的有机肥后耙平(施用量：有机肥400kg/亩，史丹利复合肥按n-p2o5-k2o以15-15-1530kg/亩)，以每株距25cm进行定植，覆土压实后浇足水，与此同时架设遮阳率为60％或65％70％的遮阳网，并注意防虫：定植前2周采用16000iu/mg的苏云金杆菌可湿性粉剂1000g稀释2000倍对定植土壤进行喷施；防旱涝：旱季时大田定时喷灌田间土壤干湿交替，使幼苗根系迅速生长，雨季来临前种植田一定要挖好排水沟，发现田间有积水时，应及时排出，避免幼苗根系缺氧死亡。60天后统计幼苗成活率，幼苗成活率在85％。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。