本发明属于体外胚胎冷冻技术，尤其涉及牛克隆胚胎冷冻液、解冻液、试剂盒和牛克隆胚胎冷冻及解冻方法。
背景技术：
人和动物的胚胎的冷冻保存已经是人工生殖领域中一个必要的部分。在过去二十年中，冷冻保存技术的发展亦可反映人工生殖技术的发展程度，现代的冷冻技术已可用在冷冻保存精子、卵子和不同时期的胚胎。尤其是玻璃化冷冻技(vitrification)，不仅已获得医学界广泛的认可，并渐渐取代传统慢速冷冻法，成为冷冻技术的最佳选择。与传统的慢速冷冻法相比，玻璃化冷冻过程使细胞体内不产生水结晶，从而避免对胚胎的伤害。
与体内胚胎相比，体外受精胚胎和克隆胚胎的质量较差，抗冻能力弱。胚胎质量的低下导致冷冻解冻后胚胎的复活率和受胎率进一步下降。传统的慢冷冻方法不能有效的冷冻保存这种胚胎，从而大大的限制了体外受精和克隆技术在家畜繁殖育种中的应用。现有的牛胚胎玻璃化冷冻技术的发明人，gvajta的方案如下：冷冻液：15％甘油+15％dmso；38℃；解冻液：1m的蔗糖，38℃；与传统慢速冷冻法相比提高了体内胚胎的冷冻效果和受胎率，但是在克隆胚胎上的应用效果不理想，一般只有5％的受胎率。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种受胎率高的牛克隆胚胎冷冻液、解冻液、试剂盒和牛克隆胚胎冷冻及解冻方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种牛克隆胚胎冷冻液，包括独立存在的基础液、第一玻璃化冷冻液、第二玻璃化冷冻液和第三玻璃化冷冻液；
所述基础液以杜氏磷酸缓冲液为溶剂，包括体积分数18％～22％的犊牛血清、体积分数0.2％～0.4％的牛血清白蛋白、0.25～0.35mmol/l的丙酮酸钠和3.0～3.5mmol/l的葡萄糖；
所述第一玻璃化冷冻液包括体积分数88％～92％的基础液和体积分数8～12％甘油；
所述第二玻璃化冷冻液包括体积分数68％～72％的基础液、体积分18～22％甘油和体积分数8～12％乙二醇；
所述第三玻璃化冷冻液包括体积分数48％～52％的基础液、体积分24～26％甘油和体积分数24％～26％乙二醇。
优选的，所述基础液以杜氏磷酸缓冲液为溶剂，包括体积分数19％～21％的犊牛血清、体积分数0.25％～0.35％的牛血清白蛋白、0.28～0.32mmol/l的丙酮酸钠和3.1～3.4mmol/l的葡萄糖。
优选的，所述第一玻璃化冷冻液包括体积分数89％～91％的基础液和体积分数9～11％甘油。
优选的，所述第二玻璃化冷冻液包括体积分数69％～71％的基础液、体积分19～21％甘油和体积分数9～11％乙二醇。
优选的，所述第三玻璃化冷冻液包括体积分数50％的基础液、体积分25％甘油和体积分数25％乙二醇。
本发明提供了一种利用所述的冷冻液进行牛克隆胚胎冷冻方法，包括以下步骤：
将牛克隆胚胎置于所述基础液中在24～25℃平衡胚胎5～10min后；依次置于所述第一玻璃化冷冻液中在24～25℃平衡胚胎4～6min、置于所述第二玻璃化冷冻液中在24～25℃平衡胚胎4～6min、置于所述第三玻璃化冷冻液中在24～25℃平衡胚胎35～45s，最后置于液氮中冷冻。
优选的，所述牛克隆胚胎装于ops管中后置于液氮中冷冻。
本发明提供了一种牛克隆胚胎解冻液，包括第一解冻液和第二解冻液；所述第一解冻液包括体积分数为88％～92％所述的基础液和8％～12％半乳糖；所述第二解冻液包括体积分数为93％～97％的所述的基础液和3％～7％半乳糖。
本发明提供了一种牛克隆胚胎的解冻方法，包括以下步骤：将冷冻的牛克隆胚胎置于第一解冻液中于37～39℃平衡胚胎50～70s后，置于第二解冻液中于24～25℃平衡胚胎4～6min，最后置于基础液中24～25℃平衡胚胎4～6min。
本发明还提供了一种牛克隆胚胎冷冻试剂盒，包括所述的牛克隆胚胎冷冻液和所述的牛克隆胚胎解冻液。
本发明的有益效果：本发明提供的牛克隆胚胎冷冻液通过提高防冻剂在冷冻液内的浓度，加速细胞脱水过程；充分的细胞脱水防止冷冻过程中产生冰晶，从而大大降低对胚胎的损伤；能够提高牛克隆胚胎的复苏率和存活率。
本发明提供的牛克隆胚胎冷冻方法在室温24～25℃平衡胚胎，而不是传统系统里的38℃平衡胚胎，从而降低防冻剂对胚胎的毒性；本发明提供的牛克隆胚胎冷冻方法的解冻液采用的半乳糖，对胚胎的毒性大大低于传统的蔗糖；本发明提供的牛克隆胚胎冷冻液以及方法，能够产生25％～35％的受胎率。
具体实施方式
本发明提供了一种牛克隆胚胎冷冻液，包括独立存在的基础液、第一玻璃化冷冻液、第二玻璃化冷冻液和第三玻璃化冷冻液；所述基础液以杜氏磷酸缓冲液为溶剂，包括体积分数18％～22％的犊牛血清、体积分数0.2％～0.4％的牛血清白蛋白、0.25～0.35mmol/l的丙酮酸钠和3.0～3.5mmol/l的葡萄糖；所述第一玻璃化冷冻液包括体积分数88％～92％的基础液和体积分数8～12％甘油；所述第二玻璃化冷冻液包括体积分数68％～72％的基础液、体积分18～22％甘油和体积分数8～12％乙二醇；所述第三玻璃化冷冻液包括体积分数48％～52％的基础液、体积分24～26％甘油和体积分数24％～26％乙二醇。
在本发明中，所述基础液以杜氏磷酸缓冲液为溶剂，优选的包括体积分数19％～21％的犊牛血清、体积分数0.25％～0.35％的牛血清白蛋白、0.28～0.32mmol/l的丙酮酸钠和3.1～3.4mmol/l的葡萄糖，更优选包括体积分数20％的犊牛血清、体积分数0.3％的牛血清白蛋白、0.3mmol/l的丙酮酸钠和3.3mmol/l的葡萄糖。本发明对所述杜氏磷酸缓冲液的来源没有特殊限定，采用市售的杜氏磷酸缓冲液即可。
在本发明中，所述第一玻璃化冷冻液优选的包括体积分数89％～91％的基础液和体积分数9～11％甘油，更优选的包括体积分数90％的基础液和体积分数10％甘油。
在本发明中，所述第二玻璃化冷冻液优选的包括体积分数69％～71％的基础液、体积分19～21％甘油和体积分数9～11％乙二醇，更优选的包括体积分数70％的基础液、体积分20％的甘油和体积分数10％的乙二醇。
在本发明中，所述第三玻璃化冷冻液优选的包括体积分数50％的基础液、体积分25％甘油和体积分数25％乙二醇。
在本发明的一个优选的具体实施例，所述基础液以杜氏磷酸缓冲液为溶剂，包括体积分数20％的犊牛血清、体积分数0.3％的牛血清白蛋白、0.3mmol/l的丙酮酸钠和3.3mmol/l的葡萄糖；所述第一玻璃化冷冻液包括体积分数90％的基础液和体积分数10％甘油；所述第二玻璃化冷冻液包括体积分数70％的基础液、体积分20％甘油和体积分数10％乙二醇；所述第三玻璃化冷冻液包括体积分数50％的基础液、体积分25％甘油和体积分数25％乙二醇。
本发明提供了一种利用所述的冷冻液进行牛克隆胚胎冷冻方法，包括以下步骤：
将牛克隆胚胎置于所述基础液中在24～25℃平衡胚胎5～10min后；依次置于所述第一玻璃化冷冻液中在24～25℃平衡胚胎4～6min、置于所述第二玻璃化冷冻液中在24～25℃平衡胚胎4～6min、置于所述第三玻璃化冷冻液中在24～25℃平衡胚胎35～45s，最后置于液氮中冷冻。
在本发明中，优选的将牛克隆胚胎置于所述基础液中在24.5℃平衡胚胎5min后；依次置于所述第一玻璃化冷冻液中在24.5℃平衡胚胎5min、置于所述第二玻璃化冷冻液中在24.5℃平衡胚胎5min、置于所述第三玻璃化冷冻液中在24.5℃平衡胚胎40s，最后置于液氮中冷冻。在本发明中，所述牛克隆胚胎优选的装于ops管中后置于液氮中冷冻。在本发明中，所述基础液、第一玻璃化冷冻液、第二玻璃化冷冻液和第三玻璃化冷冻液的用量独立优选为80～120μl/一枚胚胎，更优选为100μl/一枚胚胎。
本发明还提供了一种牛克隆胚胎解冻液，包括第一解冻液和第二解冻液；所述第一解冻液包括体积分数为88％～92％所述的基础液和8％～12％半乳糖；优选的包括体积分数为90％所述的基础液和10％半乳糖；所述第二解冻液包括体积分数为93％～97％所述的基础液和3％～7％半乳糖，优选的包括体积分数为95％所述的基础液和5％半乳糖。
本发明还提供了一种牛克隆胚胎的解冻方法，包括以下步骤：将冷冻的牛克隆胚胎置于第一解冻液中在37～39℃平衡胚胎50～70s后，置于第二解冻液中在24～25℃平衡胚胎4～6min，最后置于基础液中在24～25℃平衡胚胎4～6min；优选的将冷冻的牛克隆胚胎置于第一解冻液中在38℃平衡胚胎60s后，置于第二解冻液中在24.5℃平衡胚胎5min，最后置于基础液中24.5℃平衡胚胎5min。
本发明还提供了一种牛克隆胚胎冷冻试剂盒，包括所述的牛克隆胚胎冷冻液和所述的牛克隆胚胎解冻液。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
冷冻液组成：
基础液(mh)：体积分数20％的犊牛血清+0.3mmol/l丙酮酸钠+3.3mmol/l葡萄糖+体积分数0.3％的牛血清白蛋白+余量的杜氏磷酸缓冲液。
第一玻璃化冷冻液(vs1)：体积分数90％基础液+体积分数10％甘油
第二玻璃化冷冻液(vs2)：体积分数70％基础液+体积分数20％甘油+体积分数10％乙二醇
第三玻璃化冷冻液(vs3)：体积分数50％基础液+体积分数25％甘油+体积分数25％乙二醇
冷冻程序：
基础液24～25℃平衡胚胎5min；
第一玻璃化冷冻液24～25℃平衡胚胎5min；
第二玻璃化冷冻液24～25℃平衡胚胎5min；
第三玻璃化冷冻液24～25℃平衡胚胎40s；
装入ops细管，直接投入液氮冷冻。
实施例2
冷冻液组成：
基础液(mh)：体积分数18％的犊牛血清+0.25mmol/l丙酮酸钠+3.0mmol/l葡萄糖+体积分数0.2％的牛血清白蛋白+余量的杜氏磷酸缓冲液。
第一玻璃化冷冻液(vs1)：体积分数92％基础液+体积分数8％甘油
第二玻璃化冷冻液(vs2)：体积分数72％基础液+体积分数19％甘油+9％乙二醇
第三玻璃化冷冻液(vs3)：体积分数52％基础液+体积分数24％甘油+体积分数24％乙二醇
冷冻程序：
基础液24～25℃平衡胚胎5min；
第一玻璃化冷冻液24～25℃平衡胚胎5min；
第二玻璃化冷冻液24～25℃平衡胚胎5min；
第三玻璃化冷冻液24～25℃平衡胚胎40s；
装入ops细管，直接投入液氮冷冻。
实施例3
冷冻液组成：
基础液(mh)：体积分数22％的犊牛血清+0.35mmol/l丙酮酸钠+3.5mmol/l葡萄糖+体积分数0.4％的牛血清白蛋白+余量的杜氏磷酸缓冲液。
第一玻璃化冷冻液(vs1)：体积分数88％基础液+体积分数12％甘油
第二玻璃化冷冻液(vs2)：体积分数68％基础液+体积分数21％甘油+体积分数11％乙二醇
第三玻璃化冷冻液(vs3)：体积分数48％基础液+体积分数26％甘油+体积分数26％乙二醇
冷冻程序：
基础液24～25℃平衡胚胎5min；
第一玻璃化冷冻液24～25℃平衡胚胎5min；
第二玻璃化冷冻液24～25℃平衡胚胎5min；
第三玻璃化冷冻液24～25℃平衡胚胎40s；
装入ops细管，直接投入液氮冷冻。
实施例4
解冻液组成：
第一解冻液(ws1)：体积分数90％基础液+体积分数10％半乳糖
第二解冻液(ws2)：体积分数95％基础液+体积分数5％半乳糖解冻程序：
第一解冻液38℃平衡胚胎1min，第二解冻液24～25℃平衡胚胎5min，基础液24～25℃平衡胚胎5min。
对比例1
冷冻液组成：
基础液(mh)：体积分数80％tcm199+体积分数20％的犊牛血清
第一玻璃化冷冻液(vs1)：体积分数85％基础液+体积分数7.5％乙二醇+体积分数7.5％二甲基亚砜；
第二玻璃化冷冻液(vs2)：体积分数70％基础液+体积分数15％乙二醇+体积分数15％二甲基亚砜+0.5摩尔蔗糖；
冷冻程序：
第一玻璃化冷冻液37℃平衡胚胎3min；
第二玻璃化冷冻液37℃平衡胚胎30s
装入ops细管，直接投入液氮冷冻。
解冻液组成：
第一解冻液(ws1)：基础液+0.5摩尔蔗糖
第二解冻液(ws2)：基础液+0.25摩尔蔗糖
解冻程序：
第一解冻液37℃平衡胚胎1min，第二解冻液37℃平衡胚胎5min，基础液37℃平衡胚胎5min。
实施例5
按照实施例1和实施例4中的牛克隆胚胎的冷冻液组成和冷冻以及解冻的方法对牛克隆胚胎进行冷冻、解冻以及胚胎移植，统计受胎率；
按照对比例1中的方法对牛克隆胚胎进行冷冻、解冻以及胚胎移植，统计受胎率。
结果如表1所示。
表1牛克隆胚胎冷冻及移植结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。