冻存液及其在RPE细胞冻存中的应用的制作方法

冻存液及其在rpe细胞冻存中的应用
技术领域
1.本发明涉及细胞技术领域，尤其涉及冻存液及其在视网膜色素上皮细胞(rpe)冻存中的应用。


背景技术：

2.视网膜色素上皮细胞(rpe)，由一层整齐排列的六边形细胞组成，位于神经视网膜和脉络膜之间，其主要功能有吞噬光感受器外节(pos)，向周围感光细胞供给营养，还形成了血管外屏障(brb)，阻止脉络膜血管中的液体进入视网膜，在视觉功能中起着重要作用。包括年龄相关性黄斑变性(age
‑
related macular degeneration,amd)、色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa,rp)等在内的多种视网膜相关疾病都与rpe细胞病变相关，因其不可再生性，造成相关疾病的难以治疗。年龄相关性黄斑病(amd)，又称老年黄斑病，该病的特征是rpe功能失调并最终丧失。rpe细胞是维持视网膜功能的关键细胞类型，损伤后无法再生，其损伤和缺失会继发地引起光感受器细胞耗竭而形成视网膜退行性病变，并最终导致不可逆转的失明。amd在临床上分为干性(萎缩性)amd(即damd)和湿性(渗出性)amd(即wamd)，成因复杂，发病机制尚不完全清楚。针对湿性黄斑病变，常用的治疗方法包括使用抗新生血管药物、光动力疗法和热激光疗法。目前还没有针对干性amd的有效治疗方法。细胞疗法被认为是治疗amd的希望，近年来的研究发现，通过在病损的视网膜部位移植正常的rpe细胞，可延缓、终止甚至逆转视网膜病变，进而防止视力恶化，甚或改善视觉功能。rpe细胞替代治疗已显示出其安全性和其初步有效性，细胞移植治疗被认为是治疗amd有效的治疗手段。
3.将优质的rpe细胞进行冻存，必要时进行复苏后直接制备成注射液使用，是细胞的临床应用必须程序。细胞的冷冻保存是一种通过防止和减少低温损伤来保持细胞结构和功能的技术。目前还不存在一种冻存液及冻存方式适用于所有细胞的冻存。rpe细胞最常见的经典冻存液dmso和fbs的组合，但是因fbs存在的问题例如血源性疾病污染的风险和伦理问题，其并不适合临床用细胞的冻存。实际在进行gmp大规模培养rpe细胞时，同样发现rpe细胞冻存比较困难。如何提高rpe细胞的活率，以及如何提高rpe细胞冻存后的复苏能力，是目前亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供冻存液及其在rpe细胞冻存中的应用。该冻存液能够维持rpe细胞在冻存期间活性。
5.本发明公开了一种冻存液，其由如下体积份的液体组成：
[0006]0‑
10份的dmso溶液、
[0007]
10
‑
30份的人血白蛋白溶液、
[0008]0‑
10份的葡萄糖溶液、
[0009]4‑
8份的羟乙基淀粉溶液、
[0010]
10
‑
30份的复方右旋糖苷40溶液、
[0011]0‑
4份的维生素c溶液和
[0012]
适量其他溶剂；上述所有溶液的总体积份数为100份；其中
[0013]
所述人血白蛋白溶液中人血白蛋白的质量体积百分数为20％；
[0014]
所述葡萄糖溶液中葡萄糖的质量体积百分数为50％；
[0015]
所述羟乙基淀粉溶液中羟乙基淀粉的质量体积百分数为6％；
[0016]
所述复方右旋糖苷40溶液中右旋糖苷40的质量体积百分数为10％；
[0017]
所述维生素c溶液中维生素的质量体积百分数为25％；
[0018]
所述其他溶剂选自生理盐水、培养基、无菌水、无菌缓冲液中的至少一种。
[0019]
本发明公开了一种冻存液，其由如下体积份的液体组成：
[0020]0‑
10份的dmso溶液、
[0021]
10
‑
30份的人血白蛋白注射液、
[0022]0‑
10份的葡萄糖注射液、
[0023]4‑
8份的羟乙基淀粉注射液、
[0024]
10
‑
30份的复方右旋糖苷40注射液、
[0025]0‑
4份的维生素c注射液和
[0026]
适量其他溶剂；上述所有溶液的总体积份数为100份；其中
[0027]
所述dmso溶液中dmso的质量体积百分数大于99.9％，例如基本上是100％；
[0028]
所述人血白蛋白注射液中人血白蛋白的质量体积百分数为20％；
[0029]
所述葡萄糖注射液中葡萄糖的质量体积百分数为50％；
[0030]
所述羟乙基淀粉注射液中羟乙基淀粉的质量体积百分数为6％，优选地，所述羟乙基淀粉注射液含有质量体积百分数为0.463％的醋酸钠、0.602％的氯化钠、0.03％的氯化钾、0.03％的氯化镁；
[0031]
所述复方右旋糖苷40注射液中右旋糖苷40的质量体积百分数为10％，优先地，所述复方右旋糖苷40注射液含有质量体积百分数为0.02％的氯化钙、0.03％的氯化钾、0.6％的氯化钠和0.31％的乳酸钠；
[0032]
所述维生素c注射液中维生素的质量体积百分数为25％，优选所述维生素c注射液含有碳酸氢钠、盐酸半胱氨酸、焦亚硫酸钠和依地酸二钠；
[0033]
所述其他溶剂选自生理盐水、培养基、无菌水、无菌缓冲液中的至少一种。
[0034]
在一个实施方式中，本发明所述的冻存液由如下体积份的液体组成：
[0035]
5份的dmso溶液、
[0036]
20份的人血白蛋白溶液、
[0037]
5份的葡萄糖溶液、
[0038]
6份的羟乙基淀粉溶液、
[0039]
20份的复方右旋糖苷40溶液、
[0040]
2份的维生素c溶液和
[0041]
42份的其他溶剂，所述其他溶剂选自生理盐水、培养基、无菌水、无菌缓冲液中的至少一种。
[0042]
在一个实施方式中，本发明所述的冻存液由如下体积份的液体组成：
[0043]
5份的dmso溶液、
[0044]
20份的人血白蛋白注射液、
[0045]
5份的葡萄糖注射液、
[0046]
6份的羟乙基淀粉注射液、
[0047]
20份的复方右旋糖苷40注射液、
[0048]
2份的维生素c注射液和
[0049]
42份的生理盐水。
[0050]
另一方面，本发明公开了如前所述的冻存液在视网膜色素上皮细胞冻存中的应用。
[0051]
另一方面，本发明公开了一种视网膜色素上皮细胞冻存方法，其特征在于，以前所述的冻存液重悬视网膜色素上皮细胞。
[0052]
本发明所述视网膜色素上皮细胞的密度为6.0
×
106个/ml。
[0053]
另一方面，本发明公开了如前所述的冻存液在制备细胞制剂中的应用。
[0054]
另一方面，本发明公开了一种细胞制剂，其包括：视网膜色素上皮细胞和如前所述的冻存液。在一个具体实施方案中，所述视网膜色素上皮细胞的密度6.0
×
106个/ml。
[0055]
又一方面，本发明公开了如前所述的细胞制剂在制备治疗视网膜相关疾病的药物中的应用。其中，所述视网膜相关疾病选自干性黄斑变性、湿性黄斑变性、色素性视网膜炎。
[0056]
有益效果
[0057]
本发明所采用冻存液可以保持细胞复苏后的活率、贴壁率，对细胞的损伤大大降低，从而在临床应用上更有优势。
附图说明
[0058]
图1示出典型rpe形态。
[0059]
图2示出组分1与其他冻存液冻存效果比较。
[0060]
图3示出冻存液稳定性考察。
[0061]
图4示出中试放大后活率、回收率及贴壁率比较。
[0062]
图5示出吞噬能力流式检测结果图。
具体实施方式
[0063]
本发明提供了冻存液及其在rpe细胞冻存中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0064]
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0065]
二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide；dmso)，常温下为液态，纯度>99.9％。
[0066]
实施例1：冻存液成分比例
[0067]
按照表1中的配方配置冻存液：
[0068]
dmso生产厂家为湖南九典，规格500ml，湘食药辅准字f20090010，批号f25181101。
50％葡萄糖注射液生产厂家为中国大冢制药，规格20ml，国药准字h20043272，批号8k79j2，50％葡萄糖注射液,每20ml含有10g葡萄糖，辅料为注射用水。人血白蛋白注射液生产厂家为广东双林生物，规格50ml，国药准字s10970069，批号20180928，人血白蛋白注射液，规格10g，每50ml含蛋白质10g。羟乙基淀粉130/0.4电解质注射液生产厂家为万衡，规格500ml，国药准字h20130006，批号81mh630，羟乙基淀粉130/0.4电解质注射液，1l溶液含：羟乙基淀粉130/0.4(摩尔取代度0.37
‑
0.45；平均分子量130,000)60g，醋酸钠4.63g，氯化钠6.02g，氯化钾0.30g，氯化镁0.30g。复方右旋糖苷40注射液生产厂家为西安万隆，规格500ml，国药准字h20060418，批号b181114，复方右旋糖苷40注射液，每1ml含右旋糖酐40有100mg，以及氯化钙0.2mg，氯化钾0.3mg，氯化钠6.0mg，乳酸钠3.1mg。维生素c注射液生产厂家为河南润弘，规格2ml，国药准字h20c43104，批号189264，维生素c注射液中还含有碳酸氢钠、盐酸半胱氨酸、焦亚硫酸钠、依地酸二钠、注射用水。氯化钠注射液生产厂家为双鹤药业，规格500ml，国药准字h34023609，批号170217。
[0069]
表1.冻存液成分组成表
[0070][0071]
具体步骤如下：
[0072]
1.p1代细胞的培养：从液氮保存的初代细胞库中取出要复苏的初代细胞，并迅速放入37℃恒温水浴锅中，不断摇晃1
‑
2分钟，使细胞快速融化至有少许冰晶时，冻存管表面用消毒剂消毒后，在超净工作台内打开盖子，用移液枪迅速将融化的细胞转至已加大于等于9倍细胞冻存液体积的培养基中，以700g，离心5分钟。弃上清，加rpe完全培养基重悬细胞，接种至cell start包被液包被的培养瓶，每个培养瓶足量补加rpe完全培养基，将培养瓶置于37.0℃，5.0％co2培养箱中培养。吸弃上清，添加新鲜的rpe完全培养基，置于37.0℃、5.0％的co2培养箱培养。每三天换液一次。
[0073]
2.p1代细胞传代培养
[0074]
将所要传代细胞的培养瓶置于超净工作台中尽弃培养上清，消化细胞，取50μl进行台盼蓝染色法计数。根据细胞计数结果加入适量rpe完全培养基充分重悬，接种至cell start包被液包被的培养瓶中，补加rpe完全培养基，置于37.0℃，5.0％co2条件下培养。
[0075]
3.p2代细胞培养
[0076]
p1代细胞传代后，每三天换液一次。吸弃上清，添加新鲜的rpe完全培养基，置于37.0℃、5.0％的co2培养箱培养。待细胞长成典型形态(如图1所示)后对细胞消化冻存。
[0077]
4.p2代细胞冻存
[0078]
从co2培养箱中取出培养瓶，消毒剂表面消毒后放入生物安全柜(或超净工作台)中，弃去培养瓶内培养上清，消化细胞，取50μl细胞悬液适当稀释，台盼蓝染色法计数。计数完成后，将细胞悬液以700g，离心5分钟，尽弃上清，根据计数结果加入适量冻存液充分重悬细胞，调整细胞密度达到6.0
×
106/ml，按照1.5
×
106/支均匀分装至已贴标签的2ml冻存管中即规格为(150万细胞)/支，置于程序性降温仪按设定的程序冻存细胞，冻存程序为：第一步：wait 4℃，第二步：1℃/分钟降至
‑
6℃，第三步，25℃/分钟降至
‑
40℃，第四步，10℃/分钟升至
‑
12℃，第五步，1℃/分钟降至
‑
40℃，第六步，10℃/分钟降至
‑
80℃，第七步，结束。转入液氮气相保存。
[0079]
细胞冻存数天后，取冻存的细胞复苏后进行活率，回收率以及细胞贴壁率的检测。
[0080]
实验结果总结见下表2。结果表明，表中配置的一系列冻存液冻存效果均能得到较好的冻存效果，综合考虑贴壁率、回收率和细胞活率3个指标，其中组分1为较优的成分组合。
[0081]
表2.不同冻存液冻存效果比较
[0082][0083][0084]
实施例2：两个月稳定性考察
[0085]
使用优选的组分1和公司原有冻存液hpl+dmso以及两种商品化的冻存液(sfm和cs10)比较。从冻存复苏后rpe细胞的活率，回收率和贴壁率作为冻效果的评价指标。其中sfm为文献中明确提及的用于rpe细胞冻存的冻存液，cs10是gmp级别的无血清无动物成分细胞冻存液。稳定性考察：在液氮气相保存2个月之后再次复苏，冻存液组分1，和公司原有冻存液hpl+dmso再次进行比较。实验结果如图2
‑
3所示。
[0086]
冻存液比较及两个月稳定性考察的结果：发现组分1适合视网膜色素上皮细胞的冻存且效果优于原有冻存液和两种商品化的冻存液。和公司原有冻存液比稳定性好，且成分简单。
[0087]
实施例3：冻存液成分优化及中规模试验(中试)
[0088]
冻存液成分探究都是从实验室少量研发开始的，其特点能提高效率、降低成本和简化操作，中试放大是研发到生产的必经之路。为了验证研发少量的试验是否能在生产过
程中放大使用，按照表3配置了3种冻存液，加上公司原来使用的hpl+dmso冻存液，总共4种冻存液，模拟了中试生产，对两批rpe细胞进行了冻存。冻存复苏后除了考察复苏活率、贴壁率和回收率之外，还检测了rpe细胞功能性相关的标志物。包括吞噬能力、pedf分泌、标志物分子检测。rpe主要功能有吞噬光感受器外节(pos)，所以吞噬能力是其一个重要指标，best1是典型的rpe细胞标志性蛋白，rpe65、mitf以及mertk也常被用作为rpe细胞标志物。分泌pedf是rpe细胞重要的功能。
[0089]
表3：几种冻存液成分组成表
[0090][0091]
实验结果如下表4
‑
6和图4
‑
5所示：
[0092]
表4.吞噬能力结果判定
[0093][0094]
表5.pedf分泌检测
[0095]
[0096][0097]
表6.分子标志物检测(对照细胞为成纤维细胞)
[0098][0099]
复苏后，综合回收率、活率和贴壁率三项指标分析，冻存液组分1、6、11能得到较优的结果。吞噬能力检测显示，冻存复苏后的rpe细胞都有吞噬能力，rpe细胞的阳性标志物rpe65等也都表达，表明冻存对细胞的特性无影响。且该冻存液从小试放大到中试阶段后同样适用于rpe细胞的冻存。
[0100]
通过引用并入
[0101]
本文引用的每个专利文献和科学文献的全部公开内容通过引用并入本文用于所有目的。
[0102]
等效
[0103]
本发明可以在不脱离其基本特征的情况下以其他具体形式实施。因此，前述实施例被认为是说明性的，而不是对本文所述的本发明的限制。本发明的范围由所附权利要求书而不是由前述说明书表示，并且意在将落入权利要求书的等同物的含义和范围内的所有改变包括在其中。